Name: 타입-1 당뇨병에 대 한 의약품 후보 백신의 빨간 사탕 과도 식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 식물 기반 재조합 단백질 생산을 활용한 타입-1 당뇨병 경구 백신 후보 개발 방법입니다. 적색비트 잎을 동결건조하여 고수율의 포토항원을 축적하고 경구 내성 유도 효능을 평가하는 혁신적인 면역학 기술을 탐색합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 공동 프로젝트 "자가 면역 당뇨병 식용 백신 (eDIVA)의 생산을 위한 식물의 사용"에 의해 지원 되었다 (프로젝트 ID: 891854) 베로나 대학 전화 2014의 프레임 워크에 의해 자금.

1. 붉은 사탕 무 우와 시금치 재배
<ol><li>붉은 사탕 무 우 성장 (B. vulgaris 이력서 물 랑 루즈), 시금치 (S. 올레라케아 이력서 산업) 식물 성장 챔버에 각각 23/21 ° C에서의 빛의 강도, 65% 상대 습도, 명암 주기 12 h 150 µE를 사용 하 여.</li>
	<li>씨앗 발 아 후 거 름 식물 상용 비료 (자료 테이블)의 1 g/L 해결책으로 일주일에 두 번. Agroinfiltration에 대 한 5 주 된 시금치 및 6 주 오래 된 빨간 무 우 식물을 사용 합니다.</li>
</ol>2. 과도 식 deconstructed 식물 바이러스 기반 기술을 통해
<ol><li>공장 식 벡터의 건설<ol>
<li>벡터-5' 모듈 (pICH20111), 3' 모듈 (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut 및 pICH7410.eGFP), 앞에서 설명한1,,27, 준비 및 integrase 모듈 (pICH14011)-소개 Agrobacterium tumefaciens GV3101 변형 표준 기술을 사용 하 여. 28 ° c.에 2 일 동안 50 μ g/mL 리 팜 피신과 적절 한 벡터 특정 항생제 (50 μ g/mL carbenicillin pICH20111, pICH14011 및 pICH7410.eGFP), pICH31070에 대 한 50 μ g/mL 대를 포함 하는 파운드 매체에 성장</li>
		<li>식민지 각 벡터에 대 한 다음과 같은 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 식민지 화면: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3', 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' 모듈 pICH31070.GAD65mut 및 pICH31070.∆87G65mut, 55 ° C의 어 닐 링 온도 110의 신장 시간 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3', 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 세 번째 3' 모듈 pICH7410.eGFP, 53 ° C의 어 닐 링 온도와 30의 신장 시간에 대 한 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3', 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' 53 ° C의 어 닐 링 온도와 20 s와 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3의 신장 시간 5' 모듈 ' 및 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' 57 ° C의 어 닐 링 온도와 45의 신장 시간 integrase 모듈에 대 한 s.</li>
		<li>다음 특정 반응 주기를 사용 하 여 20 μ의 전체 볼륨에 PCR 반응을 수행: 5 분 초기 변성 95 ° C에서 30의 35 주기 s 95 ° C, 30에서 어 닐 링 온도 72 ° C에서 신장 단계에서 s (어 닐 링 온도 신장 시간을 다시 각 뇌관 커플에 대 한 특정) 및 72 ° c.에 7 분의 최종 신장 단계</li>
	</ol>
</li>
	<li>주사기 agroinfiltration<ol>
<li>3 A. tumefaciens transformants 파운드 중간 포함 50 μ g/mL 리 팜 피신 및 다음 적절 한 벡터 특정 항생제의 50 mL에 접종: A. tumefaciens pICH20111와 변형에 대 한 50 μ g/mL carbenicillin pICH14011 또는 pICH7410.eGFP, 또는 50 μ g/mL 대 A. tumefaciens pICH31070와 변형에 대 한. 28 ° c.에 하룻밤 떨고에 의해 성장</li>
		<li>20 분 동안 4500 x g 에서 원심 분리 하 여 하룻밤 세균성 문화를 작은 고 10 m m 4-morpholineethanesulfonic 산 (MES, pH 5.5)을 포함 하는 침투 버퍼의 100 mL (또는 초기 세균성 문화의 두 개의 볼륨)에 그들을 resuspend 및 10 m m MgSO4, 마약을 고려 하지 않고600. 실 온 (RT) 3 h에서 정지를 품 어.</li>
		<li>모듈 중 하나는 3, GAD65mut, ∆87GAD65mut 또는 eGFP 3', 5' 모듈 모듈과 integrase 모듈을 포함 하는 세균성 정지의 동등한 볼륨 믹스. 서 스 펜 션 믹스를 사용 하 여 붉은 사탕 무 우와 시금치 잎의 주사기 침투에 대 한.</li>
		<li>바늘 없는 주사기에는 서 스 펜 션의 5 mL을 배치 합니다. 시금치와 붉은 사탕 무 우 식물, 나뭇잎의 밑면에 대 한 주사기의 끝을 누르고 한편 잎의 다른 쪽에 부드러운 counterpressure을 적용.</li>
		<li>각 식물에 대 한 정점에서 시작 처음 세 완전히 확장 된 잎을 침투 하 고 잎 줄기에 종이 태그와 agroinfiltrated 잎 레이블을 지정 합니다. 표준 조건 하에서 성장 챔버에 식물을 반환 합니다. 참고: 건강과 안전 이유를 위한 착용 장갑과 눈 보호 침투 과정.</li>
		<li>수집 agroinfiltrated 14 일 게시 감염 (dpi) 액체 질소에서 그들을 고정 하는 4에서 출발 한다. -80 ° c.에 게 식물 조직</li>
	</ol>
</li>
	<li>진공 agroinfiltration<ol>
<li>28 ° c.에서 밤새 흔들어 파운드 매체 50 μ g/mL 리 팜 피신 및 적절 한 벡터-특정의 50 mL에 별도로 3 A. tumefaciens transformants 항생제 성장</li>
		<li>20 분에 4500 x g 에서 원심 분리 하 여 펠 릿 하룻밤 세균성 문화 침투 버퍼 0.35의 OD600 의 1 L에 펠 릿을 Resuspend 고 3 h에 대 한 실시간에 정지를 품 어.</li>
		<li>각 정지에 (폴 20) 세제의 0.01 %v / v를 추가 합니다. 모듈 중 하나는 3, GAD65mut, ∆87GAD65mut 또는 eGFP 3', 5' 모듈 모듈과 integrase 모듈을 포함 하는 세균성 정지의 동등한 볼륨 믹스.</li>
		<li>삽입 한 공장 (6 주 오래 된 빨간 사탕 무 공장, 섹션 1을 참조) 소유자에서. 홀더를 반전 하 고 침투 목욕 잠수함 침투 정지에서 잎 (2 패)를 포함 하는 비 커 위에 배치 합니다. 주: 모든 나뭇잎 세균 현 탁 액에 담근 완전히는 확인 하십시오. 필요한 경우 추가 침투 정지의 추가 레벨을 올립니다.</li>
		<li>침수 식물 침투 목욕 침투 실로 전송 하 고 그것을 닫습니다. 진공 펌프를 켜고 침투 챔버에 진공 흡입구 밸브를 엽니다.</li>
		<li>일단 90 mbar 침투 약 실에 있는 압력 감소 했다, 계속 3 분 출시에 대 한 진공 진공 45에 대 한 s. 침투 챔버는 대기압에 반환에, 일단 챔버를 열고 욕조에서는 세균 침투 식물을 제거 합니다.</li>
		<li>표준 조건 하에서 성장 챔버에 식물을 반환 합니다.</li>
		<li>재조합 단백질에 따라 최대 식 dpi에서 agroinfiltrated 잎을 수집 하 고 액체 질소에 그들을 동결. -80 ° c.에 게 식물 조직</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 재조합 형 단백질 표정 분석
<ol><li>총 수용 성 단백질 (TSP) 추출<ol>
<li>주사기를 갈기 또는 진공 침투 붉은 사탕 무 우와 시금치 잎, 2.2.6 단계와 단계에서 2.3.8, 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 액체 질소에 정밀한 분말을 수집 합니다. 15 mL 플라스틱 튜브로 분말을 전송 하 고-80 ° c.에 있는 자료를 저장</li>
		<li>잎 가루 300 밀리 그램을 추출 버퍼 (50 m m 인산 나트륨 pH 8.0, 20mm 나트륨 metabisulphite)의 900 µ L를 추가 합니다. 참고: 버퍼 볼륨 (µ L)으로 식물 조직 무게 (mg) 사이의 선택한 비율 1:3입니다.</li>
		<li>1 분에 대 한 vortexing에 의해 혼합 균질 다음 4 ° c.에 40 분 30000 x g 에서 원심</li>
		<li>깨끗 한 튜브에 상쾌한 수집 하 고-80 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>식물 eGFP 시각화 및 정량화<ol>
<li>EGFP 96 잘 접시에 잎, 3 개의 기술 복제, 표현에서 얻은 각 TSP 추출의 100 µ L를 로드 합니다.</li>
