Name: 실험실에 보관된 돼지를 위한 비침습적, 인펜 접근법 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 배우세요 실험실 돼지의 경미한 외상성 뇌손상 후 기능적 결손을 비침습적으로 검출하는 인펜 인간 접근 테스트 방법입니다. 이 기법은 신경과학 및 동물 복지 연구에 활용될 수 있습니다.

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저자는 해군 연구실 (그랜트 #12166253)의 자금 지원을 인정하고 싶습니다. 또한, 저자는 동물 관리 직원, 수의사, 캔자스 주립 대학과 버지니아 공대의 학생들이 동물 작업 중에 도움을 준 것에 대해 친절하게 감사드립니다. 저자는 또한 그녀의 기술 지원에 대한 나데지 크렙스, 그리고 학생 셸비 계단, 사라 그린 웨이, 미카일라 괴링의 기술 지원 및 추가 동물 관리에 감사드립니다.

각 위치 (캔자스 주립 대학과 버지니아 기술 대학)에서 개별 IACUC는 시설과 절차의 사용을 승인했다.
1. 카메라와 펜의 설정 및 루틴의 설정
<ol><li>동물을 펜에 넣기 전에 각 펜위에 90° 각도로 카메라를 고정하십시오(권장 카메라 시스템의 재료 표 참조).</li>
	<li>연구 기간 동안 또는 테스트 세션 동안에만 30 프레임/s(fps)로 동물을 지속적으로 기록합니다.</li>
	<li>볼트와 체인으로 그릇, 물가, 매트 및 장난감을 고정합니다.</li>
	<li>돼지 의 시설에 지속적으로 흰색 또는분홍색 소음 (예 : 폭포의 소리)을 재생하는 사운드 머신을 배치합니다. 참고: 외부 갑작스런 소음 (예를 들어, 문 개폐)은 세션23,24동안 깜짝 반사를 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>시설 전체에 펜으로 트리트먼트를 무작위화하거나 계층화합니다.</li>
	<li>
확립 된 축산 루틴을 설정합니다. 이것은 돼지가 언제 인간이 펜을 청소하고, 먹이를 주고, 다루고, 테스트를 수행해야 할지 알 수 있도록 도와줍니다.
	<ol>
<li>돼지가 보상과 인간을 연결할 수 있도록 친숙한 치료를 사용합니다.</li>
		<li>보상 중에 리포커를 사용하여 돼지가 클릭 사운드를 보상과 연결할 수 있습니다. 돼지에게 보상을 친숙하게 하기 위해 발성 및 시각적 신호를 사용하지 마십시오(재료 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>아침 식사 전에 또는 광고 리비텀 먹이 돼지에 대 한 새로운 피드를 배치 하기 전에 세션을 실시.</li>
</ol>2. 돼지의 식별
<ol><li>피사체가 싱글 하우스인 경우에도 비디오 피드에서 피사체를 식별할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>관찰자는 치료와 관련이없는 마킹 시스템으로 타임 스탬프를 찍는 동안 치료에 눈이 멀고 편견을 유지하십시오. 특정 색상, 둥근 모양 및 패턴의 덕트 테이프 스트립에 부착된 의료용 테이프(재료 표참조)를 사용합니다.</li>
	<li>둥근 패치 하나를 사용하여 돼지의 위쪽을 표시하고 각 면을 하나씩 표시합니다(그림 1, 녹색 및 파란색 마커 참조).</li>
	<li>테이프 모서리에 시멘트(0.35g 미만)를 스미어하여 순수증대를 돕습니다. 참고: 태그 시멘트가 너무 많이 건조되지 않아 테이프가 조기에 떨어집니다.</li>
	<li>공식 테스트가 돼지에 추가 스트레스없이 효율적으로 수행되도록 적응 기간 동안 마킹 전략을 문제 해결하고 사용자 정의할 수 있습니다.</li>
	<li>데이터 수집 시트를 사용하여 표시 및 주체 식별을 추적합니다(예제 데이터 시트의 보충 파일 1 참조). 참고: 테이프를 제거하려면 머리카락을 뽑아도 통증을 유발하기 때문에 테이프를 찢지 마십시오. 자체적으로 벗겨지거나 수성 윤활유가 제거될 수 있거나 클리퍼로 면도할 수 있습니다. 테이프가 원치 않는 시간에 벗겨지면 돼지가 돼지를 제지하는 대신 식사를하는 동안 추가 마킹 테이프를 준비하고 다시 적용하십시오.</li>
</ol>3. 모자 세션
<ol><li>시험-인간은 세션이 진행될 때마다 동일한 모자, 덮개, 부츠, 냄새 등을 착용한다.</li>
	<li>치료 전에 매일, 적어도 3 배, 그리고, 그 후 매일 세션을 실시하십시오.</li>
	<li>돼지는 세션을 시작하기 전에 펜의 모든 영역에있을 수 있습니다. 세션을 시작하려면 테스트 인간에게 그릇이나 펜 앞에 간식을 떨어 뜨리고 리모콘을 3x 클릭하도록 요청하십시오.</li>
	<li>테스트 인간은 돼지의 시야에서 손을 놓고 테스트 중에 고정되어 있어야합니다. 다른 연구원이 데이터 시트에서 세션의 시작을 표시하고 타이머를 시작하십시오. 120s 후, 연구원은 자동으로 다음 주제로 이동하고 테스트를 다시 시작하는 테스트 인간에게 신호를 보신다.</li>
</ol>4. 소프트웨어용 HAT 에토그램 의 설립
