Name: 곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 배우세요 고체 상태 NMR과 동적 핵 분극 기술을 사용하여 곰팡이 및 식물 재료의 원자 수준 구조를 분석하는 방법을. 이 기술은 항진균제 개발과 복잡한 생물계의 고해상도 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 NSF OIA-1833040를 통해 지원 되었다. 국가 높은 자기장 실험실 (NHMFL) DMR 1157490와 플로리다의 상태를 통해 국립 과학 재단에 의해 지원 됩니다. NHMFL에서 매스 DNP 시스템 S10 OD018519 NIH와 NSF 체-1229170에 의해 일부 자금입니다.

1. 13C, 15N 표시 Aspergillus fumigatus 성장의 액체 매체
<ol><li>레이블이 없는의 준비와 13C, 15N 표시 된 성장 매체 참고: 모두 효 모 추출 물 펩 포도 당 매체 (YPD)와 향상 된 최소한의 중간43 곰 팡이 문화 유지 관리를 위해 사용 되었다. 압력가 마로 소독 후 모든 단계는 오염을 최소화 하기 위해 층 류 후드에서 수행 됩니다.<ol>
<li>레이블이 없는 액체 매체의 준비: 6.5 g 100 mL의 증류수 그리고 134 ° c.에 25 분 압력솥에 YPD 분말의 분해</li>
		<li>레이블이 없는 단단한 매체의 준비<ol>
<li>100 mL의 증류수에 한 천의 YPD 분말 6.5 g 1.5 g을 추가 합니다.</li>
			<li>고압 121 ° C 그리고 멋진 약 50 ° c.까지 25 분 매체</li>
			<li>각 미리 살 균 플라스틱 페 트리 접시에 매체의 13-15 mL을 전송 하 고 즉시 뚜껑을 사용 하 여 요리를 커버.</li>
		</ol>
</li>
		<li>13C, 15N 표시 된 액체 매체의 준비 참고: 동위 원소 라벨, 13를 포함 하는 최소 매체에 대 한 성장 솔루션을 준비 하 C-포도 당 및 15N-나트륨 질산염 및 추적 요소 솔루션은 별도로 준비와 다음 혼합 사용 하기 전에.<ol>
<li>표 1에 나열 된 동위 원소를 포함 하는 최소 매체의 100 mL를 준비 합니다. 6.6 NaOH (1 M) 또는 HCl (1m) 솔루션을 사용 하 여에 pH를 조정 합니다.</li>
			<li>고압 121 ° c.에 25 분에 대 한 최소한의 매체</li>
			<li>100 mL를 준비 (1, 000 x) 성분 솔루션의 분해는 증류수에 표 2 에 나열 된 소금. 오토 클레이 브 134 ° c.에 25 분을 위한 솔루션 진정 하 고 단기 사용을 위한 4 ° C에서 솔루션을 저장 합니다. PH 약 6.5 되며 pH 미터를 사용 하 여 확인할 수 있습니다.</li>
			<li>사용 하기 전에 표 2 에 나열 된 성분 솔루션의 0.1 mL 13C, 15N 표시 된 최소 매체의 100 mL를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>곰 팡이 재료의 성장<ol>
<li>층 류 두건에 inoculating 루프를 사용 하는 YPD 접시에 저장소에서 버섯의 작은 금액을 전송 합니다. 인큐베이터에 2 일 동안 30 ° C에서 문화를 유지.</li>
		<li>Inoculating 루프를 사용 하 여 전송 13C에 활성 성장 균 가장자리, 층 류 두건에서15N 라벨링 솔루션. 떨고 인큐베이터에서 220 rpm에서 3-5 일에 30 ° C에서 문화를 유지.</li>
		<li>4000 x g 20 분 제거는 상쾌한에 centrifuge 고 펠 릿을 수집 합니다.</li>
		<li>트위터를 사용 하 여 수집 잘 수 화 된 펠 릿의 ~0.5 g (> 50 wt % 수 화) NMR 연구. 어떤 시점에서 수 분의 손실을 실질적으로 스펙트럼 분해능을 악화 됩니다. 참고: 필요한 경우, 수산화 사체의 소량 (0.1 g) 구분 고 후드 또는 수 화 수준 예측 하 고 건조 질량 백분율을 계산 하는 lyophilizer에서 N2 가스 흐름에서 완전히 건조. 일반적으로, 포함 하는 ~0.3 g 펠 렛 건조 질량 3 일 후에 얻어질 수 있다. NMR 실험 실시 긴 경우 (> 7 일) 또는 추가 처리 전에 곰 팡이 자료 10-20 분 동안 액체 N2 에 깊이 얼 수 있다 곰 팡이의 상태를 수정 하는 경우. 실험은 짧은 될 것입니다 (3-6 일), 동결 건너뛸 수 있습니다 샘플 신선한 남아 있을 수 있도록.</li>
