Name: 생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 배우세요 생체 외에서 교정 무료 형광 변동 분광법을 사용하여 단백질 호모-올리고머화를 정량화하는 방법을. 이 기술은 약물 선별 및 단백질 상호작용 연구에 활용됩니다.

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1. FKBP12 F36V-mVenus 정화
<ol><li>Monomerized 인간 FKBP12F36V12 및 N 맨끝 His6 태그와 mVenus 태그 (요청에 사용할 수 있는 벡터)를 포함 하는 pET22b 벡터와 (DE3) pLysS 셀을 변환 합니다. 파운드 천 50 µ g/mL 암 피 실린과 34 µ g/mL 페니와 보완에 플레이트 세포.</li>
	<li>100 mL 파운드 스타터 문화로 변환 된 식민지를 전송 하 고 떨고와 37 ℃에서 16 ~ 20 시간에 대 한 성장.</li>
	<li>고밀도 스타터 문화를 희석 (OD600 > 1) 1: 100 파운드 매체 (2 x 500 mL 배치)에 OD600를 2-3 시간 동안 성장 = 0.6-0.8 (37 ° C, 200 rpm).</li>
	<li>얼음에 멋진 문화입니다. 250 µ M IPTG 유발 하 고 21 ° C, 200 rpm에서 16-20 시간에 대 한 성장.</li>
	<li>20 분 동안 2000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확.</li>
	<li>아이맥 버퍼 (20 m m 인산 나트륨 pH 7.5, 500 m m NaCl, 이미 3 m m, 1mm β-mercaptoethanol) 보충 EDTA 무료 protease 억제제 (1 태블릿 셀 펠 릿 당) 40 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>셀 sonicate (500w, 20 kHz, 40% 진폭, 9 초, 11 15 분 떨어져 s) 20000 x g에서 원심 분리 하 여 수확과 얼음 녹는 물자에.</li>
	<li>전송 성 lysate 원뿔 플라스 크를 고 수 지의 2 개 mL를 추가 ( 재료의 표참조). 105 rpm 회전 1 시간 동안 품 어 참고: 니켈 sepharose 또한이 아이맥 단계에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>수 지를 수확 하 고 아이맥 버퍼는 (20 m m 인산 나트륨 pH 7.5, 500 mM NaCl, 7mm 이미, 1 m m β-mercaptoethanol) 아이맥 버퍼 B의 500 mL의 250 mL로 씻어. 참고: 50mm 이미 경우 니켈 sepharose 수 지를 사용 하 여 늘립니다.</li>
	<li>아이맥 버퍼 C (20 m m 인산 나트륨 pH 7.5, 500 mM NaCl, 이미 300 m m, 1mm β-mercaptoethanol)를 사용 하 여 His6 태그가 단백질 elute</li>
	<li>크기 배제에 주사 열 10 mM HEPES pH 7.5, 150 m m NaCl, 1 mM DTT에에서 equilibrated ( 재료의 표참조). FKBP12F36V의 피크 차입을 87.71 mL 우리가 사용 하는 열에 있다.</li>
	<li>SDS 페이지 및 수영장을 통해 순도 평가 하 고 필요에 따라 집중.</li>
</ol>2입니다. Multiwell 격판덮개 배열 준비
<ol><li>순화 FKBP12F36V를 녹여 (또는 관심사의 단백질 표시)-80 ° c.에서</li>
	<li>100의 솔루션을 준비 nM 정화 FKBP12F36V (중간, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 m m NaCl, 1 mM DTT). Sonicate 고 집계의 형성을 방지 (13000 rpm의 빠른 회전)을 원심.</li>
	<li>100-200 µ L 유리 바닥 8 잘 관찰 챔버로 플라스틱.</li>
	<li>10, 20, 40, 80, 100, 150, 300, 및 500 nM12,13의 최종 농도에 BB dimerizer를 추가 합니다.</li>
	<li>참고로, 100의 솔루션 준비 혼자 잠재적인 집계 및 강 수 효과 평가 하 고 동일한 수집 설정으로는 단량체에 대 한 밝기 값을 복구 하는 mVenus의 nM.</li>
</ol>3. 교정 무료 Confocal 수집
<ol><li>공초점 레이저 시스템 (그림 1)를 시작 합니다. 어떤 가벼운 현미경 confocal 시스템 스캔 디지털 감지기 또는 잘 특징이 아날로그 감지기8있고 유지의 지속적인 유지 시간 획득 하는 모든 픽셀을 작동 합니다.</li>
	<li>여기 빔 경로 설정:<ol>
<li>514 nm 레이저 및 세트 그것 20-100 베스트 팔 렌 (FKBP12F36V-mVenus)에 대 한 목표의 출구에 전원을 켭니다.</li>
		<li>63X1.4NA 목표 또는 FCS를 위한 칼라 보정 물 침수 목표를 선택 합니다.</li>
		<li>한 유압, APD 또는 보정된 PMT 검출기를 켭니다. 검출기의 광자를 세는 바람직 하 고,이 경우, 계산의 S, 오프셋 및 σ02 는 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>520-560 nm에서 방출 창 선택</li>
		<li>1 공기 단위 해당 방출 ~ 545 nm에서 pinhole을 설정 합니다.</li>
		<li>16 x 16 픽셀에 수집 모드를 설정</li>
		<li>설정 된 픽셀 면만 시간 t연연 같은 t프레임 만족 >> TD >> t연연, 여기서 D 는 확산 단백질과 t의 체류 시간 프레임 은 프레임 속도. 이 ~ 13 µs 유지 시간 설정에 대응 했다. 참고: 일부 상용 제조업체 스캐너 픽셀 당 유지 시간 상수 유지 하지 했다 했다. 이 불변성은 작동 방법에 대 한 중요 합니다.</li>
		<li>~ 120에서 픽셀 크기를 설정 nm.</li>
		<li>Xyt 수집 모드를 선택 하 고 수집 및 잘 (예: 5000) 당 획득 프레임 수를 선택 합니다.</li>
		<li>경우 시스템은 높은 처리량 모드, 프로세스를 자동화 하 각 잘하고 잘 당 인수 수의 좌표를 소개 합니다. 참고: 집중 목표를 사용 하는 경우는 물 디스펜서의 존재를 보장 하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
		<li>시스템 설치 되어 있는 경우 관류 시스템 BB 솔루션을 로드 하 고 프로그램 오른쪽 후 시작을 관류의 예를 들어, 10000 이미지를 획득 하는 동안 이합체 화 활동 평가를 5000번째 프레임.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기름 침수 목표에 오일 한 방울을 추가/물 FCS를 위한 칼라 보정 물 침수 목표를 활용 하는 경우.</li>
	<li>단계에 8 잘 관찰 챔버를 탑재 합니다.</li>