		<li>96 잘 접시를 형광 판독기에 넣고 측정 시작. 485/535 nm 필터 eGFP 형광 검출에 필요한 설정 사용.</li>
		<li>절대 정량화에 대 한 같은 접시에 준비 보정 곡선 로드 다른 수량 (62.5, 125, 500, 750, 1000 ng) 순화 eGFP의.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TSP 정량화에 대 한 Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과<ol>
<li>(자료 테이블) 50 부분의 시 약 A 1 부분 시 약 B (자료 테이블)의 혼합. 샘플 분석 되 고 교정 표준에 대 한 충분 한 양의 신선한 BCA 작업 솔루션을 준비 합니다. 참고: 각 샘플에 필요한 BCA 작업 솔루션의 볼륨은 1.9 mL. 9 표준 (를 포함 하 여 빈) 표준 절차, BCA 작업 솔루션의 17.1 mL이 필요 합니다.</li>
		<li>각 표준 (를 포함 하 여 빈), 그리고 TSP 추출 물 이라는 관으로의 0.1 mL 플라스틱 참고: 교정 표준으로 준비 신선한 집합이 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 표준 샘플, 물 등으로 가급적 같은 희석제를 사용 하 여 10-1000 μ g/mL 범위에서. 교정 표준 및 샘플 준비에 사용 되는 희석제의 0.1 mL 빈에 의하여 이루어져 있다.</li>
		<li>1.9 mL BCA 작업 솔루션을 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 튜브를 커버 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>실시간 측정 562에서 흡 광도를 튜브 쿨 10 분 이내 모든 샘플의 nm. 참고: RT, 에서도 색상 개발 계속 됩니다. 10 분 이내 모든 튜브의 흡 광도 측정 한다면 상당한 오류를 소개 합니다.</li>
		<li>표준과 TSP 추출의 판독에서 빈의 562 nm 흡 광도 값을 뺍니다.</li>
		<li>플롯 빈 수정 562 nm의 농도에 각 표준에 대 한 읽기. 각 TSP 추출의 단백질 농도 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gecchele 외8앞에서 설명한 대로 얼룩 Coomassie 젤을 수행 합니다.</li>
	<li>서쪽 오 점 분석<ol>
<li>Gecchele 외8앞에서 설명한 서쪽 오 점 분석을 수행 합니다.</li>
		<li>단백질 전기 이동 별거 후에 니트로 막 표준 기술을 사용 하 여 전송. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) pH 7.4에에서 4% 우유를 혼합 하 여 차단 솔루션을 준비 합니다. 1 시간에 대 한 실시간에 차단 솔루션의 10 mL와 함께 막을 차단 합니다.</li>
		<li>안티-GAD65/67 및 안티-LHCB2, 1:10,000 및 1:20,000 안티 eGFP 0.1% 세제로 차단 솔루션의 5 mL에 대 한 토끼 항 기본 체를 준비 합니다. 준비 된 1 차적인 항 체 솔루션 4 ° C에서 하룻밤 또는 일정 한 동요와 RT에 4 h 막 품 어.</li>
		<li>1 차적인 항 체를 삭제 하 고 차단 솔루션 0.1% 세제를 포함 하 5 분에 대 한 3 번 막 씻어.</li>
		<li>양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 준비-0.1% 세제 솔루션을 차단에 1:10,000에서 어원이 안티 토끼 항 체. 일정 한 동요와 RT에 1.5 h 막 품 어.</li>
		<li>이차 항 체를 삭제 하 고 각 PBS-t (PBS 0.1% 세제로 보완) 5 분에 대 한 5 번 막 씻어.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 상용 luminol 솔루션 멤브레인을 품 어. 화학 이미징 시스템을 사용 하 여 신호를 감지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 식물 소재 처리
<ol><li>수확 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 빨간 무 우 식 피크 (11 dpi)에서 나뭇잎과 액체 질소에 그들을 동결.</li>
	<li>0.04 mbar-50 ° C에서 72 h에 대 한 냉동된 잎 lyophilize -80 ° c.에서 그들을 저장합니다</li>
	<li>정밀한 분말을 잎을 갈기 고 수 분을 제외 하 실리 카 겔 컨테이너를 밀봉된에 RT에 저장 합니다.</li>
</ol>5. 위 소화 시뮬레이션 및 셀 무결성 분석
<ol><li>위 소화 시뮬레이션<ol>
<li>6 mL PBS (pH 7.4)에 resuspend 및 grinded 동결된 붉은 사탕 무 우 잎의 100 밀리 그램 무게.</li>
		<li>6 M HCl와 2 샘플 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>10 m m HCl 1 mg/mL의 펩 신 최종 농도 또는 1:20 총 수용 성 단백질의 비율을 돼지 위 점 막에서 4 mg/mL의 펩 신을 추가 합니다. 120 분 동안 37 ° C에서 샘플을 흔들어.</li>
		<li>비활성화는 펩 신을 1 M NaOH로 pH 8에 샘플을 조정 합니다.</li>
		<li>20000 x g 4 ° c.에 20 분에 각 샘플의 750 µ L aliquots 원심 상쾌한 별도로 수집 하 고 버퍼를 로드의 표면에 뜨는 볼륨 하나에 펠 릿을 resuspend (1.5 M Tris HCl, pH 6.8, 3 %SDS, 15% 글리세롤, 및 4 %2-mercaptoethanol). 참고: 건강과 안전 이유를 위해 장갑을 착용 하 고 샘플 준비에 대 한 증기 두건에서 작동.</li>
		<li>서쪽 오 점 분석8여는 상쾌한와 resuspended 펠 릿을 분석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 무결성 분석<ol>
<li>Grinded 동결된 붉은 사탕 무 우 잎의 100 밀리 그램의 두 샘플을 준비 하 고 6 mL PBS (pH 7.4)에 둘 다 resuspend.</li>
		<li>하나는 6 M HCl. 흔들어 2 120 분 동안 37 ° C에서 두 샘플 샘플만의 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>20000 x g 4 ° c.에 20 분에 각 샘플의 750 µ L aliquots 원심 상쾌한 별도로 수집 하 고 버퍼를 로드의 표면에 뜨는 볼륨 하나에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>서쪽 오 점 분석은 상쾌한 및 resuspended 펠 릿을 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Bioburden 분석 결과
<ol><li>동결된 붉은 사탕 무 우 잎의 100 밀리 그램 무게. 8 mL의 멸 균 PBS (pH 7.4)에 1 분 동안 소용돌이 분말 resuspend</li>
	<li>항생제 또는 (i) 50 µ g/mL 리 팜 피신, 리 팜 피신과 carbenicillin의 각 (ii) 50 µ g/m l, (iii) 50 µ g/mL 각 리 팜 피신과 대, 또는 (iv) 50 µ g/mL 각 리 팜 피신, carbenicillin, 고 대를 포함 하지 않고 파운드 매체를 준비 합니다.</li>
	<li>플레이트 5 선택적 파운드 미디어 중에서 각 동결된 잎 homogenate의 1 mL.</li>
	<li>28 ° c.에 3 일 동안 모든 접시를 품 어</li>
	<li>각 접시에 성장 Agrobacterium 식민지를 계산 합니다.</li>
	<li>계산 하 고 동결된 잎 homogenate (CFU/mL)의 mL 당 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 수로 잔여 세균 전을 정의 합니다.</li>
</ol>7. 대사 산물 추출
<ol><li>1 차 대사 산물 추출<ol>
<li>저장-80 ° C의 30 밀리 그램의 무게, 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 2 mL 플라스틱 튜브에 붉은 사탕 무 우 잎 가루.</li>
		<li>2 시간 동안-20 ° C에서 30 미 품에 대 한 차가운 70/30 (v/v) 메탄올/클로 프롬 및 소용돌이의 750 µ L를 추가 합니다. 참고: 모든 용 매와 첨가제 LC MS 학년 이어야 합니다.</li>
		<li>새로운 2 mL 튜브에 냉 수와 10 분 수집에 대 한 17,900 x g 4 ° c에서 원심 분리기 및 전송의 600 µ L 위 hydroalcoholic 단계를 추가 합니다. 더 낮은 chloroformic 위상과 interphase를 삭제 합니다.</li>
		<li>용 제 증발에 3 h에 대 한 진공 집중 장치에 샘플을 넣어.</li>
		<li>50/50 (v/v) 이기/물 단계 7.1.4에서 300 µ L에서 얻은 펠 릿을 녹이 고 3 분에 대 한 샘플을 sonicate.</li>
		<li>0.2 μ m 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 전달 하 고는 투명 고정된 300 µ L 삽입 유리 튜브에 넣어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 차 대사 산물 추출<ol>