		<li>원심 분리기 튜브에 글리세롤의 20% (v/v) 초과 소재를 믹스 하 고 장기 저장을 위한-80 ᵒC 냉동 실에 보관.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 솔리드 스테이트 NMR 및 DNP 연구 A. fumigatus 의 준비
<ol><li>고체 NMR 실험 A. fumigatus 의 준비<ol>
<li>13C, 15N 표시 된 곰 팡이 샘플 (단계 1.2.4.) 총 3 일 동안 성장 매체에서 작은 분자를 제거 하는 3.5 kDa 분자량 컷오프와 투 석의 가방을 사용 하 여 4 ° C에서 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.0)의 1 L에 대 한 dialyze 매일 두 번 버퍼를 변경 합니다. 참고: 또는 샘플 수 세척 될에 대 한 6-10 시간 잔여 작은 분자를 제거 하는 이온된 수를 사용 하 여.</li>
		<li>15 mL 튜브 및 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 5 분 (10000 x g) 원심 분리기 샘플을 전송 합니다. 상쾌한을 제거 하 고 나머지 균 자료를 수집.</li>
		<li>70-80 밀리 그램을 팩은 4 mm ZrO2 회전자 또는 NMR 실험에 대 한 3.2 m m로 터에 30-50 밀리 그램으로 균일 하 게 13C 표시 하 고 잘 수 화 된 샘플 붙여넣기. 반복적으로 부드럽게 금속 막대를 사용 하 여 샘플을 짜 내 고 종이 사용 하 여 초과 물을 흡수.</li>
		<li>단단히 터 모자 고 고체 NMR 특성화에 대 한 분석기에 샘플을 삽입 합니다. 참고: 새로운로 터는로 터 충돌의 가능성을 최소화 하 고 샘플 NMR 분 광 기에서 유출 하는 제안입니다. 필요한 경우, 씰링 나사와 일회용 켈리 F 삽입으로 터 내부 보조 컨테이너 역할을 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNP 실험 A. fumigatus 샘플의 준비<ol>
<li>13C,15N 표시 된 곰 팡이 샘플에 대 한 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 DNP 용29,44 (DNP 매트릭스 라고도 함)의 100 µ L를 준비 합니다. D8의 혼합물을 포함 하는이 DNP 매트릭스-글리세롤/D2O/H2O (60/30/10 Vol %). 참고: 레이블이 없는 샘플 하는 경우 조사, 준비 13C 고갈 d8을 사용 하 여 DNP 매트릭스-글리세롤 (12C3, 99.95%; D8, 98%)을 피하기 위해 13C D2O 및 H2O 신호는 용 매에서 기여.</li>
		<li>AMUPol45 양식 10 mM 급진적인 재고 솔루션 DNP의 100 µ L의 0.7 mg을 디졸브. 래 디 칼은 솔루션에 완전히 용 해 되도록 2-3 분 동안 소용돌이.</li>
		<li>AMUPol 솔루션의 50 µ L로 (2.1.1, 2.1.2 단계) 이전 단계에 설명 된 대로 dialyzed 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 재료의 10 mg을 흡수 하 고 약간 혼합 사용 하는 유 봉과 박격포에 래 디 칼의 침투를 갈기 다공성 세포 벽입니다. 참고: 수 분 손실의 속도 줄이기 위해, 연 삭 수 있습니다 또한 개최는 micropestle를 사용 하 여 microcentrifuge 튜브.</li>
		<li>곰 팡이 샘플 추가 수화물에 grinded 펠 릿에 급진적인 솔루션의 또 다른 30 µ L을 추가 합니다.</li>
		<li>3.2 m m 사파이어로 터에 펠 릿을 포장 하 고 약간 짜 초과 DNP 용 매를 제거. 3.2 m m 실리콘 플러그 수 분의 손실을 방지 하기 위해 추가 합니다. 일반적으로, 샘플의 5-30 mg로 터에 포장 될 수 있다 정확한 금액은 실시 NMR 실험의 감도 요구에 의해 결정 될 필요가 있다.</li>
		<li>삽입 및 DNP 분석기에서 샘플을 회전 마이크로파 방사선에서 DNP 강화 된 스펙트럼을 측정 하 고 전자 레인지에서 스펙트럼과 비교. 이 이어질 것입니다 한 향상 계수 ε온/오프는 20-40이 복잡 한 재료 이어야 한다. 세포 벽 구조를 결정 하는 설계 된 실험을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. NMR 및 DNP 연구를 위한 식물 바이오 매스의 준비
<ol><li>고체 NMR에 대 한 식물 재료의 준비<ol>