<ol><li>전문 소프트웨어를 사용하여 하나의 프로젝트에서 식도(그림 1 및 2 및 보조 비디오 1참조)를 구성합니다. 참고: 공간 적 행동은 인간에 대한 동물의 위치입니다. 이 정신에서 공간 관계는 동물의 펜에 맞게 사용자 지정하고 새로운 펜 셋업을 사용할 때마다게시되어야 합니다(그림 1). 이 범주 내에서 동작은 상호 배타적인 것으로 간주됩니다. 공간은 4개의 영역으로 나뉘며 접근수준은 다양합니다(그림 1). 이 지역은 주택 유형 간에 표준화되어 있습니다. 가장 가깝거나 등반(Cl)은 돼지가 인간에게 접근하기 위해 울타리에 올라갈 수 있음을 의미합니다. 따라서 등반은 돼지가 인간의 접촉을 가장 적극적으로 추구하고 있음을 나타내는 공간 적 행동으로 간주됩니다. 닫기 (Co)는 인간의 61cm 이내의 영역을 나타낸다. 중간 (M)은 인간으로부터 61-122 cm 이내의 영역이다. 멀리 (F)는 인간으로부터 123 cm 이상의 면적이다.</li>
	<li>
구조 적 동작은 몸 전체 또는 신체 부위의방향에 중점을 둡니다(그림 2). 두 가지 구조 범주를 생성합니다: 1) 돼지-코 위치 및 2) 돼지의 활성 상태. 그림 2A를 사용하여 방향성을 식별합니다(방향 1은 돼지가 인간을 향해 코를 지시한다는 것을 나타내고, 방향 2는 돼지가 인간으로부터 코를 지시한다는 것을 의미합니다).</li>
	<li>활동 행동 (그림2B)을세 가지 상호 배타적 접근 상태인 NNOB, NNOB 없이 서거나 걷고 NNOB 없이 쉬십시오(비디오의 에토그램에서 색상 코딩 참조). 참고: NNOB는 돼지가 입, 주숙 또는 얼굴을 핥고, 냄새를 맡거나, 물고, 문지르거나, 비영양 개체를 뿌리뽑아 친숙함이나 새로운 기회를 찾는 경우를 설명하는 데 사용됩니다. 따라서, 이 활성 상태에 있을 때, 인간에 관심이 있고, 접근 상태에 있다. 오버헤드 카메라를 90° 각도로 사용하는 경우 돼지의 코 위치와 머리 움직임은 NNOB의 표시기입니다. 때때로, 돼지는 질식 또는 샴 - 츄; 코는 볼 수 있지만 머리는 위아래로 움직입니다. NNOB없이 서거나 걷는 것은 돼지가 똑바로 서있을 때, 머리가 여전히, 코가 기판이나 질식에 닿지 않을 때 를 설명하는 데 사용되며, 이는 접근 상태가 적음임을 의미합니다. NNOB 없이 휴식 돼지 거짓말 또는 앉아 휴식 하는 경우 설명 사용, 행동의이 범주에서 최소 접근 상태는.</li>
</ol>5. 효율성과 신뢰성을 위한 비디오 타임스탬프
<ol><li>데이터 수집기가 기록한 시작 시간을 기준으로 푸티지를 정확한 3분 세션으로 편집합니다. 타임스탬프를 사용하는 방법은 세션당 9분이 소요됩니다.</li>
	<li>최대 2명의 숙련된 관찰자만 사용하여 비디오를 타임스탬프로 찍습니다. 참고 :두 관찰자가 사용되는 경우 관찰자가 동일한 샘플 비디오를 타임스탬프한 후 관찰자 내 관찰자 변형을 정량화, 평가, 조정 한 다음 Pearson 상관 계수로 보고되어야합니다 (방법의 경우 Martin 및 베이트슨25).</li>
	<li>재생 속도를 1배 일반 속도(예: 30fps)로 설정합니다. 프레임별로 프레임을 일시 중지, 되감기 또는 타임스탬프하지 마십시오.</li>
	<li>
상호 배타적인 동작의 각 범주를 별도로 타임스탬프합니다.
	<ol>
<li>타임스탬프 공간 동작. 비디오를 다시 시작합니다.</li>
		<li>타임스탬프 구조 동작. 비디오를 다시 시작합니다.</li>
		<li>구조/코 위치 동작에대한 타임스탬프.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터를 요약할 때 각 동작 결과의 기간(추가 동영상 2 및 3참조)을 사용합니다. 기간 측정을 범주당 시간의 백분율로 변환해야 합니다.</li>
</ol>6. 접근 지수
<ol><li>수식(그림3)을 적용하여 각 구조 및 공간 거동이 결합되어 AI를 생성합니다(그림3,그림 4). AI는 동작 및 범주를 그림(그림 5)또는 표 형식으로 별도로 보고하는 것 외에도 사용됩니다. 참고: 소프트웨어 세부 정보는 재료 표를 참조하십시오. 각 범주 내에서 동작 기간은 먼저 백분율로 변환됩니다(동작 의 지속 기간을 테스트 세션의 총 기간으로 나눈 값). 각 동작은 접근 수준에 따라 가중치가 가중됩니다(그림 3). 회피 동작 (멀리 있는 시간의 백분율, 휴식, 코를 돌린) 0을 곱합니다. 중간 접근 방식 동작 (중간 영역에서 시간의 백분율, 인간을 향해 설정, 그리고 여전히 머리와 서) 1 곱합니다. 가장 큰 접근 방식 동작 수준(가까운 영역과 가장 가까운 영역에서의 시간 비율 및 NNOB 표시)에 2를 곱합니다. 그런 다음 각 범주는 공간, 코 방향 및 활동에 대해 각각 3, 2 및 1에 더 가중치를 가중시킵니다. 백분율 축척을 만들기 위해 상수(0.10)가 적용됩니다. 예를 들어, 돼지가 인간과 마주보고, 가까운/가장 가까운 영역에 있고, 전체 테스트 세션 동안 NNOB를 수행하는 경우, AI는 100%(그림 3의 붉은 돼지)입니다. 대조적으로, 돼지가 먼 지역에 있는 경우, 인간을 마주하지 않고, 전체 시험 세션 동안 나머지 위치에 남아 있고, AI는 0%이다(도 3의 흑돼지). 가까운 지역에 있는 돼지는 인간에게서 외면되고 그들의 머리를 아직도 서 있는 경우에 중간 지역에서 NNOB를 능력을 발휘하는 돼지와 동일한 AI를 가질 수 있습니다 (그림 3의 주황색 돼지).</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