<li>-80 ° C 저장의 300 밀리 그램의 무게, 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 15 mL 플라스틱 튜브에 붉은 사탕 무 우 잎 가루.</li>
		<li>메탄올와 동 30의 3 개 mL를 추가 s, 그리고 15 분 동안 40 kHz에서 sonicate. 참고: 모든 용 매와 첨가제 LC MS 학년 이어야 합니다.</li>
		<li>10 분 동안 4 ° C에서 4500 x g 에서 샘플 원심 고 새로운 15 mL 튜브는 supernatants 전송.</li>
		<li>희석 100 µ L의 추출 물으로 1:3 (v/v) 하 고 0.2 μ m 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다.</li>
		<li>투명 고정된 300 µ L 삽입 유리 튜브로 솔루션을 넣어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>극 지 지질 추출<ol>
<li>저장-80 ° C의 200 밀리 그램의 무게, 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 15 mL 플라스틱 튜브에 붉은 사탕 무 우 잎 가루.</li>
		<li>물 200 µ L 그리고 메탄올의 2 개 mL를 추가 하 고 1 시간을 위한 얼음에 계속. 참고: 모든 용 매와 첨가제 LC MS 학년 이어야 합니다.</li>
		<li>30 대 한 소용돌이 s와 15 분 동안 40 kHz에서 sonicate.</li>
		<li>원심 25 분 수집 4 ° C에서 4500 x g 에서 샘플 및 전송 클로 프롬 단계 2 mL 튜브로. 위 hydroalcoholic 위상과 interphase를 삭제 합니다.</li>
		<li>용 매 증발에 3 h에 대 한 진공 집중 장치에 샘플을 넣어.</li>
		<li>단계 7.3.5 오디오 메탄올의 600 µ L에서에서 얻은 펠 릿을 디졸브.</li>
		<li>희석 100 µ L 1:5 (v/v) 메탄올 추출 하 고 0.2 μ m 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다.</li>
		<li>투명 고정된 300 µ L 삽입 유리 튜브로 솔루션을 넣어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 분석 및 데이터 처리
<ol><li>공급 업체에서 권장 하는 대로 LC-MS 시스템을 설정 합니다. 참고: C18 열 (150 x 2.1 m m, 입자 크기 3 µ m) 앞 C18 가드 열 (75 x 2.1 m m, 입자 크기 5 µ m)의 2 차 대사 산물 및 극 지 지질 분석에 대 한 장착 HPLC 결합 한 autosampler LC 섹션 구성 반면 (150 x 2.1 m m, 입자 크기 2.7 µ m) HILIC 열 앞 HILIC 가드 열 (7.5 x 2.1 m m, 3 µ m). MS는 분무 이온화 (ESI) 또는 대기압 화학 이온화 (APCI) 소스와 함께 제공 되는 이온 트랩 질량 분석기 이다.</li>
	<li>HPLC 그라디언트에 대 한 적절 한 용 매를 준비 합니다. 주 대사 산물 분석에 대 한 사용 하 여 20 m m 염화 편대 용 매 a; 95% 이기, 5% 수 플러스 10 m m 염화 편대 용 매 b.로 2 차 대사 산물 분석 물 플러스 0.05% 개미 산 (A)와 이기 플러스 0.05% 개미 산 (B)를 사용 하 여. 극 지 지질 분석 물 플러스 0.05% 개미 산 (A) 및 100% 이기 (B)를 사용 하 여. 참고: 용 제, 첨가제, LC-MS 학년 이어야 합니다.</li>
	<li>대사 산물 차입에 대 한 표 1 에 보고 된 그라디언트를 사용 합니다. 반면 0.2 mL/분 주사 10 µ L의 2 차 대사 산물 및 극 지 지질, 각 샘플에는 흐름 속도 설정 기본 대사 산물에 대 한 5 µ L를 주사.</li>
	<li>각 실험 조건의 대표적인 혼합 다른 샘플의 동등한 부분을 혼합 하 여 품질 관리 (QC) 샘플을 준비 합니다. 악기 효율성을 모니터링 하는 실험 중 QC 샘플을 분석. 특히, 각 10 샘플 배치 후 QC 샘플 분석을 삽입 합니다.</li>
	<li>악기 기반 효과 피하기 위해 샘플을 무작위.</li>
	<li>9 분석 후 청소 방법 및 빈 분석 열 삽입 후 즉시. 참고: 강한 용 매의 높은 비율에 isocratic 차입과 두 용 매 사이 느린 그라데이션을 수행 합니다. 빈 순수한 메탄올의 주입으로 구성 됩니다: 다음 분석에 보존 시간 재현성을 향상 시키기 위해 물 (50/50, v/v).</li>
	<li>표 2에 나열 된 매개 변수를 사용 하 여 다른 긍정적이 고 부정적인 이온화 모드에서 질량 스펙트럼을 취득 하는 악기를 설정 합니다. 참고: 다른 매개 변수는 특정 플랫폼에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>달 산 외.9에 설명 된 대로 다음 데이터 처리를 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+The+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li>
<li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li>
<li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases%3A+Where+are+we%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957(2010).</li>
<li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li>
<li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pediatric+Reviews%22%5BJournal%5D)">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li>
<li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system%3A+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories%3A+Bacteria%2C+Insect+Cells+and+Plant+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li>
<li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li>
<li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+beet+%28Beta+vulgaris%29+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding%2C+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).</li>
<li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li>
<li>Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015).</li>
<li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li>
<li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery%3A+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li>
<li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+%E2%80%93+a+new+era+of+prophylaxis%3A+current+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology+and+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).</li>
<li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Future+science%22%5BJournal%5D)">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, FSO217 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 우리는 자기 면역 당뇨병에 대 한 후보 구강 백신의 설계에 대 한 예비 분석을 보였다. 이 실험에 대 한 대상 단백질 돌연변이 형태의 인간의 65 kDa 조미료 Decarboxylase, 어떤 생산 및 기능은 쉽게 감지 하 고 측정 가능한12했다. 다른 식용 식물 조직에 그것의 식5벡터는 아주 짧은 시간 프레임에서 재조합 단백질 생산의 높은 수준에서 중재 중재 했다. 붉은 사탕 무 우에 eGFP 식에 따라 식용 호스트 수행한 최고의 후보 식물의 선택 하 고 수동 agroinfiltration에 의해 시금치 잎. 이 단계 수동 agroinfiltration의 시간이 걸리는 절차 및 시금치 잎 조직 침투에 경도 산업을 위한 중요 한 수 있습니다.
재조합 단백질에 대 한 최상위 재조합 단백질 축적을 주는 수확의 특정 dpi의 식별 중요 한 단계 이며 테스트 하 여 사건에-의해-사건을 기준...