<li>13C 라는 식물 성장 챔버 또는 13C-포도 당 매체에서 앞에서 설명한46,47 13CO2 공급을 사용 하 여 내부를 균일 하 게 생산 또는 직접 레이블된 자료 구입 동위 원소 라벨 기업입니다. 참고: 13C-포도 당만 사용할 수 있습니다 어두운 성장에 12C의 소개를 피하기 위해 광합성에 의해.</li>
		<li>잘라는 13C 작은 조각 (차원에서 일반적으로 1-2 m m)으로 식물을 분류 하는 균일 하 게 실험실 면도날을 사용 하 여. 참고: 목적에 따라 추출 된 세포 벽은 가끔 사용 구조 특성화 고 상세한 프로토콜 이전 연구21,46에서 보고 됩니다.</li>
		<li>샘플은 이전 건조, 물 100 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 식물 재료의 30 밀리 그램에 추가 소용돌이, 1 일 실 온에서 equilibrate. 4000 x g 10 분에 centrifuge 고를 피 펫을 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다.</li>
		<li>샘플은 언제 든 지 결코 건조, 경우 직접 추가 치료 없이 샘플을 사용 합니다.</li>
		<li>고체 NMR 실험에 대 한 3.2 m m 또는 4mm ZrO2 로 터로 결과 식물 재료를 포장 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNP 연구에 대 한 식물 재료의 준비<ol>
<li>10 mm AMUPol 설명된 단계 2.2.1을 2.2.2로 급진적인 60 µ L 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>잘라는 균일 하 게 13C 라는 작은 조각 (차원에서 1-2 m m)으로 공부 될 식물 재료 실험실 면도날을 사용 하 여 및 식물 재료의 20 밀리 그램의 무게.</li>
		<li>손 갈기 식물 조각 작은 입자 (~ 1-2 m m 크기)에 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여. 최종 분말 동질적인 외관이 있다.</li>
		<li>40 µ L DNP 재고 솔루션의 준비 이전 단계 (2.2.2) 공장 설비 재료를 추가 하 고 약간 균질 급진적인 혼합 되도록 5 분에 대 한 갈기.</li>
		<li>더 연 삭 후 공장 설비 재료를 수 화를 재고 솔루션의 또 다른 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>DNP 실험에 대 한 3.2 m m 사파이어로 터에 equilibrated 공장 샘플 팩을. 수 분의 손실을 방지 하기 위해 실리콘 플러그를 삽입 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 탄수화물이 풍부한 생체 재료의 초기 특성 표준 고체 NMR 실험
참고: NMR 실험의 간략 한 개요는이 섹션에서 제공 됩니다. 그러나, 구조 설명에는 일반적으로 광범위 한 전문 지식이 필요합니다. 따라서, NMR spectroscopists와 공동 노력 것이 좋습니다.
<ol><li>측정 1 D 13C 교차 편광 (CP), 35-s 2-s와 13C 직접 분극 (DP) 재활용 지연과 1H-13C 무능48,49 스펙트럼은 동역학의 일반적인 이해를 세포 구성 요소 (그림 1a)의 분포. 세포 벽은 일반적으로 상대적으로 단단한 부분 하 고 CP 스펙트럼에서 지배적인 신호를 전시.</li>
	<li>일련의 표준 2D 13C-13C 상관 관계 실험 공명 할당 13C 신호를 측정 합니다. 일련의 1.5 ms RFDR52 (그림 1b) 등 50 ms 코드 공간을 통해 실험에 의해 지원 될 필요가 refocused 부적당 한50,51 탄소 연결을 얻기 위해 시작/DARR53 실험. 참고: 기본 또는 보조 세포 벽, 풍부한 특정 구성 요소, 예를 들어 샘플을 찾을 수 관심의 경우 다음 여러 세그먼트 또는 여러 식물 해야 최적의 구성으로 샘플을 찾을 수 별도로 측정 되어야 합니다.</li>
	<li>단백질과 nitrogenated 탄수화물의 공명 할당을 촉진 하기 위하여 측정 될 수 있는 2D 15N-13C 상관 관계 실험을 실시 합니다. 참고: 공명 할당은 일반적으로 시간이 많이 걸리는. 메서드는 현재 탄수화물 신호 사전 경험 없이 그 과학자의 공명 지정을 촉진 하기 위하여 개발 되 고 있습니다.</li>
	<li>보다 전문적인된 실험 공간 근거리 (그림 1 c, d), 수 화 및 mobilities로 탄수화물이 풍부한 재료의 3 차원 구조를 결정 하는 복잡 한 생체의 결정을 측정합니다 체계적으로 기술 이전2922,.</li>
</ol>