최첨단 이미징으로 감지 할 수있는 해부학적 및 구조적 변화를 초래하지 않는 뇌에 대한 가벼운 부상은28을식별하고 치료하기 어려울 수 있습니다. 그러나, mTBI를 가진 환자는 두뇌에 중요한 손상을 일으키는 원인이 될 수 있는 추가 모욕에 특히 취약하고, 그러므로, 이 인구를 확인되는 것이 중요합니다. mTBI의 미니 돼지 모델에서 개발 된 행동 테스트는 돼지가 인간과 유사한 생리학을 가지고 있으며 anhedonia 8,9,10과 같은 유사한 정서적 상태를 표현하기 때문에 인간 mTBI 환자와 특히 관련이 있습니다. ,20. 여기에서, 우리는 비침범성, 인-펜 행동 시험 (HAT)를 개발하고, sham 돼지에서 mTBI 돼지를 구별하기에 충분히 민감하다는 것을 보여주었습니다. 또한, 가중 지수 (AI)는 주택과 돼지 유형에 걸쳐 유비쿼터스 HAT 동안 관찰 된 행동을 위해 개발되었다.
수정 및 문제 해결:
HAT에 대한 방법론은 ethology 지침25 및 시험 6의 신뢰성, 반복성 및 유효성을 개선하기 위한 몇가지 시행 착오 전략에 기초하여 수립되었다. 신뢰성 측정은 테스트의 강점과 한계를 식별하는 데 도움이 되었습니다. 신뢰성은 측정이 반복 가능하고 일관되고 임의 오류28,29에서자유로운 정도를 정의합니다. 우리는 이전에 HAT의 인트라- 및 인터옵저버 신뢰성에 대해 보고했으며, 추가적인 구조 적 기질로, 지속 시간 동안 신뢰성이 비슷하게높다(Pearson의 R2 > 0.90). 빈도 및 대기 시간 측정에는 숙련된 관찰자가 필요하지만 지속 시간 측정은 관찰자에 덜 의존하므로 실험실30에서보다 신뢰할 수 있습니다.
실험실 내의 신뢰성과 실험실 전반의 반복성은 방법에 따라 달라집니다. 우리의 실험실에서, 비디오 시스템은 지속적으로 기록, 파일은 처음에 5 분 파일로 저장되고, 일부 HAT 세션은 두 개의 파일을 통해 발생했다. 데이터 시트의 정확한 시간을 사용하여 비디오를 클립하고 결합하는 데 사용했을 때 실수가 적어졌습니다. 에지그램을 개발하기 전에 관찰자는 비디오 푸티지를 일시 중지, 중지 및 되감기하여 전체 에지그램의 모든 동작을 타임스탬프로 찍을 수 있었습니다. 이 방법은 3분에서 20분에 이르는 각 샘플의 타임스탬핑 에 변화를 일으켰을 뿐만 아니라 대부분의 동작에서 관찰자 간 및 관찰자 간 신뢰성도 좋지 않았습니다. 따라서 재생 속도를 설정하고 관찰자 타임스탬프를 한 번에 했습니다. 따라서 한 범주에서 신뢰성이 낮았을 때 관찰자는 정의와 푸티지를 함께 협의한 후 전체 에지그램이 아닌 범주만 독립적으로 리타임스탬프를 찍습니다. 설정된 재생 및 범주 메서드를 통해 각 샘플의 타임스탬프에 필요한 시간을 일관되게 예측할 수 있었습니다. 한 달 이상 에 걸쳐 있는 프로젝트의 경우 코딩된 비디오와 관찰자 내 안정성을 정기적으로 검토하는 것이 중요합니다.
신뢰성과 반복성을 감소시키는 또 다른 요소는 비디오 설정입니다. 처음에는 핸드헬드 카메라와 삼각대가 사용되어 펜에서 펜으로 옮겨졌습니다. 이 방법을 사용했을 때, 돼지는 HAT 전에 삼각대와 카메라에 도입될 필요가 있었다; 그렇지 않으면, 돼지는 삼각대와 운동에 반응하는 것으로 나타났다. 또한, 비오버헤드 카메라 앵글은 타임스탬핑 동안 관찰자의 시야를 제한하고 공간의 깊이 인식은 공간 행동 측정에서 관찰자 내부 및 관찰자 간 편차를 증가시켰습니다. 따라서 고정 카메라로 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 각 테스트 전에 카메라가 올바르게 배치되었는지 확인하기 위해 각 주의가 필요하며 각 돼지 세션 사이에 설정하는 데 더 많은 시간이 필요합니다. 그러나, 우리는 연속 비디오 오버 헤드 시스템이 첫 번째 HAT 전에 적어도 24 시간 자정에 초기 녹화를 시작하는 데 필요한 것을 배웠습니다. 많은 비디오 시스템의 타임스탬프 디스플레이가 정확하지 않고 프레임과 동기화되지 않습니다. 따라서 더 이상 표시 시간에 의존하지 않습니다. 자정이 시작되면 정확한 프레임 캡처 및 비디오 편집이 허용되었으며 타임스탬프 디스플레이가 사용되지 않았습니다.
또한 이 테스트 문제를 해결할 때 돼지의 적응과 루틴 설정이 중요했습니다. 그들의 환경에 잘 적응하지 않은 돼지의 영상에서, PAC는 HAT 동안 관찰되었다. 이는 돼지가 탐사 상태(32)가 아닌 교반 상태(31)에 있을수 있다는 지표이다. 3주 이상의 적응 기간은 실험에서 속도를 높이는 돼지의 수를 감소시킬 수 있다. 그러나 모든 샘플링 기간 동안 간격이 지속되면 걷기와 서 있는 것을 포함하도록 이 정신을 조정해야 할 수 있습니다.