	<li>정확한 음을 선택 하 고 솔루션에 초점. 참고: 중요 한: 반사와 분산을 피하기 위해 하단 유리 가까이 초점을 방지. 솔루션으로 깊은 초점, 자동된 포커스 옵션을 분리 합니다.</li>
	<li>인수를 시작 하 고 이미지의 결과 스택 TIFF 형식으로 저장.</li>
</ol>4. detrend 및 R 패키지 nandb를 사용 하 여 밝기 분석
<ol><li>그림 2는에서 같이 전처리 품질 검사로 서 이미지를 보고 고 강도 프로필 복구 ImageJ14 를 사용 합니다. 너무 많은 photobleaching 발생 여부 확인에 유용 합니다. 너무 많이 표백 경우 데이터 추가 분석을 위해 부적 하다. 참고: ImageJ 상업 형식에서 tiff 이미지를 변환 하는 데 유용 수도 있습니다. 아래 설명 하는 nandb 소프트웨어 TIFF 파일에만 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>다운로드 및 설치 R 및 RStudio15,16. 그것은 다운로드 하 고 설치 R 최고의 첫 번째, 다음 RStudio. 참고: 다음은 nandb R 패키지를 사용 하는 방법의 설명입니다. 그러나 R 언어의 기술 그것은 인생을 쉽게 만들 것입니다 nandb를 사용 하 여 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>Nandb 패키지를 설치 합니다.<ol>
<li>RStudio 및 콘솔에서 install.packages("nandb")를 입력 열고 설치를 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nandb를 알게<ol>
<li>수동17검토 합니다.</li>
		<li>다양 한 기능에 대 한 내장 된 RStudio 도움말을 검토 합니다. 가장 가능성이 기능을 사용할 수 있을 것입니다 사용 하 여 brightness() 될 것입니다. 입력 하 여이 기능에 대 한 도움말 파일을 보려면? 콘솔에서 brightness()입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>밝기를 계산<ol>
<li>하나는 img001.tif (참고만 TIFF 파일 작동 하는 그 'nandb') 라는 바탕 화면에 있는 이미지 파일을 말한다. 하나는 그 이미지의 밝기를 계산할 수 있습니다. b <-밝기 ("~/Desktop/img001.tif", 타우 = "자동")<ol>
<li>이 r에서 변수 b에는 이미지의 밝기를 할당 타우 = "자동" 보장 이미지 밝기 계산 하기 전에 detrended 올바르게. 여기에서 할 수 있는 가장 일반적인 일 평균 또는 이미지의 평균 명도 계산 하는 것입니다. 하나는 mean(b) 또는 median(b)를 입력 하 여 이것을 할 수 있다. 또한 바탕 화면 사용 하 여 밝기 이미지를 작성할 수 있습니다. ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")</li>
		</ol>
</li>
		<li>하나는 바탕 화면에 이미지 images_folder의 전체 폴더 하나 이러한 이미지의 brightnesses를 계산 하 고 밝기 이미지를 TIFF 파일로 쓸 필요가 말한다. 다음 참조? brightness_folder(). 이 함수는 한 번에 전체 폴더 처리: brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", 타우 = "자동") 이것은 특히 좋은 소프트웨어를 연구 하는 것을 선호 하는 사람들을 위해, 모든 파일 하나 하나의 명령, 처리 되 고 하나 갈 일 수 그들의 선택한 소프트웨어에 출력 밝기 TIFF 이미지, 때문에 그것 ImageJ14 Python 또는 뭔가 다른.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pair+forster+resonance+energy+transfer%3A+A+versatile+tool+to+investigate+protein+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics.</a> BioEssays. 40, (2018).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
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<li>Amara, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+dimerizer+for+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).</li>
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<li>Rollins, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligand-reversible+dimerization+system+for+controlling+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).</li>
<li>R: A Language and Environment for Statistical Computing. <a target="_blank" href="NULL">R Core</a>. , (2017).</li>
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<li>Nolan, R. nandb R package. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=nandb">https://CRAN.R-project.org/package=nandb</a> (2017).</li>
<li>Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysics+of+green+fluorescent+protein%3A+influence+of+the+key+amino+acids+at+positions+65%2C+203%2C+and+222%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222.</a> Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Butkevich, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+fluorescent+dyes+for+live-cell+labeling%3A+synthesis%2C+spectra+and+super-resolution+STED%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%3A+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED.</a> Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