공개 하는 것이 없다.

생 화 확 적인 방법에 비해, 고체 NMR 장점이 아닌-파괴 및 고해상도 기술로. NMR 작곡 분석, 양적 이며 또한 대부분의 다른 분석 방법과 달리 않습니다는 불확실성에 의해 소개 되지 biopolymers의 한정 된 가용성. 현재 프로토콜의 탄수화물이 풍부한 바이오 소재 및 기능성된 고분자에 대 한 미래의 연구를 촉진 한다. 그러나, 그것은 유의 공명 할당 및 데이터 분석 시간이 많이 소요 될 수 있습니다 및 일반적으로 체계적인 훈련을 요구 하십시오. 저자는 현재 개발 도구가이 장애물을 극복 하기 위해 사전 경험 없이 과학자 수 있도록 데이터베이스.
13C의 자연 동위 원소 풍부 1.1%만 이기 때문에, 관찰 하는 13C-13C 피크 재료 레이블 없음 사용 하 여 크로스 확률이입니다만 0.012% (1.1 x 1.1%)를 사용 하 여 균일 하 게 샘플을 표시. 따라서, 실질적으로이 프로토콜을 사용 하 여 달성 하는 동...

탄수화물은 에너지 저장, 구조 건물, 및 세포 인식 및 접착 등 다양 한 생물학 과정에서 중심 역할을 한다. 그들은 세포 벽에 식물, 균 류, 조류, 박테리아1,2,3의 기본적인 구성 요소는 농축 됩니다. 세포 벽 역할을 항균 요법4,,56,7,8 대 유망 대상으로 바이오 연료 및 바이오 소재의 생산에 대 한 중앙 소스 , 9.
이러한 복잡 한 자료의 현대 이해는 수 십년의 4 개의 주요 생 화 확 적인 또는 유전자 방법을 사용 하 여 구조적 특성에 전념 했다 노력에 의해 실질적으로 고급 되었습니다. 첫 번째 주요 방법 의존 순차적 치료 가혹한 화학 물질이 나 효소를 사용 하 여 다른 부분으로 세포 벽을 무 너 뜨 리는 뒤에 작곡 및 각 분수10에서 설탕의 연계 분석. 이 방법은 고분자, 도메인 배포에 광명 하지만 해석 생체의 화학 및 물리적 특성으로 인해 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 예를 들어 알칼리 추출 물 분수 유래와 비교 해도 덜 구조화 된 분자의 단일 도메인에서 또는 공간적으로 분리 된 분자에서 여부를 결정 하기가 어렵습니다. 둘째, 추출 된 부분 또는 전체 세포 벽 또한 측정 될 수 있다 또한 다른 분자11,12,13, 사이의 가교 되 나 공유 결합을 솔루션 NMR을 사용 하 여 14,15. 이 방법에서는, 화학식 앵커의 상세한 구조를 탐색할 수, 있지만 제한 류, 상대적으로 적은 수의 가교 사이트 및 안정화 비 공유 효과의 무지의 낮은 용 해도 인해 있을 수 있습니다. 다 당 류 패킹, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 정전기 상호 작용 및 폴리머 녹 채를 포함 하 여. 셋째, 바인딩 선호도 결정 있다 생체 외에서 사용 하 여 절연된 류16,,1718,19, 정화 절차를 실질적으로 변경할 수 있습니다. 구조와 이러한 생체의 속성입니다. 이 메서드는 또한 정교한 증 착 및 생 합성 후 고분자의 어셈블리를 복제 하도록 실패 합니다. 마지막으로, 표현 형, 세포 형태학 및 특정 세포 벽 구성 요소의 감쇠 생산 유전 돌연변이의 기계적 성질 류의 구조 기능에 조명 하지만 더 분자 증거 이러한 다리 필요 단백질 기계20의 조작된 기능을 가진 거시적인 관측.
개발 및 응용 프로그램 다차원 고체 NMR 분광학의 최근 발전 구조 퍼즐을 해결 하기 위한 독특한 기회를 도입 했습니다. 2D/3D 고체 NMR 실험 구성의 고해상도 조사 및 주요 섭 동 하지 않고 기본 상태에서 탄수화물이 풍부한 재료의 아키텍처를 사용합니다. 1 차 및 2 차 세포 벽 식물, 촉매로 처리 바이오 매스의 구조 연구가 성공적으로 실시 되어 세균의 biofilm 안료 유령 버섯에 그리고, 최근에 작가, 병원 성 균 류에서 그대로 세포 벽에 의해 Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. 동적인 핵 분극 (DNP)32,33,34,35,36,,3738 의 개발 , 39 , 40 , 41 , DNP로 감도 향상 현저 하 게 단축에 이러한 복잡 한 생체 실험 시간 42 실질적으로 NMR 구조 설명을 촉진 한다. 여기에 설명 된 프로토콜 동위 원소 레이블 A. fumigatus 곰 팡이 및 곰 팡이 준비 절차 및 공장 샘플 고체 NMR 및 DNP 특성화에 대 한 자세히 설명 합니다. 유사한 라벨 절차 변경 된 매체와 다른 균에 적용 되어야 합니다 그리고 샘플 준비 절차 다른 탄수화물이 풍부한 생체 재료에 일반적으로 적용 되어야 합니다.