유효 범위는 측정이25를묻는 질문의 의도된 범위를 나타내는 범위입니다. HAT를 처음 개발할 때는 공간 적 식지만 사용했습니다. 공간 식지 행동의 정의는 정확하고 구체적으로 인간의 피사체에 근접을 설명하고 그들은 돼지가 자신과 인간 사이에 잎 얼마나 많은 공간을 관찰자에게 직접 알려줍니다. 그러나, 일단 이 방법들이 새로운 실험실 설치에 적용될 필요가 있으면, 우리는 공간 정신이 실험실 특정하다는 것을 인식했습니다. 펜 치수와 다른 객체의 배치는 공간 식지의 결과에 영향을 미칩니다. 따라서 펜 설정이 이전에 보고되지 않은 경우 펜의 측정 및 세부 사항이 있는 다이어그램을 게시해야 합니다. 펜 환경에 대한 보고 외에도 구조적 동작이 에토그램에 추가되었습니다. 공간 거동과 는 달리, 구조적 행동은 실험실에서 더 쉽게 평가될 수 있습니다. 이러한 동작은 돼지의 활성 상태 수준을 구체적으로 설명하기 때문에 유효합니다. 돼지가 쉬고있을 때, 접근 동기가 없으며 서있는 돼지처럼 빨리 접근하는 위치를 변경할 수 없습니다. 마찬가지로 NNOB를 표시하는 돼지는 탐색 상태에 있지만, 서있는 동안 여전히 머리를 가진 돼지는 촉매 상태에 더 가능성이 높습니다. 코 방향은 코, 귀 및 눈이 돼지가 인간에 대한 정보를 수집하는 데 사용하는 것이기 때문에 타당성에 도움이됩니다.
기술의 한계 :
이 기술에 대한 잠재적 인 관심사는 테스트 인간에 대한 돼지의 반응의 가변성입니다. 또한 돼지는 시험 인간의 손을 볼 것이며, 이는 그 사람에 의해 의도하지 않은 큐잉을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 이러한 한계는 1) 익숙한 인간과 낯선 인간에 대한 돼지의 반응을 실험적으로 시험하고, 2) 펠릿이 떨어뜨린 후, 시험-인간 스탠드가 가만히 서 있고 손을 밖으로 내다는 것을 표준화하여 표현하였다. 돼지의 광경. 데이터는 HAT(표 2) 동안 치료 또는 치료x 시간 차이가 없음을 보여주었으며, 이는 HAT가 친숙하거나 익숙하지 않은 인간에 의해 투여될 수 있음을 시사한다. 다른 연구자들은 돼지가 이전 상호 작용 에 따라 인간에 대해 일반화하는 경향이 있음을 제안11,12,13; 따라서 돼지가 인간과 함께 한 이전의 경험은 긍정적이어야 합니다. 이 과제는 또한 방심한 실험 설계로 해결할 수 있습니다. 각 블록에 대해, 관심의 각 치료에 대해 표현 된 실험 단위의 충분한 수가 필요합니다.
본 연구에서는 세 가지 주택 유형에 대한 모든 비디오를 타임스탬프로 찍는 경험이 풍부한 관찰자가 두 명뿐이었지만, 특정 행동 결과에 대한 하우징 유형 간에는 차이가 있었습니다(표 1). 예를 들어, 하우징 타입 B의 돼지는 하우징 유형 A와 C보다 더 자주 가장 가까운 지역으로 들어갔습니다. 이는 펜 재질의 차이 때문일 수 있습니다. 하우징 타입 B에서 펜의 전면은 HAT 동안 돼지가 게이트를 올라갈 수 있도록 수평 막대가있는 체인 연결 게이트였습니다. 반면, 하우징 유형 A와 C는 돼지가 올라갈 수 있는 수직 막대와 수평 표면이 적었다. 이러한 가변성은 주택 유형 간에 비교하기 전에 가까운 지역과 가장 가까운 영역에기간 지출을 추가하여 해결할 수 있습니다(표 1; P > 0.10). 그러나, 주택형 C형의 돼지는 주택형 A와 B(표 1)보다 먼 지역에서 더 많은 시간을 보냈다. P < 0.05), 펜의 전면보다는 펜의 뒷면에 물기를 배치하기 때문에 가능성이 있었다. 이는 실험실에서 물가, 그릇 및 장난감의 배치를 표준화하고 돼지가 다른 영역으로 물체를 이동하지 않도록 고정되도록 하는 경우 해결할 수 있는 제한 사항입니다.
이 테스트는 모든 유형의 실험실에 대한 접근성이 뛰어나지만, 앞서 언급했듯이 수동으로 스탬프가 찍힌 공간 식지와 측정은 실험실마다 더 다양합니다. 그럼에도 불구하고 신체 및 머리 구조 정신은 유비쿼터스입니다. 돼지에 대한 검증된 자동 추적에 액세스할 수 있는 실험실은 이동 거리와 이동 속도가 행동 측정의 추가 결과일 수 있기 때문에 수동으로 가기보다는 공간 식도를 자동으로 추적함으로써 이점을 얻을 수 있습니다. 모자. 테스트 영역과 자동 추적 기술이 아닌 인펜 설정 및 기존 기술의 한계는 AI 공식을 적용하여 해결할 수 있습니다. AI는 개별 돼지가 펜 공간을 사용하고 인간에 대한 관심을 표현하는 방법에 대한 표준화된 측정 및 용어를 제공합니다. 일반적인 행동 측정에서 파생된 이 계산은, subcusive mTBI의 돼지 모형 및, 아마도, subclinical 상해 또는 병의 그밖 국가에 민감합니다. 또한 AI는 실험 중에 임의 변형을 감소시키고 실험 별 측정에 의존하는 방법보다 실험 및 실험실 전체에서 더 쉽게 비교할 수 있습니다. 이러한 동작은 치료 전반에 걸친 표준 측정인 반면 공간 동작은 펜 설정, 펜의 돼지 수 및 추적 시스템에 따라 달라지기 때문에 구조적 동작은 이 수식의 기초를 제공했습니다. 예를 들어, 우리는 두 개의 건강한 돼지가 펜에서 테스트 할 때, 그들은 함께 접근하여 유사한 공간 행동을 수행하지만, 첫 번째 다음 돼지는 인간을 향해보다 펜 메이트쪽으로 더 많은 코를 방향을 수 있으며 더 많은 NNOB를 표현 할 수 있음을 관찰 , 리드 돼지는 파수꾼 역할을하기 때문이다. 그럼에도 불구하고 AI는 페어링된 동작에서도 이러한 변화를 줄이는 데 도움이 됩니다.
