Name: 꼬마 선 충 의 프로 파일링 Phenotypic 자동화 하 여 화학 독성의 예측에 대 한 높은 처리량 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 자동화된 표현형 프로파일링 방법으로 화학 물질의 급성 독성을 예측하는 고처리량 분석 기술입니다. 이 프로토콜은 독성학 연구에 활용됩니다.

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저자는 친절 하 게 보내는 C. 선 충 CGC를 감사 합니다. 이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705);에 의해 지원 되었다 중국 그랜트 (#31401025, #81273108, #81641184), 자본 건강 연구와 베이징 (#2011-1013-03), 환경 독물학 (# 베이징 주요 연구실의 오프닝 기금에에서 특별 한 프로젝트의 개발의 국가 자연과학 기초 2015HJDL03), 산 동성, 중국 (ZR2017BF041)의 자연 과학 재단.

프로토콜 질병 예방 및 중국에 있는 컨트롤에 대 한 베이징 센터의 동물 윤리 위원회의 동물 보호 지침을 따릅니다.
1. 화학 준비
<ol><li>화학 물질을 (표 1 및 표의 재료)를 가져옵니다.</li>
	<li>100% 치 (LC100, 24 h)의 최소 농도 웜 100 %nonlethality (LC0, 24 h)의 최대 농도 대 한 개별 화학 물질의 최고 및 최저 복용량을 결정 합니다. (표 1)의 높은 농도의 6 희석 사용 합니다. 참고: LC100와 LC0는 새로운 화학 물질에 대 한 복용량을 결정 하기 위해 예비 웜 치 테스트9 실시 합니다.</li>
	<li>필요한 농도 x 2 K-중간 (자료 테이블)과 각 화학 물질을 희석. 컨트롤 K-매체를 사용 하 여 화학 물질에 의해 발생 하는 표현 형 변경 비교.<ol>
<li>예를 들어 카드뮴 염화 (CdCl2)의 7 그라데이션 농도 준비 (표 1). 2 배를 준비 하 높은 집중 된 수성 해결책 (4.64 mg/mL), K-중간의 8 ml에서 CdCl2 고체 분말의 92.8 mg를 녹이 고 가루는 완전히 해산 후 최대 10 mL를 채우기. K-매체와 희석 하 여 다른 농도 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>화학에서 모든 농도 대 한 8 개의 병렬 우물을 준비 합니다. 각 잘 화학 솔루션 x 2의 50 µ L를 포함합니다. (표 2) 컨트롤로 K-중간의 8 개의 병렬 우물의 적어도 3 개 그룹을 준비 합니다. 참고: 간단 하 게, 작업 솔루션 x 2의 500 µ L의 볼륨은 각 화학의 단일 투여에 필요한.</li>
</ol>2. 웜 준비
<ol><li>야생-타입 N2 웜 및 대장균 OP50 긴장 꼬마 유전학 센터 (CGC)에서 가져옵니다.</li>
	<li>동기화 된 L4 벌레를 얻을.<ol>
<li>조 흔 격판덮개에서 대장균 OP50의 단일 식민지를 선택 하십시오. Aseptically LB 국물의 100 mL에 식민지를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 그것을 성장합니다 참고: 대장균 OP50 솔루션은 이제 선 충 성장 매체 (NGM, 테이블의 재료) 판 시드를 위한 준비.</li>
		<li>NGM 90 m m 플라스틱 페 트리 접시에 붓으십시오. 각 씨앗 플레이트 대장균 OP50 솔루션의 300 µ L를 붓는 후 하루. 약 2-3 일 벌레의 대부분에는 성인 무대에 도달 했습니다 때까지 20 ° C에서 OP50는 NGM 접시에 N2 벌레를 품 어.</li>
		<li>살 균 H2o. 15 mL 원뿔 메 마른 분리기 관으로 수확 벗 웜 웜 2 분 이상에 대 한 진정, H2O, 발음 및 표 백제 버퍼 (자료 테이블)의 5 mL을 추가 하자.</li>
		<li>소용돌이 관 5 분 동안 회전 30 튜브 (1300 x g)에 계란, 작은 하는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>워시 살 균 H2O와 소용돌이의 5 mL와 함께 계란 튜브 5 s. 원심 분리기 튜브 30 (에서 1300 x g) s, 상쾌한, 제거 하 고 세척에 대 한에 대 한 다시.</li>