식물 분자 생물학 혁명 1980 년대에서 이후 바이오의 생산을 위한 공장 기반 시스템 미생물 및 포유류 세포1에 따라 기존 시스템의 대 안으로 여겨질 수 있다. 식물은 확장성, 비용 효율성 및 안전2가장 관련성이 높은 되 고 여러 장점이 전통적인 플랫폼을 표시 합니다. 재조합 제품 변형 된 식물 조직에서 정화를 다음 관리, 중 parenterally 또는 구두와, 또한, 변형 된 식용 식물 직접 구두 전달에 대 한 사용할 수 있습니다. 구강 경로 동시에 점 막 및 조직 면역을 촉진 하 고 그것은 바늘과 전문된 의료 인력에 대 한 필요성을 제거. 또한, 구두 전달 일반적으로 재조합 단백질3의 총 제조 비용의 80%를 차지 하는 복잡 한 다운스트림 처리를 제거 합니다. 그 모든 장점은 생산, 공급 및 노동 세계 인구의 대부분을 저렴 한 약을 만드는 각 복용량의 비용 절감으로 번역 될 수 있다.
여러 가지 전략, 모두 안정적인 변환 및 과도 식, 식물에서 재조합 단백질의 생산을 위해 개발 되었다. 그들 가운데, 높은 수율 deconstructed 식물 바이러스-기반 식 시스템 (예: magnICON) 상대적으로 짧은 날짜 표시줄4이상의 재조합 단백질의 높은 수익률을 선도 하는 우수한 성능을 제공 합니다. 과도 식 Nicotiana benthamiana 식물에서 식물 바이러스-기반 식 시스템을 사용 하 여의 많은 예제, 표준 생산 호스트 되 고 보고 됩니다. 그러나,이 모델 식물은 알 카 로이드 및 그것의 잎에 축적 된 다른 독성 대사 산물 식용 종으로 간주 되지.
이 작품에서는, 우리는 두 식용 식물 시스템, 레드 비트 간의 비교 설명 (베타 vulgaris 이력서 물 랑 루즈), 시금치 (Spinacea 올레라케아 이력서 산업), 글루탐산의 65 kDa isoform의 두 후보 형태의 표현에 대 한 decarboxylase (GAD65), 바이러스-기반 식물에 의해 실시5벡터 스 GAD65 타입-1 당뇨병 (T1D)에 관련 된 주요 autoantigen 이며 그것은 현재를 방지 하거나 허용 오차6유도 T1D 지연 인간 임상 시험에서 조사를 받고 있다. GAD65의 생산 공장에서 광범위 하 게 모델 식물 종에서 Nicotiana tabacum 고 명 benthamiana4,5,,67로 공부 했다. 여기, 우리가 직접 구두 납품을 위해 의미 될 수 있다 조직에 분자의 생산을 위한 식용 식물의 사용을 설명 합니다. 기술적인 관점에서 우리는 공부 하 고 다른 매개 변수를 평가 하 여 공장 agroinfiltration에 대 한 시스템 및 GAD65 생산을 위한 식용 식물 플랫폼 선택: 재조합 형 단백질 표정 수준, 식물에서 잔여 미생물 충전 조직 구두 전달, 위 소화를 GAD65의 저항 및 야생 유형으로 변형 된 식물의 bioequivalence에 대 한 의미.