AI는 실험실 전체에서 테스트를 표준화하기 위한 훌륭한 도구 집합이지만, 연구원들은 실험실 이나 실험 내에서 테스트 별 행동 결과를 검사할 수 있습니다., 특히 충분 한 전력 (즉, 실험 단위 및 반복 된 테스트)를 단일 실험에서 테스트합니다. 따라서, 표1은, 모든 행동 결과, 분산, 분포 및 각 특정 행동에 대한 동물 수에 대한 계산된 시험을 포함하는, 여기에 포함되었다. 예를 들어, 연구원이 돼지가 HAT 동안 지속적으로 올라갈 수 있는 펜 환경을 가지고 있고 등반 동작의 75% 차이에 대한 치료 원인을 알고 있다면 측정된 분산에 따라 동물 수를 정당화할 수 있습니다. 새로운 행동이 정신에 추가되는 경우, 과학자들은 인덱스에 통합하기 전에 접근 또는 철수를 나타내는 행동을 정당화해야합니다. 예를 들어, 대부분의 동물이 펜의 벽(즉, thigmotaxis)을 따라 실험 속도 내에 있는 경우(즉, thigmotaxis)32,이러한 동작의 지속 기간은 신체 구조 식지 범주에 통합될 수 있다. 동작은 상세한 스택 형 막대 그래프 (즉, 그림5) 또는 표 형식 형식으로 나타낼 수 있으며 인덱스 계산을 적용하기 전에 정지 로 요약 할 수 있습니다. 따라서 AI는 실험실 전체에서 유비쿼터스적인 동작을 나타낼 수 있지만 추가적인 고유한 동작은 여전히 별도로 나타낼 수 있습니다.
기존 방법에 대한 중요성 :
모자에 대한 기존의 방법은 동물 복지를 평가하기 위해 상업 농장에 돼지에 대한 설립되었다. 여기에서, 실험실 돼지를 위한 프로토콜이 설치되었습니다, 이는 연구원이 동물 복지를 평가하고 mTBI 돼지를 가짜 취급한 돼지에서 구별하는 것을 도울 수 있습니다. 다른 전통적인 테스트는 오픈 필드 테스트를 사용하는 것입니다. 이 시험은 이전에 돼지의 정서와 복지를 평가하기 위해 사용되었다33. 오픈 필드 테스트는 원래 열린 공간과 빛에 대한 자연적인 혐오를 측정하여 설치류의 정서적 상태를 테스트하기 위해 설계되었습니다. 대조적으로, 건강한 돼지는 식욕10과 같은 자극을볼 수 있고, 질병, 상해, 또는 스트레스 처리 후에, 그(것)들은 확률이 높습니다 공포를 표현합니다. 이 테스트는 더 많은 실험실 공간을 필요로하며 돼지가 야외 경기장에서 처리되고 배치되는 데 적응해야합니다. 실험실에 돼지를 처리하기 위한 공간과 프로토콜이 있는 경우, 한 번의 개방형 테스트 이외에 반복된 HAT 세션은 처리된 동물을 가짜 로 처리한 동물과 더욱 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
프로토콜 내의 중요한 단계:
프로토콜의 처음 세 단계는 성공적인 HAT 측정에 가장 중요합니다. 돼지 당 세션은 3 분 밖에 걸리지 않습니다. 그러나 적절한 준비는 이 시험을 신뢰할 수 있게 만드는 데 도움이 됩니다. 위에서 설명한 것처럼 카메라 위치 및 녹화 설정은 선명도 및 복제에 매우 중요합니다. 카메라 각도가 잘못되면 관찰자의 시야가 제한되어 측정에 오류가 추가될 수 있습니다. 종종 간과되는 또 다른 단계는 펜의 개체를 고정하는 것입니다. 돼지는 고정되지 않은 물체를 이동하며, 이것은 인간에게 접근하는 동기에 영향을 미칠 수 있습니다. 돼지가 일관되게 테스트를 수행하기 전에 환경에 적응해야 하기 때문에 설정 및 관리 시스템이 중요합니다. 홈 펜이나 루틴에 잘 적응하지 못하거나 스트레스를 받고 있는 돼지는 펜(34)의 뒤쪽이 아닌다른 부위에서 배설됩니다. 배변 지역은 접근에 그들의 동기 부여에 영향을 미칠 수 있습니다. 카메라 뷰에서 관찰자는 개별 돼지를 식별 할 수 있어야합니다. 그러나, 마킹 방식은 관찰자(25)를 편향시킬 것이기 때문에 동물의 치료에대한 정보를 제공하지 않는 것이 중요하다.
돼지를 식별하는 것은 올바른 돼지에 대한 올바른 행동 데이터를 얻기 위해 매우 중요합니다, 그들은 단일 주택 경우에도. 돼지는 종종 치료를 위해 이동하고, 표시는 제거하고 펜에 다시 배치 한 후 그들은 같은 돼지를보고 있다는 관찰자를 안심. 돼지는 하우징 타입 C에서와 같이 쌍으로 보관될 수 있으므로 돼지를 식별하는 것이 매우 중요합니다. 가축 마킹 페인트 및 마커는 매일 적용해야 합니다. 따라서 이 프로토콜은 의료용 테이프와 태그 시멘트의 얼룩을 사용해야 합니다. 이 테이프는 긴 머리를 가진 돼지에게 가장 잘 붙어 있습니다. 짧은 머리와 건조한 피부를 가진 돼지는 긴 머리를 가진 돼지보다 더 자주 테이프를 벗겨낼 것입니다.
향후 응용 프로그램:
요약하자면, 여기서 설명된 비침습적 인펜 HAT 시험은 mTBI 후 돼지의 온화하고 시간적 의존적 변화를 검출할 수 있을 정도로 민감하다. 또한, 우리는 다른 펜 유형뿐만 아니라 돼지의 다른 유형에 보관 돼지의 변화를 평가하기 위해 AI라는 가중 인덱스를 개발했다. HAT는 mTBI에 노출된 돼지의 변화를 감지하는 데 사용되었지만, 이 행동 테스트는 스트레스 또는 병리학적 상태를 경험하는 동물의 측정 가능한 행동 변화를 감지하는 데 유용할 수 있습니다.