<table><tbody><tr><td>암모늄 몰리브덴 데이트 테트라하이드레이트</td><td>Acros Organics</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>분석 계량 저울</td><td>Ohaus</td><td>B730439218</td><td>모델 PA84C</td></tr><tr><td>Bioclave 16 L</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Labconco corporation</td><td>302319100</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>BDH9222</td><td>15-30 &deg에 매장; C</td></tr><tr><td>코발트 (II) 염화물 육수화물</td><td>Honeywell|플루카</td><td>60820</td><td>&ge; 98 %</td></tr> <tr><td>구리 (II) 황산염 5 수화물</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge; 98 %</td></tr> <tr><td>코닝 LSE 진탕 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>시그마 Aldrich</td><td>151882</td><td>99.9 원자 % D</td></tr><tr><td>d6-DMSO</td><td>시그마 Aldrich</td><td>151874</td><td>99.9 원자 % D</td></tr><tr><td>d8-glycerol</td><td>시그마 Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge; 99 원자 % D</td></tr><tr><td>투석 튜빙 3.2 kDa</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>인산 디칼륨</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G5516</td><td>&ge; 99.5 %</td></tr><tr><td>Heraus Megafuge 16R 원심분리기</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>750004271</td><td>Maximum RCF 25,830 x g</td></tr><tr><td>HR-MAS 일회용 인서트 키트</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge; 99+ %</td></tr> <tr><td>황산 마그네슘 헵타 하이드레이트</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>18-26 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>망간 (II) 염화물 테트라 하이드레이트</td><td>Alfa Aesar</td><td>11563</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>모노포타슘 포스페이</td>트 <td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>pH 미터</td><td>Mettler Toledo</td><td>B706689216</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge; 99.5 %</td></tr><tr><td>아연 황산염 헵타하이드레이트</td><td>알파 에자르</td><td>33399</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>12C3, d8-glycerol</td><td>케임브리지 동위원소 연구소</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td></tr><tr><td>13C6-포도</td>당 <td>시그마 Alrdrich</td><td>364606</td><td>&ge; 99 % (CP)</td></tr><tr><td>15N-질산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>364606</td><td>&ge; 98 % 15N, &ge; 99 (cp)</td></tr> <tr><td>3.2mm 사파이어 NMR 로터</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>3.2mm 실리콘 플러그</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>4mm MAS 로터 키트</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>지르코니아</td></tr></tbody></table>

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 nmr을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

이 프로토콜 보여줍니다 얼마나 균일 하 게 13C, 15N 표시 된 곰 팡이 자료 수 생산과 실험 어떻게이 부드러운 소재 고체 NMR 및 감도 향상 DNP 진행 한다. 식물 바이오 매스의 샘플 처리 절차 또한 상세한입니다. 이 방법을 사용 하면 일련의 1d 및 2D 13C-13C의 측정 /15N 상관 관계 스펙트럼, 최소한의 섭 동으로 그들의 네이티브 국가에서 복잡 한 생체 재료의 고해상도 구조 설명 있습니다. 동위 원소 라벨 1d 스펙트럼의 강도 및 2D 상관 관계 스펙트럼에 분극 전송 효율을 측정 하 여 시험 될 수 있다. 동적인 핵 분극 (DNP) 샘플 준비의 성공 감도 향상 요인에 의해 평가할 수 있습니다. 다 당 류와 단백질의 구조적 측면을 검토 하는 추가 실험 3 차원 구조의 모델 이어질 것입니다. 이러한 메서드를 수정 및 탄수화물이 풍부한 재료, 식물, 균 류, 조류, 박테리아의 자연 세포 벽을 포함 하 여 뿐 아니라 합성 또는 탄수화물 중합체 및 다른 그들의 복잡 한 디자인의 넓은 범위를 조사 하기 위해 적응 수 있습니다. 분자입니다.