<table><tbody><tr><td>0.2-&뮤; m Minisart RC4 멤브레인 필터</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash; 메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>독성; 4 % 글리세롤, SDS 및 Tris-HCl</td></tr><tr><td>4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>pH 5.5</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td>부식성</td></tr><tr><td>아세토니트릴 LC-MS 등급</td><td>Sigma</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>독성 &ndash; 0.1 M 재고 DMSO</td></tr><tr><td>한천 세균학 등급</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td>효모 추출물, NaCl 및 트립톤 포름산 암모늄으로 LB 매체 (pH 7.5, NaOH) 만들기 위해</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP 항체</td><td>ABCam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD 65/67 항체</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td></td></tr><tr><td>항-LHCB2 항체</td><td>Agrisera</td><td>AS01 003</td><td></td></tr><tr><td>브릴리언트 블루 R-250</td><td>시그마</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>C18 컬럼</td><td>그레이스</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (150mm x 2.1mm, 3 & m) 열</td></tr><tr><td>C18 가드 열</td><td>그레이스</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 & m) 가드&nbsp; 컬럼</td></tr><tr><td>CalMag Grower</td><td>Peter Excel</td><td>15-5-15</td><td>비료</td></tr><tr><td>카르베니실린 디소듐</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>독성</td></tr><tr><td>화학발광 이미징 시스템</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td>ChemiDoc 터치 이미징 시스템</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>세제</td><td>시그마</td><td>P5927</td><td>폴리소르베이트 20</td></tr><tr><td>형광 리더</td><td>Perkin-Elmer</td><td>&nbsp; 1420-011</td><td>VICTOR Multilabel Counter</td></tr><tr><td>Formic acid LC-MS grade</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>15 %는 Tris-HCl, SDS 및 2&ndash로 버퍼를 적재합니다. 메르캅토에탄올</td></tr><tr><td>GoTaq G2 중합효소</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>부식성</td></tr><tr><td>HILIC 컬럼</td><td>그레이스</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; 입자 크기 2.7 &mu; m) 컬럼</td></tr><tr><td>HILIC 가드 컬럼</td><td>그레이스</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 &mu; m) 가드&nbsp; 칼럼</td></tr><tr><td>호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)-conjugate anti-rabbit 항체</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>너무 많이 얼리거나 해동하지 마세요</td></tr><tr><td>HPLC Autosampler</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>시스템 골드 508 오토샘플러</td></tr><tr><td>HPLC 시스템</td><td>벡크만 쿨터</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>System Gold 128 솔벤트 모듈 HPLC</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마</td><td>24137</td><td>가연성</td></tr><tr><td>카나마이신 설페이트</td><td>시그마</td><td>K4000</td><td>독성</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9541</td><td>2 g/L NaCl, Na2HPO4 및 KH2PO4 PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4 </td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>2.4 g/L(NaCl 포함), Na2HPO4 및 KCl을 사용하여 PBS</td></tr><tr><td>로딩 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>루미놀 솔루션</td><td>Ge Healthcare</td><td>RPN2232</td><td>ECL Prime Western Blotting System 상용 키트</td></tr><tr><td>Lyophilizator</td><td>5Pascal</td><td>LIO5P0000DGT</td><td></td></tr><tr><td>질량 분석기</td><td>Bruker를 사용하여 용액 준비 Daltonics</td><td>&nbsp; -</td><td>Bruker Esquire 6000; 질량 분석기는 ESI 소스로 장착되어 있었고 분석기는 이온 트랩이었습니다</td></tr>. <tr><td>메탄올</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>우유 차단 솔루션</td><td>Ristora</td><td>&nbsp; &nbsp; </td><td>-3 % PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>NaH2PO4와 함께 사용하여 인산나트륨 완충액</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>80 g/L KCl, Na2HPO4 및 KH2PO4 PBS 만들기;10 g/L 효모 추출물로 LB 매체(pH 7.5 NaOH) 만들기, 트립톤과 아가르 세균학 등급</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>&nbsp; Na2HPO4와 함께 사용하여 인산나트륨 완충액을 만듭니다. </td></tr> 돼지 위 점막에서 PBS <tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰라아제 멤브레인</td><td>Ge 헬스케어</td><td>10600002</td><td></td></tr> Pepsin을 만드는 14.4 g/L <tr><td></td><td>시그마</td><td>P7000</td><td></td></tr><tr><td>과산화효소 기질 ECL</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN2235</td><td>감광성 재료</td></tr><tr><td>펌프 진공 프레스</td><td>VWR</td><td>111400000098</td><td></td></tr><tr><td>시약 A</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>이 시약의 50 부와 시약 B의 1 부를 사용하여 BCA 작업 용액을 준비하십시오</td></tr><tr><td>시약 B</td> 시약 B를 준비하십시오 시약 B 시<td>그마</td><td>B9643</td><td>BCA 작업 용액을 준비하기 위해이 시약의 1 부를 시약 A의 50 부와 함께 사용하십시오</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>독성 &ndash; DMSO</td></tr><tr><td>SDS (Sodium dodecyl sulphate)</td> <td>Sigma</td><td>L3771</td><td>의 25 mg / mL 재고가연성, 독성, 부식성 -10 % 주식; 3 %는 Tris-HCl, Glycerol 및 2&ndash로 로딩 버퍼를 만듭니다. 메르캅토에탄올</td></tr><tr><td>나트륨 메타중아황산염</td><td>시그마</td><td>7681-57-4</td><td></td></tr><tr><td>초음파 시스템</td><td>Soltec</td><td>090.003.0003</td><td>Sonica&reg; 2200 MH; 주파수 40 kHz</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Terumo</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td></td></tr> <tr><td>투명 고정 300-&micro; L 삽입 유리관</td><td>Thermo Scientific</td><td>11573680</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>1N HCl로 pH를 조정하여 Tris-HCl 버퍼를 만들고 1,5M Tris-HCl (pH 6.8)을 사용하여 SDS, 글리세롤 및 2&ndash로 로딩 버퍼를 만듭니다. 메르캅토에탄올</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td>효모 추출물, NaCl 및 한천으로 LB 배지(pH 7.5, NaOH)를 만들기 위한 10g/L 세균학 등급</td></tr><tr><td>진공 농축기</td><td>Heto</td><td>3878 F1-3</td><td>Speed-vac 시스템</td></tr><tr><td>물 LC-MS 등급</td><td>Sigma</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td>Tryptone, NaCl 및 한천을 사용하여 LB 매체(NaOH가 있는 pH 7.5)를 만들기 위한 5g/L</td></tr></tbody></table>