인간 mTBI는 종종 뇌 내의 글로벌 구조적 변화 또는 중요한 부종의 부재에도 불구하고 기능적 적자에 의해 정의된다1,2,3. 실제로, 일부 mTBI 환자에서,이 부상의 특징은 신경 해부학 적 변화가없는 상태에서 자신의심리 상태의 변화이다 4,5. 우리는 돼지의 두뇌가 설치류 7보다 해부학적으로 그리고 생리적으로 인간에게 더 가깝기 때문에 mTBI6의 돼지 모델을 활용했으며, 해당 측정은 인간과 관련된 공통 데이터 요소 세트를 제공 할 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 돼지 모델은 전임상 조사를 위한 신경외상 과학자 및 mTBI 이해관계자의 관심을 얻고 있다; 그러나, TBI의 설치류 모형과는 달리, 실험실 돼지의 정서 상태 (즉, 심리상태)의 평가를 허용하는 몇몇 표준화된행동 시험이 간행됩니다 7,8,9, 10. 우리의 실험실을 위한 장기적인 목표는 돼지가 subclinical 질병을 경험하거나 동물이 전병리학적인 긴장 관련 상태에 있을 때 측정하기 위하여 충분히 과민한 몇몇, 상호 보완적인 행동 공구 세트를 개발하는 것입니다.
실험실 돼지에서 정서적 상태의 변화를 측정하는 반복행동 시험은 건강한 동물과 병리학적 상태를 가진 동물을 구별하기 위한 좋은 후보일 수 있다. 예를 들어, 인펜 하트는 농부들이 좋은 기질을 가진 건강한 돼지를 선택하거나 고민, 부상 및 질병을 유발하는 관리 및 주택 전략을 수정할 수 있도록 상업적돼지 생산에 사용되었다11,12. 이러한 시험은 1개의 돼지 또는 돼지(13)의 동기 부여 및전반적인 정서적 상태를 정량화하는 데 사용되었다.
우리의 실험실 및 그밖 연구원은 행동의 3개의 종류분류해서 돼지에 있는 동기를 측정했습니다: 1) 돼지가 입, 주마, 또는 얼굴을 스니핑하기 위하여, 핥고, 츄를, 기판을 뿌리 뽑거나 기판(14,15)없이질식한다. 2) 돼지와 물체의 공간적 관계 또는16; 3) 코 방향은 돼지가 단안17을가지고 있기 때문에 눈 접촉 대신에 사용되지만 근시 시력, 그리고 시력18보다후각을 우선시합니다. 건강한 돼지가 인간을 보람있는 자극과 연관시키는 경우, 그들은 NNOB의 높은 주파수를 표현하고, 인간을 향해 코를 지시하고, 인간11,16에더 가깝게 다가가려고 노력한다. 그러나, 질병, 상해, 또는 고통스러운 경험 후에, 즐거운 자극조차 추구하는 동기부여는 감소되고, 따라서, 이 측정 가능한 행동은 아마 감소됩니다19. 돼지 행동 연구원은 anhedonia, 즐거운 자극을 경험하는 동기 부여의 부족, 그들의 가정 환경 내의 돼지에서 인식가능하고 측정할 수 있다는 것을 주의했습니다20. 따라서, 반복된 HAT(치료 전후)는 암투압 mTBI로 처리된 실험실 돼지를 샴처리(마취 전용) 피험자로부터 구별하는 민감한 척도로서 작용할 수 있다. Anhedonia는 TBI 환자가21를경험할 수 있는 1개의 정서적 인 상태입니다. 여기에서 사용된 HAT는 동물 모형에서 임상 업무에 행동 사실 인정의 번역을 능률화하는 것을 돕는 에 있는 잠재력을 가지고 있습니다. HAT는 실험 의 과정을 통해 매일 관리 될 수 있습니다, 이는 또한 동물 복지 및 축산22최적화에 대한 실험실 돼지의 치료를 표준화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
여기서, HAT를 사용하여, 미니 돼지에서 mTBI로 인한 행동 차이를 조사한다. HAT의 비침습적 조치를 활용하고 돼지가 홈 펜, 일상적인 관리 및 일일 치료에 적응할 수 있도록 함으로써 행동 가변성을 최소화했습니다. 일반적으로 테스트 경기장은 동작(예: 개방형 테스트)을 측정하는 데 사용됩니다. 인펜 테스트는 공간이 제한된 실험실에서 유용할 수 있습니다. 시험 장에서 돼지를 이동하고 취급하면 스트레스 반응(고민 또는 유스트레스)이 발생할 수 있으며 잠재적으로 테스트에 대한 반응의 변형을 추가할 수 있습니다. 인펜 테스트는 해당 처리 구성 요소를 제거하므로 핸들링 스트레스17의변형을 줄일 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리는이 mTBI 모델에 대한 매일, 인펜 HAT를 개발했다.
동물의 정서적 상태를 적절히 정의하는 표준화및 정량화된 측정은 새로운 행동 시험을 개발하는 데 중요한 측면이다. 또한 여러 실험실에서 테스트를 반복할 수 있어야 합니다. 여기에서 이 프로토콜을 개발하기 위해 HAT는 3개의 실험실의 서로 다른 하우징 시스템에서 테스트되었습니다. 샘플 동영상의 특정 동작을 타임스탬프에 대고 세 개의 subethograms을 만들었습니다. 다음으로, 가중치 가중 식은 3개의 정신을 통합하고 여러 실험실에서 HA를 사용할 수 있도록 만들어졌습니다. 이 시험은 하부 뇌진탕 mTBI로 처리 된 미니 돼지를 위해 특별히 개발되고 사용되었지만, 여기에서 개발 된 방법과 프로토콜은 임상적으로 다친 / 아픈 또는 고민 돼지와 고통받는 돼지사이의 차이를 구별하기위한 응용 프로그램을 갖게됩니다. 건강한 돼지.
행동 결과는 단일 대 그룹 하우징, 자유 공간 허용량, 사용된 바닥 유형, 사용되는 울타리 유형, 먹이 및 물의 위치, 배변 영역 및 환경 농축 위치에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서, 3개의 주택유형을 조사했다(도 1): 주거형 A는 캔자스주립대학(맨해튼, KS)에 있었다); 주택 형 B와 C는 버지니아 공대 (알링턴, 버지니아)에 있었다. 각 장소의 개별 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)는 시설과 절차의 사용을 승인했습니다.
하우징 타입 A(도1A)의에지그램을 개발하기 위해, 미네소타 크로스 미니 돼지(멧돼지 = 7, 금박=1; 국립 돼지 연구 자원 센터, 컬럼비아, 미주리; 연령 = 25.6 ±3.66 [평균 ± 표준 편차(SD)] 주)는 동물 친화적 인 바닥재 (IACUC #3881)가있는 단일 펜으로 실내에 보관하였다. 이 프로토콜에 사용된 돼지는 양호한 상태였으며 치료법이 적용되지 않았다. 하우징 타입 B에 대한 프로토콜을 개발하기 위해, 유카탄 미니 돼지(연령 = 25.3±2.80주[평균 ±SD]는 버지니아 공대 시설에서 단독 주택(도1B)을하였다(IACUC #15-060). 동물 치료는 다른 곳에서 설명29 및 폭발 파 과압 또는 sham 제어를 사용하여 하부 뇌진탕 mTBI의 유도를 포함 (마취 만). 하우징 타입 C의 프로토콜을 개발하기 위해, 5마리의 암컷 괴팅겐 미니 돼지(나이 = 23.7±1.18주 [평균 ±SD])를 대형 펜으로 버지니아 공대에서 짝수 로 보관하였다(도1C; IACUC #15-060). 처음 두 주거 환경은 전형적인 실험실 주택 또는 단일 주택 돼지를 포함. 주택형 C는 돼지를 두 마리 이상 수용할 수 있는 비정형 주거 환경으로, 표준 실험실 하우징보다 농축된 환경으로 간주될 수 있습니다. 이 프로토콜은 다음과 같은 방법을 따르는 경우 하우징 유형 간에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2.8-12mm 렌즈 세트 2.8-3.2mm</td><td>포인트 노스 감시, 오번, ME</td><td>CDL7233S</td><td>로우 프로파일 펜에는 더 낮은 mm 렌즈가 필요합니다</td></tr><tr><td>Manfrotto 244 마찰 암 키트</td><td>B& H 포토</td><td>B & H # MA244; MFR # 244</td><td>카메라를 90도 각도로 설치하고 고정하기 위해</td></tr><tr><td>비디오 녹화 시스템</td><td>포인트 노스 서베일스, 오번, ME</td><td>NVR-RACK64</td><td>NVR은</td></tr><tr><td>양면 의료용 테이프에 부착된 색상과 패턴의 덕트 테이프</td>로 맞춤 제작되었습니다<td>. MBK 테이프 솔루션, Chatsworth, CA</td><td>3M 1522H</td><td>돼지의 지속 가능한 마킹</td></tr><tr><td>접근 지수 공식 생성기</td><td>Dinasym, 맨해튼, KS</td><td>접근 공식</td><td>회사는 특정 실험실 요구 사항에 대한 매크로를 사용자 정의</td></tr><tr><td>Geovision 소프트웨어</td><td>포인트 노스 감시, 오번, ME</td><td>Geovision</td><td>소프트웨어는 비디오 시간을 180 초 클립으로 편집합니다</td></tr><tr><td>Clicker</td><td>Petco</td><td>Good2Go 개 훈련 리모콘</td><td></td></tr><tr><td>보상 간식 (사료 펠렛, 캐럽 칩, 건포도, 마시멜로)</td><td>변수</td><td>N/A</td><td>이전 노출에 따라 다르지만, 다 자란 돼지는 새로운 음식이 소개될 때 매우&nbsp; 신혐오증을 보입니다. 제한 사료를 먹인 돼지에게는 몇 알의 사료를 먹일 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>통계 분석 시스템(SAS)</td><td>SAS Institute, Cary, North Carolina</td><td>SAS 9.0</td><td>혼합 모델 및 반복 측정 분석을 위한 당사 실험실 선호</td></tr><tr><td>Observer 11.5 소프트웨어</td><td>Noldus Information Technology, Leesburg, VA</td><td>Observer 11.5</td><td>비디오 클립에 수동으로 타임스탬프를 지정하는 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

