Name: 다발성 경화증을 가진 개별을 위한 포괄적인 부검 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 배우세요 다발성 경화증의 병인을 규명하기 위한 급속 부검 프로그램 방법론을. 사후 6~8시간 이내에 뇌 조직을 채취하고 생체 내 MRI를 수행하여 병리학적 변화와 영상 소견을 상관시킵니다. RNA 분석, 면역염색 및 면역블로팅을 위한 조직 처리 기술을 익혀 MS 연구에 활용하세요.

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저자는 또한 크리스토퍼 넬슨 박사에게 편집의 도움을 주셔서 감사드립니다. 부검 프로그램은 BDT에 R35 교부금 NS097303에 의해 부분적으로 지원됩니다. RD의 실험실에서 일은 NINDS (NS096148)와 미국 국립 다발성 경화증 학회 (RG 5298)의 보조금에 의해 지원됩니다.

이 프로토콜은 클리블랜드 클리닉 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며 클리블랜드 클리닉 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.
1. 시투 MRI
<ol><li>기증자의 몸을 MRI 제품군으로 가져가MS 이미징 시설에서 2 시간 MRI 이미징 프로토콜을 수행합니다. 3 T 또는 7 T 이미저에서 MRI를 수행합니다. 참고: 레거시 데이터의 대부분이 3T에서 수행되었지만 사용할 수 없는 경우 이미징이 7T로 수행되기 때문에 3T에 우선 순위가 부여됩니다. 지정된 코어 서열은 모든경우에 대해 수행된다 (표 1) 현재 연구 이익에 의존하는 추가 서열은 시간이 허용하는 경우 수행 (죽음 후 12 시간 미만 조직 고정을 달성하여 제한). 표 1은 코어 서열을 설명한다.</li>
</ol>2. 부검
참고: 에 있는 situ MRI에 따라, 바디는 실험실 구성원에 의해 diener 및 조직 처리에 의해 두뇌와 척수 추출을 위한 morgue로 수송됩니다.
<ol><li>시체가 모그에 도착하기 전에 다음 단계를 수행합니다. 2시간 전에, 4% 파라포름알데히드(PFA)의 3L을 준비하고, 조직 보관을 위해 용기와 봉투를 라벨로 준비한다. 8% PFA의 3 L을 준비하고 8% PFA에 8% PFA의 1.5 L을 4% PFA로 희석한다. 나머지 8% PFA를 2일째동안 4°C에 놓습니다.</li>
	<li>모르그로 여행하기 전에 2개의 이동식 쿨러를 드라이 아이스(큰 블록이 깨지고 작은 펠릿)로 50%까지 채우십시오.</li>
	<li>모르그에서 스테인레스 스틸 용기를 2-메틸부탄과 드라이 아이스로 중간에 채우고 조직을 동결하기 위한 준비를 위해 뚜껑을 덮습니다.</li>
	<li>무게와 한 번 디에이너에 의해 제거 된 뇌를 촬영합니다.</li>
	<li>첨부된 듀라를 PFA로 채워진 용기에 놓습니다.</li>
	<li>대뇌에서 소뇌와 뇌간을 분리하고 대뇌를 촬영합니다.</li>
	<li>시신경, 치아, 요로를 식별하고 프로브와 핀셋을 사용하여 분리합니다. 메스로 구조를 절제하십시오. 참고: 시신경의 한쪽의 말단 세그먼트는 식별을 위해 Higgins 잉크를 사용하여 표시됩니다.</li>
	<li>대뇌 반구를 세로로 분리하고 각 반구를 개별적으로 촬영합니다.</li>
	<li>왼쪽 반구의 기본 모터 피질(PMC)에 잉크를 넣고 다시 사진을 찍고 3.3L 용기에 넣고 긴 고정을 합니다. 뇌 고정의 시작 시간을 문서화합니다.</li>
	<li>오른쪽 반구에 대한 PMC는 잉크로 또는 절제될 수 있습니다.
	<ol>
<li>절제되는 경우, 먼저 커버 드 수막을 제거합니다.</li>
		<li>잉크로 찍거나 절제된 PMC를 다시 촬영합니다.</li>
		<li>PMC를 절제하는 경우 6개의 동등한 크기의 섹션으로 잘라냅니다.</li>
		<li>각 섹션의 로스트랄 측면을 잉크로 만듭니다.</li>
		<li>짧은 고정을 위해 홀수 섹션을 PFA 채워진 컨테이너에 넣습니다.</li>
		<li>균일한 수의 섹션을 스냅 동결하고 밀봉된 냉동고 백에 넣어 서늘한 #1 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>오른쪽 반구 앞쪽을 1cm 두께의 관상 동맥 절편으로 뒤쪽으로 자른다.
	<ol>
<li>총 이상(예: 절단 아티팩트, 출혈 및 병변)을 문서화합니다.</li>
		<li>짧은 고정을 위해 PFA가 채워진 컨테이너에 홀수 섹션에 배치합니다.</li>
		<li>짝수 구간을 스냅 동결하고 밀봉된 냉동고 가방에 넣습니다.</li>
		<li>뇌 고정 시간의문서 끝 .</li>
	</ol></li>
	<li>뇌간을 소뇌에서 분리하고 짧은 고정을 위해 PFA 충전 용기에 놓습니다.