실질적으로 NMR 감도 강화 하 고 2D 13C-13C와 13C-15N 상관 관계 스펙트럼 분석 구성, 수 화, 이동성을 일련의 측정 및 포장의 가능 하 게 동위 원소 라벨 중합체 세포 벽 구조 (그림 1)의 3 차원 모델을 생성 하는 통합 된 것입니다. 성공 하면 균일 한 라벨 1 D 13C와 15N 스펙트럼의 완전 한 세트는 1 시간 이내 수령 하실 수 없습니다 그리고 각 표준 2D 스펙트럼 측정의 24 시간 보다 더 이상 걸릴 해야 합니다.
잘 준비 된 샘플은 일반적으로 모두 높은 NMR 농도 기대 하 고 날카로운 라인. 변수 매개 변수의 손상 되지 않은 최적화 된 샘플 준비를 나타냅니다....

다차원 고체 NMR 분광학 및 동적인 핵 분극 (DNP) 조사 13C,15N 표시 된 곰 팡이 및 식물 견본을 준비 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

이 프로토콜은 고체 핵 자기 공명, 또는 NMR, 및 동적 핵 편광, 또는 DNP, 복잡한 생물 시스템 특성화를 위한 실험을 위한 곰팡이 및 식물 물질을 준비하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 우리가 그들의 네이티브 환경에서 원자 해상도 수준에 생물 물질을 조사 할 수 있습니다, 예를 들어, 전체 세포에서. 곰팡이 재료에 대한 고해상도 구조 정보의 수집은 항진균 제 개발에 도움이 될 것입니다.이 방법은 곰팡이 세포벽에서 복잡한 탄수화물의 구성 및 구조에 대한 통찰력을 제공하며 식물, 곰팡이, 조류 및 박테리아를 포함한 많은 탄수화물이 풍부한 유기체에 적용 될 수 있습니다. 몇몇 조사자는 그들의 세포 문화에 있는 곰팡이 오염으로 투쟁할 수 있습니다. 내 조언은이 오염을 방지하기 위해 사용하기 전에 매체와 장비를 철저히 살균하는 것입니다.이 데모는 NMR 또는 세포 배양에 경험이 거의 없는 조사관이 곰팡이 및 식물 시스템에서 이러한 기술을 구현하는 방법을 배우는 데 도움이 될 것입니다. 라벨이 없는 액체 성장 매체를 준비하려면 6.5그램의 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 또는 YPD 분말을 증류수 100밀리리터에 녹인 다음 134°C에서 25분 동안 생성된 용액을 오토클레이브하십시오. 라벨이 부착되지 않은 고체 성장 매체를 준비하려면 6.5그램의 YPD 한천 분말을 증류수 100밀리리터에 넣고 중간을 섭씨 121도에서 25분 동안 오토클레이브한 후 중간을 섭씨 약 50도까지 냉각시킵니다.그런 다음, 녹은 고체 성장 매체의 13~15밀리리터를 개별 멸균 플라스틱 페트리 접시에 옮기고, 즉시 뚜껑을 접시에 놓습니다. 탄소-13, 질소-15 라벨 액체 성장 매체를 준비하기 위해, 필요에 따라 산 또는 염기로 6.6의 pH에 최소 배지를 함유하는 동위원소의 100밀리리터 부피를 조정한다. 다음으로, 테이블에 나열된 소금을 증류수 100밀리리터에 녹이고, 탄소-13, 질소-15 라벨액체 성장 매체에 추가하고, 121°C에서 25분 동안 생성된 용액을 오토클레이브한다.용액이 실온으로 냉각되면 100 마이크로리터의 미량 원소 용액을 탄소-13, 질소-15 라벨최소 배지의 전체 부피에 추가합니다. 곰팡이 재료를 성장시키기 위해, YPD 접시에 저장에서 곰팡이의 소량을 전송하는 접종 루프를 사용하고, 30섭씨 인큐베이터에서 이틀 동안 곰팡이를 배양. 인큐베이션의 끝에서, 탄소-13, 질소-15 라벨 액체 성장 매체에 활성 성장 곰팡이 가장자리를 전송하고, 흔들리는 인큐베이터에서 3 ~ 5 일 동안 분당 30도 및 220 회전에 문화를 배치하는 새로운 접종 루프를 사용합니다.다량의 곰팡이가 플라스크 바닥을 덮고 액체에 떠있는 경우 원심 분리로 곰팡이를 수집하고 상퍼를 폐기하십시오. 적절한 용액으로 펠릿을 수화하고, 포셉을 사용하여 NMR 및 DNP 분석을 위해 잘 수화된 펠릿의 약 0.5 그램을 수집합니다. 