실험실에 보관된 돼지를 위한 비침습적, 인펜 접근법 테스트

Noninvasive, In-pen Approach Test for Laboratory-housed Pigs

외상성 뇌 손상 (TBI) 부각은 민간인과 군인 인구 둘 다에서 증가하고, 많은 연구원은 TBI를 위한 돼지 모형을 채택하고 있습니다. TBI를 위한 설치류 모형과는 달리, 표준화된 몇몇 행동 시험이 있습니다. 더 큰 동물은 설치류보다 시험 부위에서 더 침습적인 취급을 필요로 하며, 이는 잠재적으로 동물의 반응에 스트레스와 변형을 추가합니다. 여기서, 인간 접근법 시험(HAT)은 실험실 돼지의 홈 펜 앞에서 수행될 수 있도록 개발되었다. 그것은 비 침습적이지만 주택 설정의 차이를 허용 할 만큼 유연합니다.
HAT 동안 3개의 행동 정신이 개발된 다음 접근 지수(AI)를 만들기 위한 공식을 적용했습니다. 결과는 HAT와 그 지수, AI가 온화한 TBI (mTBI) 후에 돼지의 행동에 있는 온화하고 일시적인 변경을 검출하기 위하여 충분히 민감하다는 것을 표시합니다. 또한 특정 행동 결과는 하우징에 의존하지만 AI를 사용하면 변동이 줄어들고 실험실 전체에서 일관된 측정이 가능합니다. 이 테스트는 신뢰할 수 있고 유효합니다. HAT는 많은 실험실과 부상, 질병 및 고통의 다양한 유형의 돼지 모델에 사용할 수 있습니다. 이 테스트는 관찰자가 각 샘플에 9분 이상 을 일관되게 소비하지 않는 최적화된 수동 타임스탬핑 방법을 위해 개발되었습니다.