	<ol>
<li>분리 소뇌 반구세로.</li>
		<li>각 반구를 4개의 똑같이 두꺼운 시상 섹션으로 자른다.</li>
		<li>사진 내측 및 측면 보기.</li>
		<li>왼쪽 소뇌 반구형 조각을 짧은 고정을 위해 PFA로 채워진 용기에 넣습니다.</li>
		<li>오른쪽 소뇌 반구형 슬라이스를 스냅 동결하고 밀봉 된 냉동고 가방에 넣어 시원한 #1 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다이너에서 신경 뿌리가있는 척수를 얻습니다.
	<ol>
<li>척수 경막미를 제거하고 PFA가 있는 용기에 듀라를 보관하십시오.</li>
		<li>분리 왼쪽 및 오른쪽 전방 및 후방 신경 뿌리. 척수에서 절단된 왼쪽 전방 및 후방 신경 뿌리를 잘라내고 짧은 고정을 위해 PFA 충전 용기에 놓습니다.</li>
		<li>척수에서 오른쪽 전방 및 후방 신경 뿌리를 자르고, 스냅 동결하고, 밀봉 된 냉동고 가방에 넣고, 시원한 #2 넣습니다.</li>
		<li>척수의 20cm를 가장 많이 촬영합니다. 요추 확대 위치를 문서화합니다.</li>
		<li>코드의 2cm 가로 부분을 절단하여 코달에서 로스트랄로 진행합니다.</li>
		<li>각 컷 섹션의 로스트랄 측면을 잉크로 만듭니다.</li>
		<li>짧은 고정을 위해 PFA가 채워진 컨테이너에 홀수 섹션에 배치합니다.</li>
		<li>짝수 구간을 스냅 동결하고 밀봉된 냉동고 가방에 넣고 시원한 #2 넣습니다.</li>
		<li>척수 고정 및 심각한 이상에 대한 시작 시간을 문서화합니다.</li>
		<li>척수의 나머지 로스트랄 부분을 촬영합니다.</li>
		<li>자궁 경부 확대의 위치를 문서화합니다. 나머지 척수에 대한 2.13.5-2.13.8 단계를 따르십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>-80°C 냉동고에 라벨이 부착된 상자에 냉동 조직을 놓는 것을 따라. 고정 된 조직을 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>24 시간 후 부검 후 (2 일째)에서 나머지 8 % PFA를 4 %로 희석시다.</li>
	<li>4% PFA를 고정 용기에 담은 후 갓 희석한 4% PFA로 교체하십시오.</li>
	<li>60 h 후 부검에서 글루타랄데히드, PFA, dH2O 및 소렌슨의 완충액에서 4 % PFA에서 2.5 % 글루타랄데히드의 용액을 준비합니다 (순차적으로 혼합하여 제조 : 0.2 M 인산염 완충액 pH 7.4, 폴리 비닐 피롤리돈 1 % w / v, 수크로로즈 30 % w / v, 에틸렌 30% v/v).</li>
	<li>짧은 고정 용기에서 사용한 4% PFA를 제거합니다.</li>
	<li>소렌슨의 완충액에서 조직을 헹구고 저온 보호 용액 (글리세롤 20 %, 0.4 M 소렌슨 완충액 20 %, dH2O에서 0.02 % 나트륨 아지드)에 놓습니다.</li>
	<li>사진 짧은 고정 된 뇌 조각, 소뇌, 뇌간 및 모터 피질 (해당되는 경우).</li>
	<li>메스 블레이드로 각 2cm 짧은 고정 척수 섹션에서 2mm 두께의 가로 부분을 잘라냅니다.</li>
	<li>2 mL 번화가 바이알에 섹션을 놓고 4 % PFA에서 2.5 % 글루타랄데히드 용액으로 채웁니다.</li>
	<li>나머지 부분을 원래 20 mL 번화 바이알로 되돌아갑니다. 소렌슨의 완충액으로 섹션을 헹구고 저온 보호 용액으로 교체하십시오.</li>
</ol>3. 병리학
참고: 오른쪽 반구의 짧은 고정 슬라이스뿐만 아니라 긴 고정 왼쪽 반구 (몇 달 동안 4 % PFA에 배치) 중 30 μm 섹션으로 절단 (자유 부동이라고함) 또는 파라핀에 포함 및 12-14 μm 섹션으로 잘라 (라고도 함). 파라핀 내장). 이 단면도는 디아미노벤지딘 (DAB) 방법을 사용하여 면역 활동을 위한 탈수레화 병변 및 주요 조직 적합성 복합체 II (MHC-II)를 검출하기 위한 프로테올리피드 단백질(PLP)으로 일반적으로 처리됩니다. 이 프로토콜은 표준화되어 여러 간행물2,3,4,5,6,7,8,9에서 사용되었습니다. , 10개 , 11세 , 12.