N & B multimerization 상업적인 빛 디지털 검출기를 장착 하는 confocal 현미경 검사를 사용 하 여 감지 하는 기술입니다. 이 방법은 단일 지점 FCS, FCCS, 및 smFRET 교정 무료 이며 밝기 계산 하기 때문에 간단 하 고 농도 독립6에 비해 매우 매력적 이다. 그러나 그것은 중요 한 중요성의, 밝기 계산9;를 수행 하기 전에 표백 및 장기 강도 변동에 대 한 수정 표백에 따른 휘도 및 기타 아티팩트에의 약간의 증가 수 수 잘못 해석 oligomeric 상태에서 변화 (같이 그림 2는) 무시 트렌딩 또는 잘못 수행 하는 경우. 자동 사용 detrend 알고리즘 정확한 밝기 계산에 대 한 수 있습니다.
그것은, 이미지를 수집 하는 때 규칙의 수를 따르는 것이 중요입니다. 첫째, con...

단백질-단백질 상호 작용 나 n 체 외
전통적으로, 결정학 및 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryoEM)와 결합 하는 핵 자기 공명 실험은 정확 하 게 단백질의 3 차원 구조를 설명 하 고 그들의 기능을 추정 하는 것을 선택 하는 기술 그들의 높은 해상도 구조 세부 사항을 면밀히 그러나 단백질,, 정적 구조 하 시간과 공간에 다양 한 구조적 변화와 진동 받을 수 있습니다. 이 때문에 구조 결정학에서 정보 또는 CryoEM 데이터 (예: 분자 동역학 시뮬레이션 기술과 단일 분자) 다른 기술로 보완 될 필요가: 그 구조적 관련 단백질의 기능 변경 및 상호 작용, 그리고이 정보는 정적 구조에 존재. 내부 분자 역학 조사, 순서 기술 포스터 공명 에너지 전송 (smFRET) 단일 분자에 따라 매우 효과적인1있습니다. 이러한 방식을 복잡 한 매체에 있는 분자의 다른 부분 모집단을 평가할 수 있습니다. 이것은 매우 중요 하 고, 이러한 변경 신속 하 고 (즉, 두 번째 범위에 나노초) 데이터 수집 중에 발생.
두 가지 주요 방법을 감지 하 고 이러한 변화를 정량화 일반적으로 채택 된다: 솔루션 및 표면 immobilization 단백질. 감지 간의 분자 상호 작용의와 특히, 이합체 화, ligands에 의해 유도 된 과정에 대 한 smFRET은 항상는 최고의 도구가 아니다. 사실, 무서 워 거리 (≈10 nm)에 뿐만 아니라 두 개의 쌍 극 자 (기증자 및 수락자, χ2)의 방향에 따라 그리고 수락자의 흡수 스펙트럼2, 하지만 아마도이 마지막 조건 기증자 방출의 오버랩은 중요 한 하는 experimentalist 수 오른쪽 무서 워 몇 선택. 호모-이합체 화를 프로 빙에 대 한 smFRET의 특정 단점 관심사의 단백질의 라벨에서 온다: hetero smFRET, 이합체 화만 될 수 있습니다 감지 최대 50% (즉, hetero 무서 워만 기증자 수락자를 감지할 수 있을 것입니다 및 기증자 수락자 호모-이합체 하지 기증자 기증자 또는 수락자-수락자, 다른 50%는 이합체의). 형광 상관 분광학 (FCS) 및 파생 상품 (FCCS, 등3) 확인 단백질 보급 상수 및 바인딩 상수에서 생체 외에서 의 사용은 또 다른 대안 이다. 이러한 방식을 완전히 중 호모-이합체 화를 계량 수, 확산 입자의 FCS 한 측정 농도 확산, 반지름 및 확산 계수가 매우 저조한; 분자량에 의존 예를 들어 10 증가 분자량에만 확산 계수4에서 2.15 배 변화를 나타내며. 2 컬러 FCS 또는 FCCS, 호모 이합체의 50%만 위와 같은 이유로 볼 것입니다. 호모-이합체 화에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 감지 하는 가장 실용적이 고 양적 접근은 호모 무서 워5 와 수와 명도 (N &amp; B)6. 그 사실을 감안할 때 호모 무서 워 필요 이방성 값 (즉, 광학 요소/분석기 병렬 및 수직 분극 복구)의 특정 계측 복구, N &amp; B 제공 됩니다 여기에 유리한 기술로 단백질 호모-이합체 화 및 집계 검색 합니다. 그것은 될 수 있다 생체 외에서 그리고 vivo에서 상업 설정 고용.
수와 밝기
N &amp; B 최근 검토7되었습니다. 그 리뷰는 라이브 셀에서 기술의 응용 프로그램에 집중 했다. 그것은 가치가 재현이이 방정식으로 수학적 주의 여기 데이터에 적용 될 것입니다 수집 에 체 외. 첫째, 그것은 몇 가지 용어 및 수학 수량을 정의 하는 데 필요한:
<ul><li>엔터티가 바인딩되는 함께 분자의 집합입니다.</li>
	<li>엔터티 밝기 ε (프레임) 당 단위 시간 당 방출 하는 광자의 수입니다.</li>
	<li>
n 은 현재 엔터티 수입니다.</li>
	<li>이미지 시리즈의 과정을 통해 주어진된 픽셀, &lt; 나 &gt; 의 의미와 σ2 은 그것의 강도에 대 한 분산입니다.</li>
</ul>다음,와 광자 계산 탐지기 모바일 엔터티 및 아무 배경 가정
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq2.jpg">
여기서 N 은 명백한 수 와 B 명백한 밝기입니다. 이 인해
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq4.jpg">
Dalal 외. 8 아날로그 장비와 함께 하나의 3 개의 교정 기간 요구 했다: S 요소, 배경 오프셋및 판독 잡음 σ02. 다음, 다시 모바일 엔터티, 가정
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq6.jpg">
주는
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq8.jpg">
위의 방정식은 다른 Dalal 외 에 주어진 8 그리고 후속 검토입니다. 7 에 Dalal 외. S 분모에 오타 때문에 생략 되었다 그리고이 오류는 검토에서 재현 됐다. 위의 방정식 올바른 것 이다입니다. 지침 S측정, 오프셋 및 σ02 -그들의 의미-에 대 한 설명 Dalal 외 에 의해 주어진 다 8
밝기 ε 이다 oligomeric 확산 엔터티 상태에 비례: ε 그것은 단위체, 세 번 큰 trimers를 위한 trimers 등은 단위체, hexamers에 대 한 큰 두 번은 이합체에 대 한 큰 두 번 있을 것입니다. 이 방법에서는, 밝기 ε를 측정 하나 multimerization의 모든 종류를 계량 수 있습니다.
만약 oligomeric 국가의 혼합물, 수 있으며 밝기는 현재 개별 oligomeric 상태 복구의 수 있습니다. 이 기술의 한계입니다.
알고리즘 및 nandb 소프트웨어 detrend
Photobleaching는을 위한 교정의 중요성은 이전9를강조 했다. Photobleaching은 필연적으로 시간 경과 모드;에 가벼운 현미경 실험 중 발생 둘 다 라이브 세포에 생체 외에서. 많은 접근7표백에 대 한 올바른 문학에서 설명 했습니다. 트렌딩 매개 변수 T 의 자동 선택과 지 수 필터링 기술은 현재 최고입니다. 그것은 무료, 오픈 소스 소프트웨어 nandb9에 통합 된다. 실제로, 그들의 detrending 매개 변수를 수동으로 선택 하는 사용자를 필요로 하는 소프트웨어 임의적이 고 잘못 된 매개 변수 선택이 될 가능성이 있기 때문에 잘못 된 결과가 발생할 수 있습니다. 자동 알고리즘 데이터를 검사 하 고 사용자 개입9에 대 한 필요 없이, 그것에 대 한 적절 한 매개 변수를 결정 합니다. 부드럽게 매개 변수의 최선의 선택으로도 트렌딩는 한계가 하며 잘만 photobleaching 비율 25% 보다 낮은 시뮬레이션9와 같이 작동 합니다. 흥미롭게도, 자동 detrending 루틴을 사용 하 여, 그것의 정확도 하나 낮은 밝기 값을 사용할 수 있습니다 (심지어 B &lt; 1.01), 따라서 낮은 농도, 그리고 아직 충분히 정확 하 게 계량 호모-이합체 화.
Photobleaching는 또한 또 다른 문제를 일으키는: multimer 복잡 한에 photobleached fluorophores의 존재. 이것은 예를 들어, 경우는 삼합체에 3 단위 중 하나 비 형광은 삼합체는 이합체 처럼 나타납니다. 허 고 뮬러10 이 해결 하는 방법 그리고이 수정 또한 후속 검토7에서 강조 되었다. Nandb 소프트웨어는이 보정9포함 되어 있습니다.
FKBP12 F36V 시스템
FKBP12F36V는 자연스럽 게 oligomerize 하지 않습니다 하지만 AP20187 약물 (구어체로 dimerizing ligand BB 라고도 함)11,12의 추가 따라 dimerize 알려져 있는 단백질 이다. 이것은 번호와 밝기에 대 한 이상적인 테스트 케이스: 이라는 FKBP12F36V와 oligomeric 상태의 두 배로 관찰 해야 BB의 추가에.

