마우스에 있는 기종의 평가를 위한 일정한 압력의 밑에 폐 고정
2019년 9월 26일
여기에 제시된 폐 고정을 위한 유용한 프로토콜은 기종의 마우스 모델에서 폐 견본의 조직학적 평가를 위한 안정한 조건을 만드는. 이 모델의 주요 장점은 폐 붕괴 또는 디플레이션없이 동일한 일정한 압력으로 많은 폐를 고정 할 수 있다는 것입니다.
고정 장치 내의 일정한 압력은 경증 담배 연기 유도 기종을 평가하기에 적합한 조직론적 폐 표본을 생성하는 합리적으로 팽창된 상태에서 폐를 유지합니다. 이 모델의 주요 장점은 폐 붕괴 또는 디플레이션없이 동일한 일정한 압력을 사용하여 동시에 많은 폐를 고칠 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 나오코 아라노가 될 것입니다.
반사 운동에 대한 반응의 부족을 확인 한 후 마우스의 내측 라인을 따라 피부와 근육 조직에 절개를하고, 세프랄 영역을 목표로하고, 더 넓은 작업 공간을 만들기 위해 측면으로 잘라. 다이어프램 층을 노출 한 후 집게로 조직을 뚫고 흉부 공간을 엽니다. 폐와 심장이 시각화될 수 있도록 흉골 부위를 잘라냅니다.
그리고 왼쪽 심실과 오른쪽 심실을 잘라. 관류 펌프에 연결된 24 게이지 캐뉼라를 오른쪽 심실 부위에 삽입하고 폐 동맥에 도달 할 때까지 캐뉼러를 세팔 영역으로 안내하십시오. 그런 다음, 펌프를 켜고 모든 폐 조직이 백색으로 변경될 때까지 PBS의 약 200 밀리리터로 조직을 1시간 동안 인퓨즈합니다.
관류의 끝에서 기관, 폐 및 심장을 둘러싼 결합 조직을 잘라 내고 봉합사를 사용하여 올바른 주요 기관지를 묶습니다. 다음으로, 오른쪽 폐의 모든 개별 엽을 수확하고 왼쪽 폐의 심장과 엽을 적절한 고정제를 포함하는 개별 10 밀리리터 주사기에 넣습니다. 플런저를 철회하여 주사기에 진공을 만들어 폐를 팽창시키고 주사기에서 폐를 제거합니다.
기관지에 20 게이지 캐뉼라를 삽입하고 봉합사를 사용하여 캐뉼라를 제자리에 고정시하십시오. 캐뉼라에 고정으로 채워진 1 밀리리터 주사기를 연결하고 폐를 추가 고정 장치로 채우면 누출을 확인하십시오. 고정 시 폐 시편이 폐판에서 분리되는 것을 방지하기 위해 삽입 부위를 고정해야 합니다.
그런 다음 조직을 폐 고정 압력 장비로 옮기고 샘플을 제거하고 고정 기간이 끝날 때 매듭으로 기관체를 묶는다. 폐 시료가 삽입되는 폐 고정 압력 장비의 하부 성분은 20 게이지 캐뉼라를 통해 3방향 스톱콕을 사용하여 포르말린 흐름의 끝에 연결된다. 압력은 하부 구획과 상부 구획 사이의 고정의 다른 표면 수준에서 생성됩니다.
압력 차이는 25센티미터의 물이지만 높이 조절 노브를 사용하여 압력을 25~30cm 의 수로 조정할 수 있습니다. 펌프는 하부 및 상부 컨테이너를 연결하여 고정 표면 높이에서 25cm 차이를 유지하며 에이전트의 흐름을 지시합니다. 48시간 고정 후 주변 공기에 노출된 SMP30 녹아웃 마우스의 폐는 표시된 영공 확대를 나타내지 않는다.
그러나, 만성 담배 연기에 노출된 SMP30 녹아웃 마우스에서 상당한 영공 확대 및 폐포 벽 파괴가 관찰된다. 또한, 폐 시편의 평균 선형 요격 및 파괴 지수는 공기 노출 동물보다 SMP30 녹아웃 마우스가 노출된 연기에서 현저히 크다. 우리의 실험실은 10%의 포르말린을 사용하지만 연구원은 실험적인 필요에 따라 다른 고정 에이전트를 사용할 수 있습니다.
입증된 고정 시스템을 사용하여 보고된 바와 같이 폐 시료는 형태성 평가를 위해 다양한 마우스 폐기종 모델으로부터 수확될 수 있다. 고정 요원은 항상 적절한 인력 보호 장비를 착용하고 통풍이 잘되는 방에서 작동위험 할 수 있습니다.
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개요
본 프로토콜은 폐기종 마우스 모델의 폐 표본에 대한 조직학적 평가를 위해 안정적인 상태를 보장하는 폐 고정 방법을 설명합니다. 이 기술을 통해 폐의 허탈이나 수축 없이 여러 개의 폐를 동시에 고정할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 조직학
배경
- 폐기종은 주로 담배 연기에 의해 유발되는 폐 질환입니다.