		<li>OP50와 새로운 NGM 접시에 계란 플라스틱 20 ° c.에서 그들을 품 어 모니터 부 화 L1 벌레 다음 아침; 벌레 약 40 h에서 L4 단계를 도달할 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>워시 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 K-매체와 90 mm 페 트리 접시에서 L4 벌레. 벌레는 stereomicroscope에서 K-매체의 100 µ L 당 40 동물의 농도 조정 합니다. 384-잘 접시의 각 음에 50 µ L (~ 20 벌레)를 추가 합니다. 이 동기화 된 벌레 (L4 단계) 화학 물질에 의해 다음 치료에 대 한 준비가 되었습니다.</li>
</ol>3. 화학 처리 및 비디오 캡처
참고: 384-잘 접시에 웜 (각 잘에서 50 µ L) 6 7 복용량의 개별 화학 (표 1)에 처리 됩니다. 8 병렬 웰 스, 각 (8 우물 가득 같은 화학 및 동일한 농도, 표 2) 모든 복용량에 대 한 화학 솔루션 x 2의 50 µ L을 포함 준비. 모든 비디오는 거꾸로 한 현미경 (자료 테이블)에 연결 된 디지털 카메라를 사용 하 여 수집 됩니다. 화학 치료 실험 24 시간 동안 지속 된다. 24 h 화학 치료 실험 기간 동안 각 잘에 세균성 음식을 추가 하지 마십시오.
<ol><li>화학 물질을 추가 하기 전에 자동 무대에 동기화 된 웜 384-잘 접시를 설정 하 고 프로그램된 인수 절차와 각의 동영상 (2 초당 7 프레임 s 스캔 각 접시 ~ 25 분 소요).</li>
	<li>섹션 1 각 음 (표 2)에 따라 준비 하는 화학 주식 x 2의 50 µ L를 추가 합니다. 시간 0 h 지점으로 설정 합니다.</li>
	<li>20 ° C에서 384-잘 접시를 품 어 고 인큐베이터 셰이 커에 80 rpm에서 그것을 흔들어.</li>
	<li>인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 자동 단계에 그것을 전송. 걸릴 동영상의 전체 판의 각 잘과 24 h, 12 h K-중간에 각 특정 화학 치료에 대 한 벌레의 고기를 확인. 약 25 분이 한 접시 화면에 대 한 필요 합니다.</li>
</ol>4. 실험 비디오 처리
참고: 실험 비디오 및 이미지 처리 프로그램 작성 되었고 포장. 그것은 ( 재료의 표참조) 자유롭게 다운로드 될 수 있다. 실험적인 비디오 이미지 프레임 시퀀스의 형태로 저장 되며 각 비디오의 프레임 시퀀스는 특정 디렉토리에 저장 됩니다. 프로그램 벌레를 인식 하 고 자동으로 고기를 계량 수 있습니다.
<ol><li>그래픽 사용자 인터페이스 (GUI, 그림 1)에서 프레임 시퀀스 디렉터리, 출력 디렉터리, 웜 크기 매개 변수 움직임 임계값 매개 변수 등의 매개 변수를 추가 합니다. 실험적 이미지 처리 분석 버튼을 클릭 합니다.<ol>
<li>소스 이미지 디렉터리를 선택 하려면 선택 단추를 클릭 합니다.</li>
		<li>인터페이스에서 중간 결과 디렉터리를 추가 합니다. 참고: 중간 결과 포함 된 이미지. 이러한 중간 결과 처리 된 이미지의 시각적 관찰에 대 한 유용 합니다.</li>
		<li>인터페이스에서 최종 결과 디렉터리를 추가 합니다.</li>
		<li>인터페이스에서 웜 크기 textbox에서 평균 웜 크기 매개 변수를 추가 합니다. 참고: 실험에 사용 된 크기 매개 변수는 2000.</li>
		<li>이동된 비율의 인터페이스에 추가 합니다. 참고: 비율 실험에 사용 되는 0.93입니다.</li>
		<li>이미지 처리를 시작 하려면 분석 버튼을 클릭 합니다. 추가 매개 변수를 재설정 버튼을 클릭 합니다. 참고: 정의 및 벌레에 대 한 계량 33 기능이 있습니다. 모든 정의 된 고기 ( 표 3에 나열 된) 범주에 의해 정렬 됩니다. 이러한 기능 실험 이미지에서 측정할 수 있습니다. 이러한 기능을 비교 하 여 다른 독성 있는 다른 화학 물질 중 양적 비교를 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li>
<li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li>
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<li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+effects+of+copper%2C+cadmium%2C+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