<table><tbody><tr><td>RosettaTM (DE3) pLysS 세포</td><td>Novagen</td><td>70956-3</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>PubChem 물질 ID 329824407</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>시그마 Aldrich</td><td>PubChem 물질 ID: 24892250</td><td></td></tr><tr><td>LB 스타터 배양</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 매체</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif IPTG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem 물질 ID 329815691</td><td></td></tr><tr><td>IMAC 버퍼</td><td>Medicago</td><td>09-1010-10</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-free 프로테아제 억제제&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON 수지</td><td>클론테크</td><td></td><td></td></tr><tr><td>니켈 세파로스</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 16/60 열</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 8웰 관찰 접시</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

수와 밝기 감지 단백질 호모-oligomerization에 대 한 교정 무료 형광 변동 분광학 (FFS) 기술입니다. 그것은 전통적인 confocal 현미경 디지털 감지기 장비를 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 생체 외에서 기술 사용에 대 한 프로토콜 번호와 밝기를 dimerizing 약 AP20187의 추가 전후 mVenus 표시 FKBP12F36V의 oligomeric 상태를 정확 하 게 계량을 볼 수 있는 사용 사례에 의해 표시 됩니다. 정확한 현미경 수집 매개 변수를 사용 하 여 올바른 데이터 전처리 및 분석 방법의 중요성을 설명 합니다. 특히, photobleaching의 선택의 중요성은 강조 했다. 이 저렴 한 방법은 많은 생물학 문맥에서 단백질 단백질 상호 작용 연구에 사용할 수 있습니다.

트렌딩 및 단위체 밝기
데이터 획득 되 면 하나의 솔루션에 관심사의 단백질의 oligomeric 상태를 확인 하려면 밝기 계산을 시작할 수 있습니다. 솔루션에서 표백의 효과 과감 한 되지 않을 수도 있습니다 경우에 그것으로 비보에있을 수 있습니다, 그리고 강도 추적 여전히 아마 없을 것 photophysical 효과 fluorophore,18 하지만이 뒤에 이유를 관련으로 인해 고정 된 의미 완전히 이해 되지 않는다. 이 영향; 밝기를 계산할 때 모노 머-이합체 전환 결정 하려고,이 측면은 중요 합니다. 자동 적용 하 여 알고리즘에 그림 2표시 된 데이터를 detrend, 강도 추적 제대로 해...

이 프로토콜 단백질 호모-oligomerization에서 체 외에 상업 조명 현미경 검사를 사용 하 여 형광 변동 분광학에 따라 측정을 위한 보정 없는 접근을 설명 합니다. 올바른 인수 설정 및 분석 방법을 표시 됩니다.