<ol><li>
자유 부동 (30 μm) DAB-아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 조직 염색
	<ol>
<li>저온 저장 용액에서 섹션을 제거하고 6 웰 플레이트로 섹션을 옮기고 1 x 인산 완충 식염수 pH 7.0 (PBS)의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x를 씻습니다. 다음 우물로 잘 옮길 때 6웰 플레이트에서 사용 관리를 하여 조직을 찢어버리지 않도록 주의한다. 각 세척 및 배양 단계에서 6웰 플레이트를 셰이커에 놓고 티슈가 부드럽게 흔들릴 수 있도록 합니다. 참고: 더 작은 부피와 더 큰 플레이트(즉, 12-및 24웰 플레이트)에서 배양된 조직 섹션은 표면 및 가장자리 찢어짐을 나타내는 경향이 있다.</li>
		<li>약 30 mL의 10 mM 구연산완충 (pH 6.0)을 포함하는 유리 비커에서 마이크로 웨이브 섹션에 의해 항원 검색을 수행합니다. 2-3 분 동안 또는 구연산염 완충제가 끓기 시작할 때까지 페인트 브러시와 전자 레인지 섹션으로 조작하여 조직을 접지 마십시오. 단면이 실온(~20분)까지 식힙니다.</li>
		<li>6웰 플레이트로 다시 섹션을 옮기고 PBS/0.3% 트리톤 X-100의 2 mL에서 각각 5분 동안 3x의 세척 섹션을 전송합니다. 3% H2O2/0.3% 트리톤 X-100/PBS의 2 mL에서 2 mL의 섹션을 실온에서 30분 동안 배양하여 내인성 과산화증을 차단합니다(RT).</li>
		<li>PBS/ 0.3% 트리톤 X-100의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x 세척합니다. RT에서 1 시간 동안 3 % 일반 염소 혈청 / 0.3 % 트리톤 X-100 / 1x PBS의 2 mL의 블록 섹션.</li>
		<li>1차 항체에서 1차 항체에서 밤새 5일(항체에 따라 다름)을 배양하여 염증(MHCII) 및 탈수초화(PLP)를 검출하기 위해 마이크로글리아 및 미엘린 에피토프를 4°C에서 검출하였다. 참고: 이 단계 또는 후속 단계에서 배양할 때 섹션이 접히지 않도록 하십시오.</li>
		<li>1x PBS의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x 섹션을 세척하십시오. 그런 다음 이차 생체 측화 항체에서 섹션을 배양 (재료 표참조) RT에서 1 시간 동안 아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 용액을 다음 세척 단계 전에 약 45 분 동안 준비하여 ABC 복합체가 형성될 수 있도록합니다.</li>
		<li>1x PBS의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x 섹션을 세척하십시오. 그런 다음 RT에서 1 시간 동안 ABC에서 섹션을 배양합니다.</li>
		<li>1 x PBS의 2 mL에서 각 5 분 동안 3 회 세척하십시오. H2O2 (DAB에서 30 % H2O 2의 1 : 500 희석)를 포함하는 여과 된 DAB (2 mL / well / 섹션)에서 배양 단면은 색상이 적절하게 발전 할 때까지 (~ 3-8 분).</li>
		<li>1x PBS의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x 섹션을 세척하십시오. 신호(선택 사항)를 향상시키기 위해 0.04% OsO 4(~30s)를 사용하여 osmicate합니다.</li>
		<li>1x PBS에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다. 개별적으로, 6 웰 플레이트에서 1x PBS로 가득 찬 작은 용기로 각 섹션을 옮기고 가능한 한 평평한 유리 슬라이드에 조직 섹션을 배치합니다.</li>
		<li>조직 섹션이 가능한 한 평평하도록 하면서 PBS에서 슬라이드를 부드럽게 들어 올립니다. 두 개의 페인트 브러시를 사용하여 부드럽게 평평하게 하고 슬라이드에서 티슈를 펴고 종이 타월로 여분의 물을 두드려 냅니다. 글리세롤 (또는 동등한 장착 매체)로 티슈 섹션을 장착하고 뚜껑슬립을 명확한 매니큐어로 밀봉하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 파라핀 내장 반구형 섹션 : DAB 염색
<ol><li>파라핀을 60°C 오븐에서 5-10분 동안 녹입니다.</li>
	<li>자일렌 3x를 각각 5분 동안 배양하여 절충면을 탈파라핀화합니다.</li>
	<li>등급이 매겨진 에탄올에서 조직을 100%(각각 5분마다 2회), 95%(5분마다 2회), 70%(5분마다 2회), 50%(각각 5분마다 1회) 재수화합니다. PBS의 슬라이드를 덮습니다.</li>
	<li>항원 10 mM 구연산 완충제 (pH 6.0)의 비커에서 슬라이드를 마이크로 웨이브하여 검색합니다.</li>
	<li>1x PBS(각 5분당 3x)로 슬라이드를 실온으로 식힌 후 세척합니다. 3% H2O 2/1% 트리톤-X 100/PBS에서 조직을 30분 동안 배양하여 내인성 과산화증을 차단합니다.</li>
	<li>1x PBS로 티슈를 각각 5분동안 3회 세척합니다. 1 시간 동안 PBS에서 6 % 정상 염소 혈청으로 조직을 차단하십시오.</li>
	<li>1 차 항체의 섹션 (재료 표참조)을 상온 (RT)에서 하룻밤 (최대 20 시간)에서 PBS로 배양합니다.</li>
	<li>1x PBS에서 각각 5분 동안 3x세척합니다. 그런 다음 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 해당 이차 항체 (재료 표참조)에서 섹션을 배양합니다.</li>
	<li>배양 시 다음 세척 단계 전에 약 45분 전에 ABC 용액을 준비합니다.</li>
	<li>1x PBS에서 각각 5분 동안 3x 섹션을 세척한 다음 RT에서 1시간 동안 ABC에서 배양합니다.</li>
	<li>1x PBS에서 각각 5분 동안 섹션 3을 세척합니다.</li>
	<li>H2O2(DAB에서 30% H2 O2의 1:500 희석)를 함유하는 DAB(0.45μm 필터 기공 크기)에서 배양단을 적절히 발전시킬 때까지(~3-8분).</li>
	<li>1x PBS로 섹션(3x 5분)을 세척합니다. 신호를 향상시키기 위해 0.04 % 오스뮴 테트 옥사이드 (OsO4; 약 30 s)를 사용하여 osmicate.</li>
	<li>1x PBS로 세척 섹션(3x 5분).</li>
	<li>에탄올 50% (1x 5 분), 70 % (1 x 5 분), 95 % (2 x 5 분), 100 % (2 x 5 분), 100 % 자일렌 (1x 5 분)의 등급이 매겨진 시리즈에서 조직을 탈수. 자일렌이 증발하도록 허용합니다.</li>
	<li>톨루엔 기반의 급속 건식 마운팅 매체로 섹션을 장착합니다. 산화제를 함유한 제제는 얼룩 표백을 방지하는 것이 좋습니다. 후속 보관을 위해 면도기로 슬라이드 가장자리에서 과도한 장착 매체를 제거합니다.</li>
</ol>5. MRI/병리학 상관 관계
참고: 병리학과 MRI의 상관 관계를 위해, 우리는 먼저 슬라이스 슬롯을 나타내는 MRI 가시 마커와 조정 가능한 상자에 긴 고정 그대로 뇌 반구 (단계 2.9 위의 단계)의 ex vivo MRI를 수행합니다. 그런 다음 뇌를 슬라이스하고 1cm 슬라이스를 촬영하여 개별 뇌 조각에 대한 situ MRI의 공동 등록을 가능하게합니다. 그런 다음 MRI 유도 분석을 수행할 수 있으며, 관심 영역(ROI)이 MRI에서 조직 분석을 직접 식별합니다. 우리는 또한 조직 병리학 유도 분석을 수행할 수 있습니다., 어디 ROI 조직 (예를 들어, 백색 물질 병 변, 탈수 초 없이 백색 물질 등)에 다음 공동 지역화 된 MRI 측정을 특징으로(표1).