C. 선 충 의 장점은 독극물9, 모두 기계 연구와 높은 처리량 검열 방법의 증가 사용에 이르렀다. 독물학 연구에서 다른 모델 시스템 보완에 C. 선 충 에 대 한 증가 역할은 최근 몇 년 동안, 특히 새로운 화학 물질의 급속 한 독성 평가 대 한 놀라운 되었습니다. 이 문서에는 자동 식별 및 화학 독성의 평가 대 한 384-잘 접시에 고기를 벌레의 높은 처리량, 양적 심사의 새로운 분석 결과 제공합니다. 이 분석 결과 24 시간 내 화학 물질의 급성 독성 시험 고 subacute 독성 테스트도 더 많은 시간 포인트 데이터 수집 및 벌레에 음식 소스 (OP50)을 제공 하는 경우에 적용할 수 있습니다.
화학 물질을 희석 사용 매체가 다를 수 있습니다; 우리는 소피외. 를 참조 하 여 분석 결과에 K-매체를 선택 13. 웜 제어 및 화학 치료 그룹 ...

산업 생산 및 사람들의 일상 생활에 적용 하는 화합물의 급속 한 발전, 함께 그것은 독성 화학 물질에 대 한 모델을 테스트를 공부 하는 것이 중요. 대부분의 경우, 설치류 동물 모델 건강에 다른 화학 물질의 잠재적 독성을 평가 하기 위해 채택 된다. 일반적으로, 치명적인 농도 (즉, assayed 50% 치 사 량 [LD50] 다른 화학 물질의) 결정 시간이 소요 되 고 매우 비싼 vivo에서, 설치류 (쥐/마우스) 모델에서 전통적인 매개 변수로 사용 됩니다. 또한, 감소, 수정, 또는 교체는 동물 복지 및 윤리 중심 (3R) 원리, 더 높은 동물의 교체는 과학 연구1,2,3 가치를 허용 하는 새로운 방법 . C. 선 충 은 토양에서 격리 되어 자유 롭 살아있는 선 충 류 이다. 그것은 널리 사용 되었습니다 실험실에서 연구 유기 체로 짧은 수명, 쉽게 재배, 효율적인 복제 등의 유익한 특성 때문에. 또한, C. 선 충 에 기본적인 생리 적 프로세스 및 스트레스 응답을 포함 하 여 많은 기본적인 생물 학적 경로 높은 포유류4,5,,67 에 보존 됩니다. , 8. 우리와 다른 사람 만든 비교에, C. 선 충 독성 및 독성 설치류9관찰 사이 좋은 색인 이다. 이 모든 게 선 충 C. 화학 독성 vivo에서의 효과 테스트 하는 좋은 모델.
최근, 일부 연구 정량 C. 선 충의 phenotypic 특징. 화학2,,310 의 독성 벌레11의 노화를 분석 하는 기능을 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 경작 시스템 및 이미지 분석 시스템, 벌레는 다른 화학 치료12에서 384-잘 접시에 교양 있는 액체 벌레를 결합 하는 방법을 개발. 이 양적 기술 액체 매체와 384-잘 접시에 화학 치료의 12-24 h 후 C. 선 충의 33 매개 변수를 자동으로 분석 개발 되었습니다. 자동화 된 현미경 단계 실험 비디오 수집에 사용 됩니다. 벌레의 이동 행동에 관련 된 33 기능 계량 및 동영상 사용자 정의 설계 프로그램에 의해 처리 됩니다. 메서드는 10 화합물의 치료에서 벌레 고기를 계량 하는 데 사용 됩니다. 결과 표시 다른 독성 C. 선 충의 고기를 변경할 수 있습니다. 이러한 계량된 고기를 식별 하 여 다른 화합물의 급성 독성 예측 사용할 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 관찰과 실험 액체 문화에서 C. 선 충 의 phenotypic 정량화를 촉진. 이 메서드는 화학 독성 평가에 다른 화합물의 급성 독성을 예측 하 고 대 한 우선 순위 목록을 설정 형 quantifications C. 선 충 의 응용 프로그램에 대 한 더 전통적인 화학 독성 평가 설치류 모델에서 테스트합니다. 또한,이 방법은 독성 검사 및 식품 첨가제 에이전트 오염, pharmacautical 화합물, 환경 외 인 화합물, 그리고에 새로운 화학 물질 또는 화합물의 테스트에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2-프로판올</td><td>시그마-알드리치</td><td>59300</td><td></td></tr><tr><td>384웰 플레이트</td><td>Throme</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>아트로핀 황산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>PHL80892</td><td></td></tr><tr><td>표백제 완충액</td><td></td><td></td><td>0.5mL 10M NaOH 0.5mL, 5% NaClO 0.5mL, 초순수</td></tr><tr><td>카드뮴 클로라이드</td><td>9mL Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>202908</tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRm</td><td>Zeiss 현미경 검사 GmbH</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>구리(II) 황산</td><td>염 Sigma-Aldrich</td><td>451657</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24105</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>K-Medium</td><td></td><td></td><td>1 L 초순수 LB 국물에 NaCl 3.04 g과 KCl 2.39 g;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>10&nbsp; g/L&nbsp; 트립톤,&nbsp; 5&nbsp; g/L&nbsp; 누룩&nbsp; 추출물,&nbsp; 5&nbsp; g/L&nbsp; 나클&nbsp;</td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>NGM 플레이트</td><td></td><td></td><td>초순수 1L에 NaCl 3g, 17g, 펩톤 2.5g, 오토클레이브 후 콜레스테롤 1mL(에탄올 5mg/mL), MgSO4 1mL(1M), CaCl2 1mL(1M), PPB 완충액 25mL</td></tr><tr><td>펩톤</td><td>박토</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>시그마-알드리치</td><td>795496</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>시그마-알드리치</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>PPB 버퍼</td><td></td><td></td><td>35.6g, K2HPO4 108.3g, 1L 초순수 셰이커에 KH2PO4 108.3g</td></tr><tr><td></td><td>ZHICHENG</td><td>ZWY-200D</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>불화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>s7920</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>차아 염소산 나트륨 용액</td><td>시그마 알드리치</td><td>239305</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td> https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate <td>프로그램</td><td></td> 링크 시그마 알드리치 T7293 <td></td></tr><tr><td></td><td></td>효모 추출물 시그마 알드리치 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 자동 현미경&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Observer.Z1</td><td>Zeiss 독점 소프트웨어 Zen2012 및 CCD(Charge Coupled Device) 카메라가 있는 Zeiss 자동 마이크로스코</td></tr></tbody></table>