이 프로토콜은 돼지의 홈 펜에 있는 인간 적인 접근 시험 - 암막 외상성 뇌 손상 후에 실험실 돼지에 있는 기능적자를 검출하기 위하여 새로운 행동 시험- 기술합니다.

Traumatic brain injury (TBI) incidences have increased in both civilian and military populations, and many researchers are adopting a porcine model for ...

이 방법은 신경 과학 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 특히 신경 외상에 대한. 이 기술의 주요 장점은 경기장이나 피사체의 추가 처리가 필요하지 않다는 것입니다. 내 연구 팀은 프로토콜 전반에 걸쳐 절차를 시연 볼 수 있습니다. 여기에는 에두아르다 보르톨루치, 미카일라 괴링, 루크 루이스, 제러드 뭄, 모건 코핀 등이 포함됩니다.동물을 펜에 넣기 전에 90대의 카메라를 수정합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

과학에 국내 및 미니어처 돼지의 사용은 최근 몇 년 동안 크게 증가하고 있습니다. 삽관법, transurethral 방광 catheterization, 대퇴 동맥 및 정맥 catheterization뿐만 아니라 transcardial 재관류를 수행하는 방법을 시연함으로써, 우리는 더 이상 생명 의학 연구에 괴팅겐 minipigs의 가치를 높이는 것을 목표로하고 있습니다.

괴팅겐 Minipig의 기본 외과 기술 : 삽관법, 방광의 Catheterization, 대퇴 선박 Catheterization, 그리고 Transcardial 재관류

알려진 모델 있지만, 기니 피그는 현재 실험 동물 과학 분야의 틈새 시장을 대표하는 제한된 데이터는 대부분의 절차의 실행에 사용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 의식이나 마취 기니피그 중 생체 내 혈액 샘플링 기술의 비 터미널에 네 가지 방법을 제시한다.

기니 돼지의 비 터미널 혈액 샘플링 기법

폐고혈압은 폐동맥 박동성, 수축성 및 탄력성의 현저한 감소와 관련이 있으며, 이는 폐동맥압과 폐저항의 증가에 기여합니다. 본 연구는 저산소성 새끼 돼지 모델을 사용하여 새로 개발된 박동 카테터를 사용하여 폐동맥 가소성을 개선하면 저산소성 폐고혈압이 개선된다는 것을 입증했습니다.

증가 폐 동맥 박동 흐름 새끼 돼지의 저산소 폐 고혈압을 개선

만성 혈전색전성 폐고혈압(CTEPH) 및 우심실(RV) 기능 장애는 폐동맥의 점진적인 폐색에 의해 새끼 돼지에서 유발되었습니다. 결과는 CTEPH 환자에서 관찰된 것과 매우 유사했습니다. 이 동물 모델은 CTEPH 및 RV 실패에 대한 병태생리학 및 치료 실험에 매우 유용한 도구가 될 것입니다.

만성 혈전 색 전성 폐 고혈압과 돼지에서 마우스 오른쪽 심실 기능의 평가

저자는 인플루엔자 A 바이러스를 탐지하고 격리하기 위해 돼지 비강 물티슈를 수집하는 프로토콜을 제시합니다.

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

마취에 의해 유발 된 발달 신경 독성 (AIDN) 연구는 인간에게 광범위하게 적용 할 수없는 설치류에 초점을 맞 춥니 다. 비인간 영장류 모델은 더 적절하지만 비용이 많이 들지 않으며 실험에 사용하기가 어렵습니다. 대조적으로, 돼지는 마취 성 신경 독성의 연구에 이상적이며 임상 적으로 관련이 있고 실용적인 동물 모델입니다.

마취 유발 신경 독성 (AIDN) 연구를위한 돼지 모델의 사용 : 번역 신경 과학적 접근법

선물이 아즈를 유도 하 여 돼지 모델에서 오른쪽 심 실 부전을 만드는 프로토콜. 왼쪽 및 오른쪽 심 실 심장 출력 흐름을 사용 하 여 프로브 대동맥 및 폐 동맥에서 혈압 측정 뿐만 아니라 대동맥과 폐 동맥의 침입 모니터링 설명 합니다.

대동맥 및 폐 동맥 Hemodynamics 아즈의 큰 동물 모델에서의 침략 Hemodynamic 감시

본 프로토콜은 마취된 돼지에서 일반적인 비골 신경의 전기 자극을 통해 얻어진 생체내 토크 데이터의 평가 및 해석에 대한 간결한 실험 세부사항을 기술한다.

생체 내 돼지의 Hindlimb Dorsiflexor 등각 토크 측정

최근 몇 년 동안 연구에서 돼지의 사용이 증가했습니다. 그럼에도 불구하고 돼지는기도 해부학이 어렵다는 특징이 있습니다. 내시경으로 유도된 기관내 삽관을 수행하는 방법을 보여줌으로써 본 프로토콜은 동물의 고통과 불필요한 죽음을 피하기 위해 실험실 동물의 안전성을 더욱 높이는 것을 목표로 합니다.

돼지의 안전한 기도 관리를 위한 표준화된 모델로 유연한 삽관 내시경을 사용한 기관내 삽관

사구체 여과율(GFR)은 신장 기능을 평가하는 데 이상적인 지표입니다. 그러나 연속 혈액 및 소변 분석과 함께 이눌린 주사를 사용하는 표준 측정 방법은 비실용적입니다. 이 기사에서는 새끼 돼지에서 GFR을 경피로 측정하는 실용적인 방법을 설명합니다.

기계적으로 환기된 새끼 돼지의 사구체 여과율의 경피 측정

배우세요 실험실 돼지의 경미한 외상성 뇌손상 후 기능적 결손을 비침습적으로 검출하는 인펜 인간 접근 테스트 방법입니다. 이 기법은 신경과학 및 동물 복지 연구에 활용될 수 있습니다.

실험실에 보관된 돼지를 위한 비침습적, 인펜 접근법 테스트

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