타입-1 당뇨병에 대 한 의약품 후보 백신의 빨간 사탕 과도 식

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

식물 분자 농업 관심사의 분자를 생산 하는 식물의 사용 이다. 이 관점에서 식물 사용할 수 있습니다 모두 생물 반응 기 생산 및 최종 제품의 후속 정화 및 분리 단백질의 직접 구두 전달에 대 한 식용 식물을 사용 하는 경우. 이 작품에서는, 우리는 진공 침투 전달 deconstructed 식물 바이러스-기반 재조합 DNA 기술을 사용 하 여 식용 식물 시스템에 타입-1 당뇨병 (T1D)에 대 한 후보 구강 백신의 개발 제시. 우리의 결과 빨간 사탕 T1D T1D 백신으로 유망한 후보 간주에 관련 된 인간의 파생된 autoantigen 과도 표현 위한 적합 한 호스트 보여줍니다. 위 소화에에 그들의 저항, 잔류 세균의 존재 및 사용 가능성에 대 한 프로세스 생산의 개요를 제공의 2 차 대사 프로필 있는 autoantigen 생산 잎 특징 철저 하 게 했다 분리 단백질의 직접 구두 전달 식물. 우리의 분석 시뮬레이션된 위 소화, 식물 유래 갓 백신의 제조에서 캡슐화 전략 필요 하다는 것을 제안에 따라 동결된 후보 구강 백신의 거의 완전 한 저하를 보였다.

이 작품에서 식용 식물 조직에서 구강 백신의 개발에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 이 작품의 초점은 식용 호스트 식물 종에 대상 단백질의 표현과 잠재적인 구강 백신의 특성 이다.
첫 번째 단계는 식용 식물 시스템에서 재조합 단백질을 생산 하는 식물 바이러스-기반 식 기술의 적합성의 평가 참여. 이 목표를 위해 우리가 먼저 사용는 eGFP 모델 단백질으로 하 고 우리 두 식용 잎이 많은 식물 시스템으로 표현: 붉은 사탕 무 우와 시금치. 식물은 수동으로 A. tumefaciens eGFP 재조합 식 벡터 운반의 정지 된 agroinfiltrated 이었다. 형광 단백질 표정 서쪽 오 점 분석 (그림 1A, B, D, E)에 의해 구상 되었고 자외선에서 계량. 결과 최대 eGFP 수준 (113.4 ± 0.3 µ g/g F...