꼬마 선 충 의 프로 파일링 phenotypic 자동화 하 여 화학 독성의 예측에 대 한 높은 처리량 분석 결과

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

쥐 또는 쥐와 같은 더 높은 주문 유기 체에 화학 물질의 독성 시험 적용 시간과 비싼, 그들의 긴 수명 및 유지 보수 문제 때문입니다. 선 충 류 꼬마 선 충 (C. 선 충) 독성 시험을 위한 이상적인 선택 있도록 장점이 오히려: 짧은 수명, 쉽게 경작, 및 효율적인 복제. 여기, 우리는 자동 phenotypic 프로 파일링 C. 선 충 의 384-잘 접시에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 선 충 벌레 액체 매체 및 화학 치료, 384-잘 접시에 교양 있으며 동영상 33 웜 기능에 화학적 영향을 계량 하기 각 잘 찍힌다. 실험 결과 계량된 형 기능 분류 및 다른 화합물에 대 한 급성 독성을 예측 하 고 설정할 수 더 전통적인 화학 독성 평가 시험에 대 한 우선 순위 목록을 설치류 모델에서을 보여 줍니다.

10 개 이상의 화학 물질12의 다른 농도에 노출 하는 벌레의 고기 테스트 했습니다. 테스트에서 33 가지 기능 (0 h, 12 h, 그리고 24 h) 3 시간 시점에 각 화합물에 대 한 정량 했다. 이전에 매뉴얼 및 수명 분석 결과의 자동 분석 비교11,12이루어졌다. 이 분석 결과에서 우리는 화학 물질과 농도 영향을 미칠 수 웜 고기 발견. 이 방법의 개요는 그림 2에 표시 됩니다.
(그림 3 및 그림 4c, d) 결과 벌레 ...

양적 방법 확인 하 고 자동으로 꼬마 선 충의 phenotypic 프로 파일링 분석 하 여 화학 물질의 급성 독성 예측 개발 되었습니다. 이 프로토콜 384-잘 접시에 화학 물질과 웜 치료, 비디오, 캡처 및 독물학 관련된 고기를 계량 하는 방법을 설명 합니다.