<ol><li>
MRI 기반 ROI 식별 참고 : 이전 연구에서, 우리는 백색 물질11,12,13,14,15 및회색 물질16,17에서 ROI를 확인했습니다. 18. 아래의 예는 백색 물질 분석을 위한 것입니다.<ol>
<li>세그먼트 T2 초강렬한 병변에 (단계 1.1에서) 처음에 자동 알고리즘에 의해 처리되고, 그 후 숙련된 사용자에 의해 수동으로 정정됩니다.</li>
		<li>T2 병변 내의 세그먼트 T1 저강렬한 병변은 주변 정상 나타나는 뇌 조직의 신호 강도의 80% 이하 또는 동일한 신호 강도를 가진 복셀로 나타난다.</li>
		<li>80% 임계값을 가진 자화 전달 비율(MTR) 맵에서 저강도 영역을 분할합니다.</li>
		<li>위의 세분화를 사용하여 세 가지 분류를 만듭니다: (a) T2 가중/FLAIR 스캔에 비정상이지만 T1 가중 또는 MTR 스캔에서 정상인 T2-전용 병변, (b) 모든 T2 가중치/FLAIR, T1 가중치 및 MTR 스캔에 비정상인 T2T1MTR 병변; (c) 모든 T2 가중치/FLAIR, T1 가중치 및 MTR 스캔에서 정상인 정상 나타나는 백색 물질(NAWM)입니다. 참고: 당사의 슬라이스 선택은 동일한 슬라이스에 있는 세 가지 관심 지역 유형(T2 전용, T2T1MTR 및 NAWM)의 존재를 기반으로 합니다.</li>
		<li>각 ROI에 대한 정규화된 강도를 계산하여 서로 다른 뇌와 다른 뇌 위치에서 발생하는 변동성을 최소화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
뇌 슬라이스에 대한 시투 MRI의 공동 등록
	<ol>
<li>MRI에 민감한 마커의 네 행이 뇌를 슬라이스하기 위해 칼을 삽입 할 수있는 슬롯을 지역화 사용자 정의 슬라이스 상자에 고정 뇌 반구를 스캔합니다. 고정 된 뇌와 모든 마커를 덮는 1mm 등방성 해상도로 T1 가중치 3D MPRAGE 수집을 수행합니다. 참고: 이것은 사후 고정 MRI에게 불리고 두뇌 조각에 있는 situ MRI의 공동 등록을 위한 중간 단계로만 이용됩니다.</li>
		<li>스캔 직후, 1cm 떨어진 슬롯에서 뇌 반구를 슬라이스하여 약 15개의 슬라이스를 생성합니다.</li>
		<li>전방과 후방 양쪽모두에서 뇌 슬라이스를 촬영합니다.</li>
		<li>다음 단계로 뇌 슬라이스의 시투 MRI 및 사진을 공동 등록합니다.<ol>
<li>사후 고정 및 시투 MPRAGE의 세분화의 경우, 강도 비 균일성에 대한 사후 고정 및 시투 MPRAGE MRI 를 모두 사전 처리합니다19.<ol>
<li>사전 처리 된 후 고정 MPRAGE에서 뇌와 마커의 네 행을 분할합니다.</li>
				<li>사후 고정 MRI(20)에해당하는 반구를 분할하여,21을 미리 처리된 곳에서 MPRAGE로 분류한다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>FSL FLIRT22를사용하여 최대 12도자유도(affine registration)의 선형 등록 프로세스를 통해 일련의 선형 등록 프로세스를 통해 현면 및 사후 고정 MRI에서 추출된 뇌를 공동 등록합니다. 크기 조정 및 전단 구성 요소는 고정 수축의 영향을 고려합니다.</li>
			<li>분할된 마커를 사용하여 최대 투영 강도의 합을 최소화하여 슬라이싱 평면의 법선 방향을 찾습니다. 이러한 재방향 각도는 이전 단계에서 얻은 변환 행렬에 통합됩니다.</li>
			<li>MRI 이미지를 사내 이미지 뷰어를 사용하여 고정 된 후방 뇌 조각의 사진과 시각적으로 일치하여 일반 벡터의 깊이와 방향을 변경할 수 있습니다. 뇌 슬라이스가 불완전하기 때문에 작은 수정이 필요합니다.</li>
			<li>각 슬라이스에 대해 AFFINE 이미지 변환13을 적용하여 in situ MRI를 뇌 슬라이스의 사진과 동일한 슬라이스 위치로 변환합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+an+immune+or+neurodegenerative+disorder%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li>
<li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li>
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<li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li>
<li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li>
<li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).</li>
<li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neuronal+densities+and+cerebral+white+matter+demyelination+in+multiple+sclerosis%3A+a+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study.</a> Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).</li>
<li>Young, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+correlates+of+decreased+axonal+Na%2B%2FK%2B+ATPase+in+chronic+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions.</a> Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).</li>
<li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).</li>