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

이 방법은 단백질-단백질 상호 작용에 대한 매우 낮은 농도에서 저분자 억제제의 효과를 밝히는 것과 같은 약물 스크리닝 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 보정이 필요 없고, 모든 컨포칼 현미경에서 구현할 수 있으며, 매우 적은 양의 표지된 단백질을 활용한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 단백질-단백질 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공하기 때문에 암 치료제, 소분자 억제제 및 다양한 융합 억제제의 개발로 확장됩니다.이 방법은 in vitro에서 단백질 상호 작용 및 응집에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 라이브 셀 단백질 역학 및 세포-세포 상호 작용과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 단량체화된 human FKBP12 및 N-terminal His6 및 mVenus 태그를 포함하는 pET-22b 벡터로 pLysS 세포를 형질전환하십시오. 세포를 배양하고 열 충격을 가한 후 회복한 후 항생제를 보충한 LB 한천에 플레이트합니다.변형된 콜로니를 100ml LB 스타터 배양으로 옮기고 흔들면서 섭씨 37도에서 16-20시간 동안 성장합니다. 배양 후, 조밀한 스타터 배양액을 LB 배지에서 1에서 100까지 두 개의 500ml 배치로 희석합니다. 그런 다음 2-3시간 동안 600나노미터의 광학 밀도로 0.6-0.8로 성장합니다.얼음에서 배양물을 냉각시킨 후 250마이크로몰 IPTG로 단백질 생성을 유도합니다. 섭씨 21도 및 200rpm에서 16-20시간 동안 배양물을 성장시킵니다. 그런 다음 2, 20분 동안 000g에서 원심분리로 세포를 수확합니다.상층액을 제거하고 EDTA-free 프로테아제 억제제가 보충된 40ml의 IMAC 완충액 A에 펠릿을 재현탁합니다. 이제 500와트, 20킬로헤르츠, 40% 진폭으로 9초 동안 켜고 11초 동안 얼음 위에서 15분 동안 셀을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 다음, 20, 섭씨 4도에서 한 시간 동안 000g에서 원심 분리로 용해성 물질을 수확합니다.용해성 용해물을 원뿔형 플라스크에 옮기고 2ml의 TALON 수지를 첨가합니다. 현탁액이 105rpm 회전으로 1시간 동안 배양되도록 합니다. 이제 수지를 수확하고 250ml의 IMAC 완충액 A와 500ml의 IMAC 완충액 B.IMAC 완충액 C를 사용하여 His6 태그 단백질을 용리합니다.사전 평형 크기 배제 컬럼에 용출액을 주입하고 약 87.7ml에서 용리되는 FKBP12 피크를 수집합니다.SDS-PAGE를 통해 단백질의 순도를 평가하고 필요에 따라 풀링하고 농축합니다. 멀티웰 플레이트 어레이를 설정하려면 먼저 크기 배제 크로마토그래피에 사용되는 것과 동일한 완충액에 100나노몰 정제 FKBP12 용액을 준비합니다. 13, 000 rpm의 빠른 회전을 가진 초음파 처리 그리고 분리기는 응집체의 대형을 방지하기 위하여 작동시킵니다.이제 100-200마이크로리터의 희석된 단백질을 바닥이 유리로 된 8웰 관찰 챔버에 피펫팅합니다. BB 이량체를 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 및 500 나노몰의 최종 농도에 추가합니다. 