꼬마 선 충 의 프로 파일링 Phenotypic 자동화 하 여 화학 독성의 예측에 대 한 높은 처리량 분석 결과

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

C.elegans 독성 분석은 가치가 있습니다. 이 프로토콜은 384웰 플레이트의 화학 물질로 C.elegans를 치료하고 비디오를 캡처하고 독성 관련 표현형을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 화학 물질의 잠재적인 급성 독성을 식별하고 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다.이러한 정량기술은 액체 배지를 가진 384웰 플레이트에서 12~24시간 화학처리 후 C.elegans의 33가지 파라미터를 자동으로 분석하기 위해 개발되었다. C.elegans는 새로운 화학 물질에 대한 신속한 독성 평가의 좋은 모델로 서 가치가 있다. 마우스로서, 식품 첨가제 오염, 제약 화합물, 환경 외인성 화합물 등으로 새로운 화학 물질의 독성 선별 및 테스트에 적용될 수 있다.프로토콜을 주의 깊게 읽고 항상 단계별로 따라 가면 좋은 프로토콜이 될 것입니다. 시각적 데모는 사용자가 각 단계의 작동과 작업의 결과를 쉽게 볼 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 장원징장과 가오차오 한이 될 것이다.그들은 내 실험실에서 대학원생입니다. 시작 하려면, 새로운 화학 물질에 대 한 예비 웜 치 사 율 테스트를 실시, 가장 높은 복용량을 결정 하기 위해, 그리고 가장 낮은 복용량, 100%치사율의 최소 농도, 그리고 100% 비 치사성. 이 실험을 위해, 염화물 카드뮴의 7 개의 그라데이션 농도를 준비합니다.가장 높은 농축 수성 용액의 2배를 준비하려면 K 배지 8밀리리터로 채워진 원심분리기 튜브에 92.8밀리그램의 염화물 고체 분말을 녹입니다. 혼합 소용돌이. 분말이 완전히 용해된 후 파이펫을 사용하여 최대 10 밀리리터를 채웁니다.K 배지로 희석하여 다른 농도 수준을 준비한다. 슈퍼 클린 벤치에서, 줄무늬 플레이트에서 E.coli OP50의 단일 식민지를 선택하고 식민지를 접종하기 위해 LB 국물의 100 밀리리터와 플라스크에 배치멸 균 팁을 사용합니다. 인큐베이터 셰이커에서 섭씨 37도에서 하룻밤 을 자랍니다.NGM을 90밀리리터 플라스틱 페트리 플레이트에 붓습니다. 대장균 OP50 용액 300 마이크로리터로 각 플레이트를 시드합니다. 대부분의 웜이 성인 단계에 도달할 때까지 약 20도에서 3일 동안 OP50을 NGM 플레이트에 N2 웜을 배양합니다.멸균물로 중력벌레를 15밀리리터 멸균 원심분리관으로 씻어 수확합니다. 벌레가 적어도 2 분 동안 정착하게하십시오. 물을 흡인하고 표백제 버퍼 5 밀리리터를 추가합니다.튜브를 5분 동안 소용돌이게 한 다음 원심분리기에 튜브를 넣고 달걀을 펠릿하는 데 30초 동안 1300의 상대원심력으로 회전합니다. 파이펫을 사용하여 슈퍼나티를 흡인합니다. 튜브에 멸균 된 물 5 밀리리터를 추가하여 계란을 씻고 튜브를 5 초 동안 소용돌이시십시오.1300의 상대 원심력에서 30 초 동안 튜브를 원심분리합니다. 상체를 제거하고 다시 세척하기 위해 살균 된 물의 5 밀리리터를 추가합니다. OP50이 있는 새로운 NGM 플레이트에 계란을 파이펫으로 피펫합니다.하룻밤 사이에 섭씨 20도에서 배양하십시오. 다음 아침, 부화 된 벌레는 L1 단계에 도달합니다. 약 40시간 후에 웜이 L4 단계에 도달합니다.K 배지를 사용하면 Petri 플레이트에서 L4 단원 벌레를 50밀리리터 멸균 원추형 튜브로 세척합니다. 