그런 다음, 나머지 물질을 원물 튜브에 20% 글리세롤 용액과 혼합하고 곰팡이 샘플을 영하 80도의 영하로 배치하여 장기 보관을 합니다.고체 NMR 분석을 위해 A.fumigatus를 준비하기 위해 먼저 3.5킬로달톤의 분자량 차단이 있는 투석 백을 사용하여 0.5그램 탄소-13, 질소-15 라벨이 부착된 곰팡이 샘플을 3일 동안 섭씨 4도에서 10밀리머 포산염 버퍼1리터에 투석합니다. 투석이 끝나면 원심분리를 위해 15밀리리터 튜브로 샘플을 옮기고, 균일하게 탄소-13 라벨이 부착되고 수분이 잘 수화된 샘플 페이스트를 70~80밀리그램으로 4mm 지르코늄 이산화저로 포장합니다. 금속 막대를 사용하여 샘플을 부드럽고 반복적으로 짜서 종이를 사용하여 여분의 물을 흡수합니다.그런 다음 로터를 단단히 캡하고 샘플을 분광계에 삽입하여 솔리드 스테이트 NMR 특성화를 합니다. DNP 분석을 위한 A.fumigatus를 준비하려면 탄소-13당 1.5밀리리터 미세센심분리기 튜브에 100마이크로리터를 추가하고, 탄소-15라벨이 부착된 진균 샘플, 각 튜브에 0.7밀리그램의 편광제를 용해하여 10mm+라디칼 스톡 솔루션을 형성합니다. 라디칼이 용액에 완전히 용해되도록 2~3분 동안 소용돌이를 일으키고, 편광제 용액의 50마이크로리터에 투석된 탄소 13, 질소-15 라벨이 부착된 곰팡이 샘플을 담그고, 유봉과 박격포를 사용하여 다공성 세포 벽에 래디칼의 침투를 보장하기 위해 혼합물을 약간 연마합니다.진균 샘플을 더 수화하고 펠릿을 3.2mm 사파이어 로터에 포장하기 위해 진층 펠릿에 급진적 인 용액30 마이크로 리터를 추가합니다. 시연된 대로 약간 짜서 과도한 DNP 용매를 제거하고 3.2mm 실리콘 플러그를 추가하여 수분 공급손실을 방지합니다. 그런 다음 일상적인 실험을 위해 NMR 분광계또는 전자레인지 조사 하에서 DNP 강화 스펙트럼을 측정하기 위한 DNP 분광계에 로터를 추가합니다.DNP 연구를 위한 식물 재료를 준비하려면 면도날을 사용하여 균일하게 탄소 13라벨이 부착된 식물 재료를 1~2mm 조각으로 자른다. 박격포와 유봉을 사용하여 최종 분말이 균일한 모양이 될 때까지 조각을 작은 입자로 갈아냅니다. 10밀리머 라디칼 스톡 솔루션 40마이크로리터를 식물 소재에 추가하고, 5분 동안 샘플을 가볍게 갈아서 라디칼과 균일한 혼합을 보장합니다.고지 샘플을 라디칼 스톡 솔루션의 20 마이크로리터로 수화하고, DNP 분석을 위해 3.2밀리미터 사파이어 로터에 평형 식물 샘플을 포장합니다. 그런 다음, 수분 공급의 손실을 방지하기 위해 실리콘 플러그를 삽입하고, DNP 분광계에 샘플을로드합니다. 동위원소 라벨링은 NMR 민감도를 실질적으로 향상시키고 세포벽 건축의 3차원 모델 의 생성을 위한 조성, 수분, 이동성 및 포장을 분석하기 위해 일련의 2차원 탄소-13-탄소-13 및 탄소-13-질소-15 상관 스펙트럼을 측정할 수 있게 한다.2D 탄소-13-탄소-13 스펙트럼에서 오프 대각선 신호를 얻기 어려운 경우 통계 라벨링이 발생했을 수 있습니다. 2개의 탄소-13 봉우리96 및 백만당 92 부(parts)는 포도당의 대표적인 탄소-1 신호입니다. 따라서, 35초의 긴 재활용 지연으로 측정된 정량적 탄소-13 직접 편광 스펙트럼에서의 강한 강도는 전형적으로 불완전한 투석 또는 세척으로 인한 소분자의 지배력을 나타낸다.잘 표지된 시료를 사용하면 생체 분자의 공간 근접성을 감지하고 그대로 세포벽의 구조 모델을 구성하기 위해 장거리 상관 관계를 더 측정할 수 있습니다. 이 기술은 많은 자연 발생 및 엔지니어링 재료의 구조 기능을 탐구할 수 있게 해주며, 탄수화물이 풍부한 생체 재료 및 기능성 폴리머에 대한 향후 연구를 용이하게 합니다. 일부 곰팡이는 인간에 있는 감염 또는 체계적인 질병을 일으키는 원인이 될 수 있기 때문에, 보호를 위해 라미나르 흐름 후드에 있는 곰팡이 물질을 취급하고 노출을 최소화하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