참고로, 100나노몰 mVenus 단독 용액을 준비하여 잠재적인 응집 및 침전 효과를 평가하고 동일한 획득 설정으로 단량체에 대한 밝기 값을 복구합니다.디지털 검출기 또는 잘 특성화된 아날로그 검출기가 장착되어 있고 획득된 모든 픽셀에 대해 일정한 체류 시간을 유지할 수 있는 모든 광학 스캐닝 현미경 컨포칼 시스템을 사용할 수 있습니다. 형광 상관 분광법(fluorescence correlation spectroscopy)을 위해 설계된 collar correction water immersion objective를 선택합니다. 이제 칼라 보정 침수 대물렌즈에 물 한 방울을 추가합니다.8개의 우물 관측 챔버를 무대에 장착합니다. 514나노미터 레이저를 켜고 대물렌즈 출구에서 20-100나노와트 전력으로 설정하여 여기 빔 경로를 설정합니다. 하나의 HyD 감지기를 켭니다.광자 계수가 가능한 검출기가 바람직합니다. 520에서 560나노미터 사이의 방출 창을 선택합니다. 획득 모드의 경우 16 x 16 픽셀을 사용합니다.프레임 시간이 단백질 확산보다 길고 픽셀 드웰 시간이 훨씬 짧도록 픽셀 드웰 시간을 설정합니다. 이는 이 데모에 사용된 시스템의 체류 시간을 약 13마이크로초로 설정하는 것과 일치합니다. 약 545나노미터의 해당 방출에 대해 하나의 Airy 단위로 핀홀을 설정합니다.xy 시간 획득 모드를 선택하고 획득 및 웰당 획득할 프레임 수를 선택합니다. 이제 픽셀 크기를 약 120나노미터로 설정합니다. 시스템에 고처리량 모드가 장착되어 있는 경우 각 유정의 좌표와 유정당 수집 수를 도입하여 프로세스를 자동화합니다.체계에 관류 체계로 갖춰진 경우에, BB 해결책을 적재하고 10, 000의 심상을 취득하고 있는 동안 이합체화의 동역학을 평가하기 위하여 5, 000번째 구조 직후에 시작하도록 관류를 프로그램하십시오. 올바른 웰을 선택하고 솔루션에 집중합니다. 그런 다음 획득을 시작하고 결과 이미지 스택을 TIFF 형식으로 저장합니다.20의 순서는, 100 나노미터 해결책에 있는 순화된 FKBP12 mVenus의 심상 프로토콜 단면도에서 지정되는 것과 같이 취득되었다. 첫 번째 프레임의 intensity는 디트렌딩된 이미지의 mean intensity profile과 함께 표시됩니다. 부드러운 필터링이 없는 밝기와 부드러운 필터링이 있는 밝기도 표시됩니다.10, 000 프레임을 획득한 후, 획득하는 동안 동형이머라이저 약물 BB를 용액에 첨가했습니다. 5, 000 프레임의 각 연속 시리즈를 분석했습니다. BB 첨가 5분 후 평균 밝기는 1.010으로 2배 증가하여 FKBP12 이량체를 나타냅니다.이 과정의 동역학은 BB 추가와 전체 FKBP12 이합체화 사이에 약 2분의 지연을 보여줍니다. in vitro에서 단백질-단백질 상호 작용을 평가하기 위한 핵심 측면은 라벨링된 단백질의 생산 및 정제입니다. 라벨링된 관심 단백질이 소량 있고 단백질이 분석에 따라 응집되지 않는지 확인하십시오.이 절차에 따라 표면 플라즈몬 공명 또는 형광 상관 분광법과 같은 다른 방법을 수행하여 해리 상수 또는 확산 계수와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생물물리학 분야의 연구자들이 살아있는 세포에서 단백질-단백질 상호 작용을 자세히 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 단백질 정제를 위한 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경, 장갑과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Biochemistry