파이프 50 마이크로 리터의 벌레 액체의 튜브에서 유리 슬라이드에. 스테레오 현미경하에서 파이펫을 사용하여 K 배지의 100 마이크로리터 당 약 40 마리의 동물로 웜의 농도를 조절합니다.384웰 플레이트의 각 웰에 준비된 배지의 50 마이크로리터를 추가합니다. 이러한 동기화 된 L4 단계 벌레는 화학 물질에 의한 치료를 받을 준비가되어 있습니다. 화학 물질을 추가하기 전에 자동 스테이지에 동기화된 웜과 함께 384웰 플레이트를 배치하고 프로그래밍된 획득 프로시저를 사용하여 비디오 카메라를 설정합니다.에서 384-잘 플레이트, 벌레는 각 개별 화학 물질의 6 ~ 7 복용량으로 처리 됩니다., 포함 하는 8 병렬 우물 50 모든 복용량에 대 한 두 번 화학 솔루션의 마이크로 리터. K배지의 8개의 평행웰중 적어도 3개의 그룹을 컨트롤로 준비한다. 각 웰에 대해 2배의 화학 용액50마이크로리터를 추가합니다.시간을 0시간 지점으로 설정합니다. 그런 다음 384웰 플레이트를 섭씨 20도, 분당 80개의 회전으로 설정된 인큐베이터 셰이커에 넣습니다. 원하는 시간 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 자동 단계로 옮김합니다.12시간, 24시간 후, 벌레의 표현형을 확인하기 위해 접시의 각 우물의 비디오를 촬영합니다. 실험 비디오 처리를 시작하려면 비디오 파일을 컴퓨터로 전송합니다. 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 선택 버튼을 클릭하여 소스 이미지 디렉토리를 선택합니다.중간 결과 디렉터리 추가합니다. 중간 결과에는 처리된 이미지의 시각적 관찰에 유용한 분할된 이미지가 포함됩니다. 인터페이스에 최종 결과 디렉터리추가합니다.인터페이스의 웜 크기 텍스트 상자에 평균 웜 크기 매개 변수를 2, 000으로 설정합니다. 인터페이스에서 이동 비율의 임계값을 0.93으로 설정합니다. 분석 버튼을 클릭하여 이미지 처리를 시작합니다.개발된 프로그램은 웜을 인식하고 표현형을 자동으로 정량화할 수 있습니다. 본 실험에서, 33개의 뚜렷한 특징은 3개의 시간 지점에서 염화물 처리에 대해 정량화되었다, 제로 시간, 12 시간, 및 24 시간. 실험적인 이미지는 벌레가 화학 농도가 증가함에 따라 더 빨리 죽었다는 것을 보여줍니다.처음에, 제어 및 화학 치료 사이 유의 한 차이가 없었다. 12시간의 치료 후, 고농도로 처리된 벌레는 낮은 농도 나 대조군보다 더 직선적이고 덜 곡선이 되었다. 웜 바디 커버 영역의 주요 축 길이는 시간이 증가함에 따라 증가했습니다.또한 주요 축과 작은 축 길이 모두에서 낮은 화학 농도에서 더 높은 화학 농도까지그라데이션 추세가 있습니다. 면적과 비율에 따라 웜의 운동성은 유사한 패턴을 보였다. 처음에는 큰 차이가 관찰되지 않았습니다.시간이 지남에 따라, 대조군내 의 벌레는 운동성에서 안정적인 감소를 보였다. 12 시간 및 24 시간 후에, 염화물 카드로 처리된 벌레는 대조군에 비해 운동성에 있는 중요한 다름을 보여주었습니다. 또한, 농도가 높은 치료법하에서 벌레는 낮은 농도 치료 하에 있는 벌레에 비해 연골이 약한 것으로 나타났다.요약하자면, 이 기술은 여러 영역에서 급속한 독성 평가의 방법을 포장합니다. 식품 매개 독성의 독성의 비상 분석, 제약 화합물의 안전 평가, 급성 독성 스크리닝, 새로운 화학 물질의 검출 및 환경 외인성 화합물의 검출에 방법을 적용할 수 있는 연구원. 염화물 카드뮴은 독성이 낮은 물질입니다.취급 하는 동안 장갑과 마스크를 착용 하 고 작동 지침을 따르십시오.