공중 식물 장기는 표피, supramolecular biopolyester - 왁스 어셈블리의 보호를받습니다. 우리는 고체 NMR 및 원자 힘 현미경에 의한 분자와 마이크로 저울에 토마토 과일 손톱에서의 선택적 제거 에피와 intracuticular 왁스, 각각을 모니터링하고, 공학 cuticular biopolyesters의 가교 능력을 평가하기 위해 프로토콜을 소개합니다.

분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

용해 동적 핵 분극(DNP)이 제공하는 감도 향상으로 NMR 및 MRI에 의해 실시간으로 대사 과정을 수행할 수 있습니다. 효소 반응 연구를 위해 설계된 전용 용출 DNP 설정의 특성과 성능에 대해 설명합니다.

NMR에 의해 실시간 효소 반응 속도 측정을위한 해산 동적 핵 편광 계측

이 프로토콜은 효소(엔톡실라나아제) 가수분해 전에 RE에 2개의 아미노벤즈아미드를 태그한 다음 질량 분석법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 결과 올리고당을 분석함으로써 헤테록실란의 말단(RE) 및 내부 영역 글리코실 서열의 구조적 특성화에 사용되는 특정 기술을 설명합니다.

효소 적, 화학 (메틸화) 및 물리 (질량 분석, 핵 자기 공명) 기법을 사용하여 공장 벽 Heteroxylans의 연속

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

여기에 제시된 것은 동결된 시료를 동적 핵 편광(DNP) 매직 앵글 방적(MAS) 핵자기 공명(NMR) 프로브로 전송하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜에는 실험 전의 로터 저장 방향과 실험 전후의 생존 가능성 측정을 위한 방향이 포함됩니다.

셀룰러 생존력을 보존하는 마법의 각도 회전 핵 자기 공명 분광기에 극저온 샘플 로딩

31 P NMR은 폴리페놀의 구조적 용해를 위한 강력한 도구입니다. 리닌과 탄닌의 다양한 유형의 하이드록시, 페놀 및 카박스실 그룹의 정량화 및 분화를 허용하는 빠르고 쉽고 정밀하며 정량적이며 매우 재현 가능한 분석 절차가 이제 일상적인 분석 도구가 되었습니다.

리닌과 탄닌의 정량적 31P NMR 분석

이 논문은 식물의 대사 프로파일링에서 PSYCHE 및 SAPPHIRE-PSYCHE의 사용을 제시하고 샘플 준비 및 최적의 Pure Shift NMR 스펙트럼 기록에 대한 자세한 절차를 포함합니다. 동핵 디커플링에 의해 달성된 분해능의 이득을 통해 시스템을 보다 포괄적으로 이해할 수 있는 예가 논의됩니다.

Pure Shift 핵 자기 공명: 식물 대사체학을 위한 새로운 도구

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

이 프로토콜은 맞춤형 생물반응기 시스템을 과분극 ¹³C NMR 분광법과 통합하여 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사를 측정함으로써 대사 연구 및 약물 스크리닝 응용 분야의 재현성과 운동 정확도를 개선합니다.

과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

X선 자유전자 레이저 및 싱크로트론 소스에서 연속 결정학을 위한 지질 입방상의 막 단백질 미세결정의 준비 및 전달 절차를 설명합니다. 이러한 프로토콜은 또한 용해성 단백질 미세결정의 통합 및 전달에 적용할 수 있으며, 이로 인해 액체 주입에 비해 샘플 소비를 크게 줄일 수 있습니다.

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

배우세요 고체 상태 NMR과 동적 핵 분극 기술을 사용하여 곰팡이 및 식물 재료의 원자 수준 구조를 분석하는 방법을. 이 기술은 항진균제 개발과 복잡한 생물계의 고해상도 연구에 활용됩니다.

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

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