생화학

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 채용함으로써, 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 효율성의 픽셀 수준의지도 게이 oligomeric 단지를 형성하기 위해 가상 막 수용체를 표현하는 세포를 얻을 수있다. 효율성의지도 걱정부터, 우리는 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 정보를 추정 할 수 있습니다.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

이 비디오는 단백질 호모올리고머화를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(FFS) 기술을 보여줍니다. 샘플의 형광 표지된 단백질은 FFS를 사용하여 단백질 올리고머화를 연구할 때 에이전트를 사용하여 이합체화됩니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 단백질이 작은 관찰 부피 안팎으로 이동할 때 단백질의 올리고머 상태를 결정하기 위해 형광 분자의 밝기 변동 분석을 수행합니다.

단백질 호모올리고머화(Homo-Oligomerization)를 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

여기에서는 인간 세포에서 내인성 및 외인성 centromere-kinetochore 단백질을 검출하고 고정(파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올 고정)을 통한 간접 면역형광 염색을 통해 centromeres-kinetochores에서 이러한 단백질 수준을 정량화하는 프로토콜을 보고합니다.

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셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

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총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

CENP-A 유비쿼터스는 세포 분열 사이의 분화를 통해 계승되고 세포 생존가능성에 필수적입니다. 여기서 우리는 EYFP 태그CENP-A (EYFP-CENP-A) 단백질의 유비쿼터션을 확인하기 위해 질량 분광분석 분석을 설명합니다.

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여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.  본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

이 프로토콜은 질량 측광법과 새로운 미세유체역학 시스템을 결합하여 저친화성 단백질-단백질 상호 작용을 조사합니다. 이 접근법은 용액에서 고도로 농축된 복합체의 빠른 희석을 기반으로 하며, 이를 통해 저친화성 측정이 가능하고 질량 측광법의 적용 가능성이 넓어집니다.

Microfluidics와 질량 광도계를 결합하여 Micromolar 농도에서 단백질 복합체 형성 분석

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