여기, 선물이 식용 식물에 타입 1 당뇨병에 대 한 경구 백신 후보자를 생산 하는 프로토콜.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

식물에서 재조합 단백질의 생산을위한 다른 전략 중, 해체 된 식물 기반 VERS 발현은 상대적으로 짧은 시간 프레임에 걸쳐 높은 수율로 이어지는 우수한 성능을 제공합니다. 경구 백신의 생산을 위한 이 기술의 복제는 가까운 장래에 전통적인 백신에 대한 대안이 될 큰 잠재력을 가지고 있습니다. Lyophilized 빨간 사탕무 잎은 일시적으로 변형 된 타입-1 당뇨병 예방에서 경구 내성 유도에 적합한 사진 항원의 양을 축적한다.이 실험 프로토콜은 재조합 단백질 축적의 사례별 평가 후에 많은 다른 식용 종으로 확장될 수 있었습니다. 절차를 시연하는 것은 에도아르도 베르티니, 마티아 산토니, 안나 쿠쿠룰로, 로버타 잠피에리입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 성장 챔버에서 붉은 사탕무와 시금치 식물을 성장시하십시오.종자 발아 후, 리터 당 1 그램의 농도로 시판 되는 비료의 용액으로 일주일에 두 번 식물을 비옥하게. 농약의 경우 5주 된 시금치와 6주 된 붉은 사탕무 식물을 사용하십시오. 식물 발현 벡터를 생성한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 밀리리터 당 50 마이크로그램의 농도로 리팜피신을 함유하는 LB 배지의 50 밀리리터에서 3개의 A.tumefaciens 변압제를 접종한다.섭씨 28도에서 하룻밤 을 흔들어 성장. 다음 날, 20 분 동안 4500 배 G에서 원심분리하여 세균 배양을 펠릿. 10 밀리머 MES와 10 밀리머 마그네슘 황산염을 포함하는 침투 완충제의 100 밀리리터에서 펠릿을 재중단.실온에서 3시간 동안 서스펜션을 배양합니다. 5개의 프라임 모듈과 테그라스 모듈과 함께 여기에 표시된 모듈 중 하나를 포함하는 세균 현탁액의 동일한 볼륨을 혼합합니다. 바늘없이 주사기를 사용하여 서스펜션 믹스의 5 밀리리터를 꺼내십시오.잎의 반대편에 부드럽게 카운터 압력을 가하면서 식물 잎의 밑면에 주사기의 끝을 누릅니다. 각 식물에 대해 정점부터 시작하여 완전히 확장된 처음 3개의 잎에 침투합니다. 잎 줄기에 종이 태그와 함께 농구침 잎을 라벨.그런 다음 표준 조건하에서 식물을 성장 챔버로 되돌려 보입니다. 4일에서 14일 동안, 농약잎을 모아 액체 질소로 동결한다. 이 식물 조직을 영하 80도에 보관하십시오.첫째, 밀리리터당 50마이크로리터의 농도로 리팜피신을 함유하고 있으며, 28°C에서 하룻밤 사이에 흔들어 적절한 벡터 특이적 항생제를 함유하고 있는 LB 배지의 50밀리리터에서 3개의 A.tumefaciens 변압제를 별도로 성장시킨다. 다음 날, 20 분 동안 4500 배 G에서 원심분리하여 세균 배양을 펠릿. 침투 버퍼 1리터에서 펠릿을 0.35의 OD600으로 재차 중단하고 실온에서 3시간 동안 서스펜션을 배양한다.그런 다음 각 현탁액에 세제의 0.01 %를 추가하십시오. 여기에 표시된 모듈 중 하나를 포함하는 세균 현탁액의 동일한 볼륨을 5개의 프라임 모듈 및 인테그라스 모듈과 혼합합니다. 6주 된 붉은 사탕무 식물을 홀더에 삽입합니다.홀더를 뒤집어 침투 현탁액에 잎을 잠수하기 위해 침투 목욕의 두 리터가 들어있는 비커 위에 놓습니다. 그런 다음 침수된 식물과 함께 침투 목욕을 침투 챔버로 옮기고 닫습니다. 진공 펌프를 켜고 침투 챔버에서 진공 섭취 밸브를 엽니다.챔버의 압력이 90 밀리바로 떨어지면 3 분 동안 진공을 유지하십시오. 그런 다음 진공을 45초 동안 놓습니다. 챔버가 대기압으로 돌아왔을 때 챔버를 열고 세균 성 욕조에서 침투 된 식물을 제거하십시오.식물을 성장 챔버로 되돌려 보입니다. 최대 발현의 날에, 침투 잎을 수확하고 이전에 설명한 대로 액체 질소로 동결하십시오. 먼저, 진공 농약형 델타 87 GAD65mut을 수확하여 발현 피크에서 붉은 사탕무 잎을 표현하고 액체 질소로 동결한다.냉동 잎은 영하 50도, 72시간 동안 0.04 밀리바에서 냉동 잎을 사용한다. 그런 다음 영하 80도에서 보관하십시오. 진행 할 준비가되면, 미세 분말에 잎을 갈기와 수분을 제외 실리카 젤 밀봉 용기에 실온에 저장합니다.위 소화 시뮬레이션의 경우, 미세하게 갈은 동결 건조 된 붉은 사탕무 잎의 100 밀리그램의 무게를 측정하고 PBS의 6 밀리리터로 다시 중단합니다. 6개의 어금반 염산을 사용하여 시료 pH를 2개로 조절합니다. 돼지 위 점막에서 밀리리터 펩신 당 4 밀리그램을 추가하고, 10 밀리머 염산, 밀리리터 당 1 밀리그램의 최종 펩신 농도를 얻을 수 있습니다.샘플을 섭씨 37도에서 120분간 흔들어 줍니다. 다음으로, 수산화 나트륨을 사용하여 샘플 pH를 8으로 조정하고 펩신을 비활성화합니다. 각 시료의 750마이크로리터 알리쿼트를 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고, 알리쿼트를 20, 000배, 섭씨 4도에서 20분간 원심분리합니다.각 상체를 별도로 수집하고 각 펠릿을 하나의 상중 부피로 적재 버퍼로 재보선합니다. 그런 다음 서양 얼룩 분석에 의해 상류체 및 재중단 펠릿을 모두 분석합니다. 세포 무결성 분석을 위해, 잘게 갈아 간 동결 건조 된 붉은 사탕무 잎의 100 밀리그램의 두 샘플을 준비하고 PBS의 6 밀리리터에서 모두 다시 중단합니다.6개의 어금반 염산을 사용하여 한 샘플의 pH를 2개로 조정합니다. 두 샘플을 섭씨 37도에서 120분간 흔들어 줍니다. 그런 다음 각 샘플의 750 마이크로리터를 마이크로센트심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.원심분리기는 20, 000배, 섭씨 4도에서 20분 동안. 각 상체를 별도로 수집하고 각 펠릿을 하나의 상중 부피로 적재 버퍼로 재보선합니다. 그런 다음 서양 얼룩 분석에 의해 상류체 및 재중단 펠릿을 모두 분석합니다.첫째, 미세하게 갈은 동결 건조 된 붉은 사탕무 잎의 100 밀리그램의 무게를 달고 멸균 PBS의 8 밀리리터로 다시 보관하십시오. 1 분 동안 소용돌이. 5개의 제조된 선택적 LB 매체 중 하나에서 각 동결 건조 잎 균주제의 1밀리리터를 플레이트.3 일 동안 28섭씨에서 접시를 배양하십시오. 그 후, 각 판에서 자란 농균 콜로니를 계산하고, 동결 건조 잎 균형제의 밀리리터 당 식민지 형성 단위의 수로 잔류 세균전전을 계산한다. 이 작품에서, 경구 백신은 식용 식물 조직에서 개발된다.붉은 사탕무와 시금치 식물은 EGFP 재조합 발현 벡터를 운반하는 A.tumefaciens의 현탁액으로 수동으로 농약으로 침투하며, 형광 단백질 발현은 서양 얼룩 분석에 의해 시각화되고 UV 빛 하에서 정량화된다. 빨간 사탕무 시스템은 더 높은 EGFP 발현을 특징으로하며, 감염 후 9 일 동안 신선한 잎 무게그램 당 약 544 마이크로 그램에 도달하는 반면 시금치는 감염 후 11 일 동안 신선한 잎 무게 그램 당 약 113.4 마이크로 그램의 최대 수준에 도달했습니다. 이 때문에 모든 후속 실험에 대해 빨간색 사탕무가 표현 주전 호스트로 선택됩니다.그런 다음 식물은 A.tumefaciens 서스펜션으로 진공 침투됩니다. 농약침 잎으로부터 TSP 추출 후, 샘플은 서양 블롯에 의해 분석되고, 재조합 단백질은 밀도 분석에 의해 상대적으로 정량화된다. 마지막으로, 잠재적인 경구 백신의 발달을 위한 파라미터가 평가된다.여기에서 볼 수 있듯이, 표적 단백질은 lyophilization 과정 후에 안정되는 것으로 보입니다. 위 소화는 동결 건조 물질에 돼지 위 효소 펩신을 추가하여 시뮬레이션되며, 밀리리터당 1밀리그램의 최종 농도 또는 TSP에 1-20의 비율로 시뮬레이션됩니다. 두 소화 치료 조건 재조합 단백질의 저하 귀착됩니다.펩신 소화 후 펠릿 샘플에 특정 신호의 부재는 동결 건조 후, 식물 세포가 무결성을 잃고, 이것은 대상 단백질 저하로 이어졌다는 것을 시사한다. 절차는 진공 침투와 시간 과정 분석과 관련하여 대상 재조합 단백질에 대해 식물 종에 신중하게 적응해야합니다. 시연 절차는 또한 백신 및 항체 같이 경구 납품을 위한 bio pharmaceutical의 생산을 위해 사용될 지도 모릅니다.