<li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+correlates+of+leukocyte+accumulation+and+CXCR4%2FCXCL12+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Archieves+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis.</a> Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).</li>
<li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+normal-appearing+white+matter%3A+pathology-imaging+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations.</a> Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).</li>
<li>Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T1-%2FT2-weighted+ratio+differs+in+demyelinated+cortex+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).</li>
<li>Chen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li>
<li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLADA%3A+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li>
<li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+of+Medical+imaging%22%5BJournal%5D)">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).</li>
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<li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation%3A+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).</li>
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<li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

우리는 MS를 가진 150명의 개별에게서 조직을 급속하게 조달하고 가공하기 위하여 이용된 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜의 중요한 특징은 조직을 활용하는 과학자도 프로토콜을 확립하고 조직 수집을 수행하는 것을 담당한다는 것입니다. 이것은 개별 연구 프로젝트의 과학적 요구를 충족시키는 유연성을 제공합니다. 이 프로토콜의 여러 측면은 유틸리티를 향상시킵니다. 환자는 일반적으로 그들의 많은 우리의 센터에 신경학자에 의해 선행되었기 때문에, 죽음의 앞에 잘 특성화됩니다. 중요한 단계는 다른 두뇌 은행에 비해 냉동 조직의 질을 증가 죽음 직후 조직 기증의 처리입니다. 이것은 조직학 및 면역 세포화학적 관측의 입증을 위해 필수적인 전사 및 번역 유전자 제품에 있는 변경을 기술하기에 있는 중대한 가치인 분자 연구 결과를 가능하게 합니다. 여러 사례에 걸쳐 형태학적/면역세포화학적 및 분자 데이터를 활용하면 결론의 신뢰성이 향상됩니다. 이것은 가장 대뇌 피질과 탈수근 해마의 신경 유전자 변화에 미토콘드리아 유전자 변화의 우리의 설명에 의해 설명된다. 새로운 유전자 프로파일링 프로토콜은 빠른 속도로 개발되고 있으며 우리 은행의 냉동 조직은 조직 및 단일 세포 분석을 위한 고품질 RNA를 제공해야 합니다.
우리의 프로토콜의 또 다른 가치있는 측면은 짧은 고정 뇌 조각입니다. 이 조직은 30 μm 두께의 자유 부동 섹션으로 절단됩니다. 이 단면도는 공초점 현미경 검사법을 사용하여 3차원으로 2개 이상의 항원을 분석하기 위해 이상적입니다. 좋은 예로는 만성 MS 병변의 영양 실조 축삭과 사전 골수성 올리고드로시트 프로세스의 상호 작용뿐만 아니라 transected 축삭 수축 전구에 대한 단일 축삭 연결의 식별이 포함됩니다. 이는 3D 이미지가 실현 불가능한 7μm 두께의 파라핀 섹션을 일상적으로 사용하는 것과는 대조적입니다. 파라핀 내장 된 조직은 몇 가지 질문, 특히 반구형 7 μm 두께의 섹션에서 신경 밀도의 정량화에 큰 가치를 가지고 있습니다. 따라서 당사의 조직 처리 프로토콜은 다양하며 고정 및 급속 냉동 조직을 보장할 수 있는 유연성을 제공합니다.
우리의 프로토콜의 또 다른 독특한 특징은 situ 뇌 MRI의 사후 분석입니다. 뇌 MRI는 MS 질병의 대체 할 수없는 바이오 마커입니다. 따라서 비정상적인 MRI 신호의 병리학적 상관 관계를 확립하는 것이 필수적입니다. 우리의 연구는 T2 만 T2와 T2T1MTR ROI가 수시로 myelinated 된다는 것을 것을을 확립했습니다. 이 발견은 myelinated와 탈수초 된 대뇌 백색 물질을 안정적으로 구별하는 보다 구체적인 이미징 양식의 필요성을 뒷받침합니다. MRI는 myelin의 검출을 위해 과민한 것처럼 보이지만, 우리의 연구 결과는 T1/T2/MTR의 조합조차 균수레를 확인하기 위한 특정이 아니라는 것을 보여줍니다. 우리의 사후 프로토콜은 myelinated 및 demyelinated 대뇌 백색 물질을 구별하는 새로운 화상 진찰 양식의 기능을 시험하기위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다. MRI는 또한 우리의 번역 연구에서 MRI의 사용과 살아있는 환자에서 의 광범위한 임상 사용을 감안할 때, 임상 연습으로 기초 과학 결과의 번역을위한 이상적인 차량을 제공합니다.