- 폐 병리를 이해하기 위해서는 조직학적 평가가 매우 중요합니다.
- 정확한 평가를 위해서는 고정 과정 중 폐의 팽창 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.
- 본 프로토콜은 폐 고정 기술의 문제점들을 해결하는 방법을 다룹니다.
연구 목적
- 신뢰할 수 있는 폐 고정 방법을 제시합니다.
- 연구 시 폐 표본의 평가를 용이하게 합니다.
- 폐기종 모델의 조직학적 분석에서 일관성을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 일정한 압력을 유지하는 고정 장치 사용.
- 흉강에 접근하기 위해 생쥐의 정중선을 따라 절개.
- 횡격막을 천자하여 흉강 공간을 개방.
- 시료 수집을 위해 폐와 심장을 시각화.
주요 결과
- 고정 과정 중 폐 팽창 상태의 성공적인 유지.
- 여러 개의 폐를 동시에 고정하는 능력.
- 평가에 적합하고 안정적인 조직학적 표본.
- 대학원생에 의한 절차 시연.
결론
- 이 프로토콜은 폐 고정을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 이는 연구에서 조직학적 평가의 품질을 향상시킵니다.
- 이 기술은 폐 병리학과 관련된 다양한 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
일정한 압력 하에서의 일관된 폐 고정법은 마우스 폐기종의 재현 가능한 조직학적 평가를 가능하게 함으로써 전임상 호흡기 질환 모델의 중대한 과제를 해결합니다. 이 방법은 신뢰할 수 있는 형태학적 분석을 지원하여 변동성을 줄이고, COPD 연구를 위한 초기 단계의 타겟 검증에서 예측 신뢰도를 높입니다. 여러 검체를 동시에 처리하는 능력은 비교 연구를 효율화하고 견고한 포트폴리오 우선순위 결정(triage decisions)을 지원합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 마우스 모델에서 폐기종 중증도의 표준화된 형태측정학적 평가를 가능하게 합니다.
- 재현 가능한 조직 구조를 제공함으로써 후보 타겟의 기능적 검증을 지원합니다.
- 고정으로 인한 인위적 결과물을 최소화하여 생물학적 리스크 감소를 촉진합니다.
- 조직학적 엔드포인트와 기전적 가설 간의 연결에 대한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 정량적 조직학적 분석을 위해 검증된 폐 표본을 준비합니다.
- 실험군 간의 재현성과 비교 가능성을 보장합니다.
- 동일한 조건 하에서 여러 샘플의 확장 가능한 처리를 지원합니다.
- 스크리닝 캠페인에서 화합물이 폐 구조에 미치는 영향에 대한 신뢰할 수 있는 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 전임상 폐 병리 모델을 질환 관련 평가지표와 일치시켜 중개 연구를 가능하게 합니다.
- 조직 준비 과정을 표준화하여 발굴 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 유지합니다.
- 바이오마커 또는 효능 평가를 혼동시킬 수 있는 인위적 결과(artifactual findings)의 위험을 줄입니다.
- 확실한 조직학적 데이터를 바탕으로 위험 조정된 진행 결정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 일정한 압력 고정 방법은 초기 발견 및 전임상 검증 단계에 통합되어 호흡기 질환 모델의 표적 검증과 리드 물질 식별을 모두 지원합니다.
- 발견 생물학: 폐기종 모델에서 가설 검증 및 경로 분석을 위한 신뢰할 수 있는 조직 구조를 제공합니다.
- 스크리닝: 화합물 평가를 위해 재현 가능하고 정량적인 조직학적 결과물을 제공합니다.
- 분석: 비교 분석을 위해 평균 선형 절편(mean linear intercept) 및 파괴 지수(destructive index)와 같은 형태학적 측정을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 관련성이 있는 경우, 전임상 결과와 임상 폐기종 병리 사이의 일치를 지원합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 마우스 폐질환 모델에 적용 가능한 표준화된 고정 능력을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 고정 변동성을 최소화하여 예측 신뢰도와 타겟 검증 능력을 향상시킵니다.
- 운영적 가치: 여러 표본의 동시 고정을 가능하게 하여 처리량과 표준화를 증대시킵니다.
- 전략적 가치: 견고한 조직학적 엔드포인트를 지원함으로써 go/no-go 결정의 질과 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 신뢰할 수 있는 조직 데이터를 기반으로 호흡기 질환 프로그램의 위험 조정 우선순위 결정을 용이하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 마우스 수술 절차 및 폐 조직 취급에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 일정한 압력을 유지할 수 있는 전문 고정 장비가 필요합니다.
- 재현성을 위해 고정 파라미터에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 실험 요구 사항에 따라 다양한 고정액에 적용 가능합니다.
- 유해 고정제 취급을 위한 안전 프로토콜을 준수해야 합니다.
