생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

이 프로토콜 단백질 호모-oligomerization에서 체 외에 상업 조명 현미경 검사를 사용 하 여 형광 변동 분광학에 따라 측정을 위한 보정 없는 접근을 설명 합니다. 올바른 인수 설정 및 분석 방법을 표시 됩니다.

이 방법은 단백질-단백질 상호 작용에 대한 매우 낮은 농도에서 저분자 억제제의 효과를 밝히는 것과 같은 약물 스크리닝 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 보정이 필요 없고, 모든 컨포칼 현미경에서 구현할 수 있으며, 매우 적은 양의 표지된 단백질을 활용한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 단백질-단백질 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공하기 때문에 암 치료제, 소분자 억제제 및 다양한 융합 억제제의 개발로 확장됩니다.

이 방법은 in vitro에서 단백질 상호 작용 및 응집에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 라이브 셀 단백질 역학 및 세포-세포 상호 작용과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 먼저 단량체화된 human FKBP12 및 N-terminal His6 및 mVenus 태그를 포함하는 pET-22b 벡터로 pLysS 세포를 형질전환하십시오. 세포를 배양하고 열 충격을 가한 후 회복한 후 항생제를 보충한 LB 한천에 플레이트합니다.

변형된 콜로니를 100ml LB 스타터 배양으로 옮기고 흔들면서 섭씨 37도에서 16-20시간 동안 성장합니다. 배양 후, 조밀한 스타터 배양액을 LB 배지에서 1에서 100까지 두 개의 500ml 배치로 희석합니다. 그런 다음 2-3시간 동안 600나노미터의 광학 밀도로 0.6-0.8로 성장합니다.

얼음에서 배양물을 냉각시킨 후 250마이크로몰 IPTG로 단백질 생성을 유도합니다. 섭씨 21도 및 200rpm에서 16-20시간 동안 배양물을 성장시킵니다. 그런 다음 2, 20분 동안 000g에서 원심분리로 세포를 수확합니다.

상층액을 제거하고 EDTA-free 프로테아제 억제제가 보충된 40ml의 IMAC 완충액 A에 펠릿을 재현탁합니다. 이제 500와트, 20킬로헤르츠, 40% 진폭으로 9초 동안 켜고 11초 동안 얼음 위에서 15분 동안 셀을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 다음, 20, 섭씨 4도에서 한 시간 동안 000g에서 원심 분리로 용해성 물질을 수확합니다.

용해성 용해물을 원뿔형 플라스크에 옮기고 2ml의 TALON 수지를 첨가합니다. 현탁액이 105rpm 회전으로 1시간 동안 배양되도록 합니다. 이제 수지를 수확하고 250ml의 IMAC 완충액 A와 500ml의 IMAC 완충액 B.IMAC 완충액 C를 사용하여 His6 태그 단백질을 용리합니다.사전 평형 크기 배제 컬럼에 용출액을 주입하고 약 87.7ml에서 용리되는 FKBP12 피크를 수집합니다.

SDS-PAGE를 통해 단백질의 순도를 평가하고 필요에 따라 풀링하고 농축합니다. 멀티웰 플레이트 어레이를 설정하려면 먼저 크기 배제 크로마토그래피에 사용되는 것과 동일한 완충액에 100나노몰 정제 FKBP12 용액을 준비합니다. 13, 000 rpm의 빠른 회전을 가진 초음파 처리 그리고 분리기는 응집체의 대형을 방지하기 위하여 작동시킵니다.

이제 100-200마이크로리터의 희석된 단백질을 바닥이 유리로 된 8웰 관찰 챔버에 피펫팅합니다. BB 이량체를 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 및 500 나노몰의 최종 농도에 추가합니다. 참고로, 100나노몰 mVenus 단독 용액을 준비하여 잠재적인 응집 및 침전 효과를 평가하고 동일한 획득 설정으로 단량체에 대한 밝기 값을 복구합니다.

디지털 검출기 또는 잘 특성화된 아날로그 검출기가 장착되어 있고 획득된 모든 픽셀에 대해 일정한 체류 시간을 유지할 수 있는 모든 광학 스캐닝 현미경 컨포칼 시스템을 사용할 수 있습니다. 형광 상관 분광법(fluorescence correlation spectroscopy)을 위해 설계된 collar correction water immersion objective를 선택합니다. 이제 칼라 보정 침수 대물렌즈에 물 한 방울을 추가합니다.

8개의 우물 관측 챔버를 무대에 장착합니다. 514나노미터 레이저를 켜고 대물렌즈 출구에서 20-100나노와트 전력으로 설정하여 여기 빔 경로를 설정합니다. 하나의 HyD 감지기를 켭니다.

광자 계수가 가능한 검출기가 바람직합니다. 520에서 560나노미터 사이의 방출 창을 선택합니다. 획득 모드의 경우 16 x 16 픽셀을 사용합니다.

프레임 시간이 단백질 확산보다 길고 픽셀 드웰 시간이 훨씬 짧도록 픽셀 드웰 시간을 설정합니다. 이는 이 데모에 사용된 시스템의 체류 시간을 약 13마이크로초로 설정하는 것과 일치합니다. 약 545나노미터의 해당 방출에 대해 하나의 Airy 단위로 핀홀을 설정합니다.

xy 시간 획득 모드를 선택하고 획득 및 웰당 획득할 프레임 수를 선택합니다. 이제 픽셀 크기를 약 120나노미터로 설정합니다. 시스템에 고처리량 모드가 장착되어 있는 경우 각 유정의 좌표와 유정당 수집 수를 도입하여 프로세스를 자동화합니다.

체계에 관류 체계로 갖춰진 경우에, BB 해결책을 적재하고 10, 000의 심상을 취득하고 있는 동안 이합체화의 동역학을 평가하기 위하여 5, 000번째 구조 직후에 시작하도록 관류를 프로그램하십시오. 올바른 웰을 선택하고 솔루션에 집중합니다. 그런 다음 획득을 시작하고 결과 이미지 스택을 TIFF 형식으로 저장합니다.

20의 순서는, 100 나노미터 해결책에 있는 순화된 FKBP12 mVenus의 심상 프로토콜 단면도에서 지정되는 것과 같이 취득되었다. 첫 번째 프레임의 intensity는 디트렌딩된 이미지의 mean intensity profile과 함께 표시됩니다. 부드러운 필터링이 없는 밝기와 부드러운 필터링이 있는 밝기도 표시됩니다.

10, 000 프레임을 획득한 후, 획득하는 동안 동형이머라이저 약물 BB를 용액에 첨가했습니다. 5, 000 프레임의 각 연속 시리즈를 분석했습니다. BB 첨가 5분 후 평균 밝기는 1.010으로 2배 증가하여 FKBP12 이량체를 나타냅니다.

이 과정의 동역학은 BB 추가와 전체 FKBP12 이합체화 사이에 약 2분의 지연을 보여줍니다. in vitro에서 단백질-단백질 상호 작용을 평가하기 위한 핵심 측면은 라벨링된 단백질의 생산 및 정제입니다. 라벨링된 관심 단백질이 소량 있고 단백질이 분석에 따라 응집되지 않는지 확인하십시오.

이 절차에 따라 표면 플라즈몬 공명 또는 형광 상관 분광법과 같은 다른 방법을 수행하여 해리 상수 또는 확산 계수와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생물물리학 분야의 연구자들이 살아있는 세포에서 단백질-단백질 상호 작용을 자세히 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 단백질 정제를 위한 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경, 장갑과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.