단가 및 긴 고정 및 냉동 슬라이스를 절단하는 동안 다른 연구에 대한 여러 모드에서 조직을 처리하는 이점을 제공하지만,이 방법에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 구조의 전체를 평가하는 것은 인접 한 슬라이스에 다르게 처리 될 수 있기 때문에 제한 될 수 있습니다. 조직 은행의 큰 볼륨, 그러나, 샘플링을 개선하기 위해 여러 과목에 관심의 구조를 조사 할 수있는 능력을 제공합니다. 사후 조직을 활용하는 연구에 대한 또 다른 일반적인 제한은 단면이라는 것입니다. 변경 의 시기와 진행에 관한 결론은 이 맥락에서 해석되어야 합니다. MS를 가진 모든 환자에게 데이터의 일반화를 제한할 수 있는 그들의 조직을 기증하는 환자에게 선택 편향이 있을지도 모릅니다. 대부분의 기증자는 향상된 MS의 합병증때문에 정지하기 때문에, MS의 초기 단계에 있는 사람들에 이 환자에게서 사실 인정을 추정하는 것은 적절하지 않을 지도 모릅니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 비 MS 관련 조건 (즉, 급성 심근 경색, 약물 과다 복용, 자살)에서 사망 한 젊은 환자로부터 조직을 받았습니다. 우리의 프로토콜의 범위는 MS에 연루 된 다른 장기 (예를 들어, 위장 및 골수)의 샘플링을 포함하지 않습니다. 우리는 프로그램의 강점이 그 한계보다 훨씬 중요하다고 믿습니다.

질병을 연구하는 가장 좋은 방법 중 하나는 병에 걸린 조직 자체를 검사하는 것입니다. 이것은 중추 신경계 (CNS)의 질병을 공부하는 사람들에게 도전을 제시합니다. 병에 걸린 뇌와 척수의 생검은 극히 드물며 일반적으로 비정형 사례를 수반합니다. CNS 질병을 가진 개별을 위한 부검 비율은 최근에 극적으로 감소하고, 수행될 때, 수시로 조직의 급속한 조달을 제공하지 않습니다. 이러한 도전은 다발성 경화증 (MS)를 가진 개별에게서 조직을 수집에 집중된 몇몇을 포함하여 질병 중심의 두뇌 은행의 설치 귀착되었습니다. MS는 미엘린, 올리고엔드로시테스(미엘린 형성 세포), 뉴런 및 축삭을 파괴하는 중화민혈관의 염증 매개 질환입니다. MS 환자의 대다수는 결국 자연에서 퇴행성 가능성이 있는 점차적으로 진보적인 질병으로 발전하는 가변적인 복구를 가진 신경장애의 시합으로 시작하는이중 상이한 질병 과정이 1. 기증된 MS 두뇌의 대다수를 위해, 사후 처리 간격 (PMI) 죽음과 조직 처리 사이 24 h를 초과합니다. 이 조직은 MS 두뇌에 있는 병리학적인 변경에 관하여 귀중한 정보를 제공하더라도, 질병 병리생리학에 강력한 통찰력을 제공할 수 있는 더 진보된 분자 연구 결과적합하지 않습니다. 이것은 손상되지 않은 RNA를 요구하는 유전자 프로파일링 연구 결과를 위해 특히 케이스입니다.
위에서 설명한 한계를 극복하기 위해 MRI/병리학적 상관 관계를 허용하는 신속한 조직 기증 프로그램을 개발했습니다. 이 프로토콜은 현대 분자 연구에 적합한 잘 보존 된 조직을 제공하고 MS 뇌의 뇌 병리학 및 MRI 이상을 직접 비교할 수 있습니다. 클리블랜드 클리닉 다발성 경화증 조직 기증 프로그램은 20 년 이상 존재해 왔습니다. 이 급속한 조직 기증 프로그램은 MS 및 그밖 관련한 자기 면역 신경학상 조건을 가진 개별에게서 두뇌 그리고 척수를 조달합니다. 이 프로그램은 조직 처리를 위한 두뇌 및 척수의 제거에 선행된 죽음의 6 시간 안에 있는 situ MRI에서 장악하는 것을 목표로 합니다.
모집 기부금은 환자 (사전 동의)에서 직접 얻은 앤티 모템 동의를 통해 또는 사망 후 친척의 다음에서 얻어진다. 사전 동의된 환자는 전형적으로 클리블랜드, 오하이오에 있는 다발성 경화증 처리 및 연구를 위한 Mellen 센터에 임상 인구에서 확인됩니다. 급속한 조직 기증 프로그램에서 모집에 있는 특혜는 세로 연구 결과에서 따랐던 환자에게 주어지더라도, 센터에서 보인 모든 환자에게 열려 있습니다. 사망 전에 등록한 참가자는 사망 시 또는 사망이 임박한 것으로 생각될 때 가족 구성원 또는 의료 제공자에게 연구 팀에 연락할 수 있는 지침을 받습니다. 개인이 조직 기증 프로그램을 입력하는 두 번째 방법은 친척의 다음동의를 통해 사망시입니다. 오하이오 주는 오하이오 북동부 의 20 개 카운티에서 운영되는 LifeBanc라는 연방 정부가 위임 한 기관 조달 기관에 사망을 언급해야합니다. LifeBanc는 장기 기증을 위한 제외인 MS의 진단을 위한 모든 죽음을 스크린합니다. LifeBanc은 클리블랜드 클리닉에서 75 마일 반경 내에서 발생하는 MS의 관련 진단으로 모든 사망에 대한 MS 조직 기증 프로그램에서 수사관에게 알리기 위해 준비되었습니다. 다음 친척과 병원 직원은 조직 기증 프로그램 직원에 의해 연락을 받고 뇌및 척수 조직의 기증에 대한 동의를 얻습니다. LifeBanc을 통해 모집 앤티 모템과 사후 모템의 이 두 가지 방법은 연간 약 10-12 개의 뇌 기부를 초래합니다. LifeBanc에서 파생된 추천 수를 관리하기 위해 사망 연령 상한선을 조정합니다.