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연구

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Environment

환경

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

이 동영상은 급성 독성 치료법을 테스트하거나 독성 상태에 대한 내성을 위해 유전적 균주를 테스트하는 단기 생존 분석을 소개합니다. 예제 프로토콜은 파라콰트(PQ)에 의해 유발된 산화 스트레스에 저항하는 기생충의 능력을 테스트하는 생존 분석의 예를 보여줍니다.

C. 예쁜꼬마선충 생존 분석: 단기 독성 테스트

출처: Anderson, Q. L. et al. 고처리량, 고함량, 액체 기반 C. elegans 병리 시스템. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 숙주-병원체 상호 작용 중 유전자 녹다운을 연구하기 위해 Caenorhabditis elegans 를 사용하는 고처리량 스크리닝 방법을 보여줍니다. 녹다운 웜을 준비하고 이를 분석 플레이트로 옮겨 병원체 유발 웜 사멸의 효과를 평가하는 절차를 간략하게 설명합니다.

C. elegans 녹다운 스크리닝을 위한 멀티웰 액체 기반 분석

정량의 화학 주성 반응을 평가하는...

C. elegans의 주 화성 분석

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선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

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선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

모델 동물, 꼬마 선 충, 화학 물질의 독성을 평가 하는 기본 프로토콜을 설명 합니다. 방법은 편리 하 고 다양 한 환경 오염 물질의 위험 평가 관해서는 뿐만 아니라 의약품의 개발에 유용 합니다.

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높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

여기에서, 우리는 폴리글루타민 응집, 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동뿐만 아니라 다중 표현형의 예시적인 통합을 포함하는 예쁜꼬마선충에서 시험 화합물의 신경 보호 활성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시한다.

Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

배우세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 자동화된 표현형 프로파일링 방법으로 화학 물질의 급성 독성을 예측하는 고처리량 분석 기술입니다. 이 프로토콜은 독성학 연구에 활용됩니다.

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