transient-expression-red-beet-biopharmaceutical-candidate-vaccine-for

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 간장 네오 작은 섬 STZ의 형성 (streptozotocin) 유도 도우미에 의존 adenoviral 벡터 (HDAd)과 고혈당증의 반전을 사용하여 유전자 Neurogenin3의 전송 (Ngn3)와 Betacellulin (Btc)에 의해 당뇨병 쥐를.을 설명 우리의 방법은 생체 전달하고 오래 지속 유전자 발현에서의 고효율과 도우미에 의존 adenoviral 벡터의 장점이 소요됩니다.

도우미에 의존 Adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성

우리는 섬 항원 특정 기본 CD4 + T 세포의 입양 전송하여 두 주 이내에 생쥐에서 제 1 형 당뇨병 (T1D)를 유도하는 재생 방법을 제공합니다.

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

여기, 선물이 transgene 식 tebufenozide 치료에 의해 pEUI(+) 단일 유전자 스위치를 사용 하 여 변조에 대 한 프로토콜.

Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

이 프로토콜 설명 합니다 자세한 워크플로 생성에 대 한 immunomodulators, 예를 들어 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 홍 역 바이러스를 사용 하 여 표현 위한 oncolytic 바이러스의 비보 특성화 전. 응용 프로그램 및 다른 벡터 플랫폼 및 transgenes 적응 임상 번역 소설 immunovirotherapeutics의 개발을 가속화할 것 이다.

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 운반하는 렌티바이러스에 의해 형화되는 분산된 인간 섬 세포로부터 유전자 변형된 인간 의사구성을 생성하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 쉽게 사용할 수있는 효소 및 배양 혈관을 활용하고, 쉽게 수행 할 수 있으며, 기능 및 형태 학적 연구에 적합한 유전자 변형 인간 의사 를 생산합니다.

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

이 프로토콜은 자발적 당뇨병 NOD 마우스에서 정제된 비장 세포로 도전받은 비만 당뇨병(NOD) 중증 복합 면역 결핍 마우스에서 NIT-1 세포를 이식하고 이미징하기 위한 간단하고 최소 침습적인 방법을 설명합니다.

생쥐에서 자가면역 당뇨병의 입양 이식 모델에서 이식편 생존의 생물발광 모니터링

이 프로토콜은 암 면역 요법을 위한 비통합 mRNA를 사용하여 일시적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 자세한 절차를 설명하고 CAR-T 세포 및 세포 독성 기능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

암 면역 요법을 위해 mRNA를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하는 비바이러스 접근법

배우세요 식물 기반 재조합 단백질 생산을 활용한 타입-1 당뇨병 경구 백신 후보 개발 방법입니다. 적색비트 잎을 동결건조하여 고수율의 포토항원을 축적하고 경구 내성 유도 효능을 평가하는 혁신적인 면역학 기술을 탐색합니다.

타입-1 당뇨병에 대 한 의약품 후보 백신의 빨간 사탕 과도 식

더 많은 동영상 탐색