기부금 조달 이 프로그램은 조직 조달을위한 조직 기증 프로그램의 구성원에 의해 24 시간 범위, 365 일 년 을 필요로합니다. 중앙 조직 기증 알림 이메일 / 호출기 / 모바일 장치 텍스트 알림 시스템은 조직 기부를 포함하는 임상 팀에 의해 사용됩니다. LifeBanc은 조직 기증 프로그램을 위해 대기 직원에게 연락할 수 있는 번호를 제공합니다. 회원은 병원 제공자/친족(사전 동의) 또는 LifeBanc 및 기타 추천 출처에 의해 사망 사실을 통보받습니다. 첫째, 사망 시점과 조직 기증에 대한 타당성을 결정합니다. 죽음은 잠재적으로 가난한 품질의 조직귀착되는 조건에 대 한 스크리닝, 장기간된 pre-mortem 저산소증을 포함 하 여, 대규모 파괴적인 뇌 조직 (예를 들어, 큰 두 개 내 출혈, 광범위 한 bi-반 반 구 성 뇌졸중, 광범위 한 종양 장기간 인공호흡기 지원(>3일), 사망 전 혈관활성제(>3일) 장기간 사용. 의학 검사관이 죽음에 관여하는 경우에, 연구 신경학자는 의학 검사관의 책임을 손상시키지 않고 적시에 조직을 수신하는 쪽을 탐구하기 위하여 의학 검사관과 이야기할 수 있습니다. 실행 가능한 조직이 존재한다고 생각되면 서면 동의가 얻어지고 (사전 평가를 얻지 못하면) 신체 수송을 위한 준비가 이루어집니다. 이전에 계약된 사망자 운송 서비스는 클리블랜드 클리닉의 MRI 시설로 이동하기 위해 연락을 취합니다. 낮은 체온이 MRI 신호 특성의 변경과 관련이 있기 때문에 신체가 실온에 남아 있고 냉장에 배치되지 않도록주의를 기울입니다.
임상 이력 임상 병력은 MS의 진단에 대한 세부 사항을 포함, 증상의 발병, 사용 된 치료, 임상 및 파라 임상 테스트의 결과 (연상 잠재력, 뇌척수액 결과, 광학 일관성 단층 촬영), 다발성 경화증 기능성 복합 의료 기록(사용 가능한 경우)에서 수집되는 확장된 장애 상태 척도(EDSS; 실제 또는 추정), 다음 친척에 대한 직접 인터뷰. 전 모템 MRI도 수집됩니다.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated 염소 반대로 쥐 IgG</td><td>벡터 실험실</td><td>BA-9200</td><td>반구를 위한 1:500 희석; 30&micro를 위한 1:1,000; m 자유 부동. RRID: AB_2336171</td></tr><tr><td>Biotinylated 염소 안티 토끼 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td>1:500 희석.</td></tr><tr><td>Biotinylated 염소 안티 쥐 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9400</td><td>반구에 대한 1:500 희석;30&micro의 경우 1:1,000; m 자유 부동. RRID: AB_2336208</td></tr><tr><td>신경교섬유산 단백질(GFAP)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:700 반구용 희석. RRID: AB_10013382</td></tr><tr><td>HuR, 마우스 IgG, 3A2 클론</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5261</td><td>1:500 30&micro; m 자유 floating. RRID : AB_627770</td></tr><tr><td>주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 II HLA-DR CR3 / 43</td><td>Dako</td><td>Mo746</td><td>1 : 반구에 대한 250 희석; 1 : 30 &micro의 경우 500; m 자유 부동. RRID: AB_2313661</td></tr><tr><td>Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td>반구의 경우 1:5,000 희석; 30 &micro의 경우 1:2,500; m 자유 부동 . RRID : AB_2564642</td></tr><tr><td>인산화 신경 필라멘트 (SMI31)</td> <td>Biolegend</td><td></td><td>801601 반구의 경우 1 : 5,000 희석; 30 &micro의 경우 1 : 2,500; m free-floating. RRID:</td></tr><tr><td>AB_2564641 Proteolipid protein (PLP)</td><td>Gift from Wendy Macklin</td><td></td><td>1:250 dilution for IHC; 대체 항-PLP 항체 시판.</td></tr><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>125 mm 여과지</td><td>Whatman</td><td>1452-125</td><td>PFA 여과용.</td></tr><tr><td>50% 글루타르알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16320</td><td>전자 현미경 등급.</td></tr><tr><td>Cytoseal</td><td>ThermoScientific</td><td>8310-16</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP230-4</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td>400 mL/2 L 극저온 보호 용액.</td></tr><tr><td>Millex-HV 주사기 필터 장치, 0.45 &마이크로; m, PVDF, 33mm, 감마 멸균</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19200</td><td>Prills 형태.</td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈(PVP-40)</td><td>피셔 케미컬</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>피셔 케미컬</td><td>S227I</td><td>2g/2L 소렌슨 버퍼.</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0876</td><td>98.8g/2L 소렌슨 완충액.</td></tr><tr><td>인산나트륨 모노 염기성 일수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9638</td><td>14.352g/2L 소렌슨 완충액.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40-500G</td><td></td></tr><tr><td>VectaStain ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>1:1,000 A 및 B. RRID 희석: AB_2336819</td></tr><tr><td>방수 드로잉 검정 잉크</td><td>Higgins</td><td>44201</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3S</td><td>조직학적 등급.</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T MRI Magnetom Prisma</td><td>시멘스 헬시니어스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7T MRI 애질런트 830AS</td><td>지멘스 헬시니어스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

다발성 경화증을 가진 개별을 위한 포괄적인 부검 프로그램

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

우리는 다발성 경화증 (MS)를 가진 개별을 위한 급속한 조직 기증 프로그램을 기술합니다 과학자와 기술자는 24/7, 365 일 1 년에 대기할 것을 요구합니다. 참가자는 뇌와 척수를 기증하는 데 동의합니다. 대부분의 환자는 MS 처리 및 연구를 위한 클리블랜드 진료소 멜렌 센터에 신경학자에 의해 선행되었습니다. 그들의 임상 과정과 신경 장애는 잘 특성화되어 있습니다. 죽음 직후, 바디는 3 T 자기 공명 화상 진찰 (MRI)에 의해 두뇌가 그(것)들에서 검사되는 MS 화상 진찰 센터로 수송됩니다. 시신은 부검실로 옮겨져 뇌와 척수를 제거합니다. 뇌는 두 개의 반구로 나뉩니다. 한 반구는 즉시 슬라이스 상자에 배치하고 대체 1cm 두께의 슬라이스는 이틀 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정되거나 드라이 아이스와 2 메틸 부탄에서 빠르게 얼어 붙습니다. 짧은 고정 된 뇌 조각은 동결 보존 용액에 저장되며 조직학적 분석 및 민감한 항원의 면역 세포 화학 적 검출에 사용됩니다. 냉동 슬라이스는 -80 °C에 저장되고 분자, 면역 세포 화학 및 현장에서 혼성화 / RNA 범위 연구에 사용됩니다. 다른 반구는 몇 달 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 배치, 슬라이스 상자에 배치, 3 T 자기 공명 (MR) 스캐너에서 다시 스캔하고 센티미터 두께의 조각으로 슬라이스. SITU MR 이미지(MRI)의 사후 처리는 MRI-병리학 상관 관계를 용이하게 하기 위해 1cm 두께의 뇌 슬라이스와 공동 으로 등록되어 있습니다. 모든 뇌 조각은 촬영되고 뇌 백색 물질 병변이 확인됩니다. 척수는 2cm 세그먼트로 절단됩니다. 대체 세그먼트는 4% 파라포름알데히드 또는 급속냉동에 고정된다. postmortem MS 조직의 급속한 조달은 MS 두뇌 및 척수 및 두뇌 MRI 이상의 병리학적인 상관관계의 병리학적 및 분자 분석을 허용합니다. 이 급속하게 가공된 사후 조직의 질 (일반적으로 죽음의 6 시간 안에) MS 연구에 중대한 가치이고 많은 고충격 발견 귀착되었습니다.

다발성 경화증은 치료법이없는 염증성 탈수성 질환입니다. 뇌 조직의 분석은 질병의 발병 기전을 이해하는 중요한 단서를 제공합니다. 여기에서 우리는 클리블랜드 클리닉에서 운영하는 독특한 신속한 부검 프로그램을 통해 수집 된 MS 뇌 조직의 방법론 및 하류 분석에 대해 논의합니다.

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

우리의 연구의 목표는 다발성 경화증의 병인을 공부하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해 우리는 MS를 가진 개별에게서 두뇌를 얻고 공부하기 위하여 급속한 부검 프로그램을 설치했습니다. 우리의 부검 프로그램의 두 가지 특별한 측면이 있다, 첫 번째는 신속 하다. 우리는 죽음의 6 8 시간 미만의 뇌를 수집합니다.이것은 예술 분자 연구의 상태를 허용합니다. 두 번째 측면은 우리가 두뇌를 움직이기 전에 시투 MRI에서 할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 병리학적 변화와 뇌 이미징 변화의 상관 관계를 맺을 수 있습니다.시각적 데모를 통해 시청자는 최적의 결과를 얻기 위해 시간과 공간을 구성하는 방법을 이해할 수 있습니다. 신속하고 신중하게 발생하는 조직 처리는 RNA 분석, 면역 염색, 면역 블로팅 및 MRI 상관 관계를 허용합니다. 새로운 연구원은 가난한 조직 무결성으로 조직을 처리투쟁 할 수 있습니다.긴 사후 고정 시간을 피하는 것이 중요하며 MRI 조직 코드 줄무늬는 도전적일 수 있으므로 MRI 분석 전문가와의 상담이 매우 유용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 에밀리 크리스티와 크리스티나 볼스코입니다. 우리의 실험실에서 기술자.시투 자기 공명 이미징 후, 계량 및 촬영 뇌와 4 %의 파라 포름알데히드 또는 PFA의 용기에 부착 된 듀라를 배치합니다. 소뇌와 뇌간을 뇌관과 분리하고 뇌막을 촬영합니다. 프로브를 사용하여 시신경, 치아즘 및 요관을 분리하고 메스로 구조를 절제하십시오.대뇌 반구를 세로로 분리하고 각 반구를 개별적으로 촬영합니다. 왼쪽 반구에 대한 기본 모터 피질 또는 PMC를 잉크, 조직을 다시 촬영하고 긴 고정을위한 3.3 리터 용기에 조직을 배치. 오른쪽 반구에 대한 PMC를 절제하려면 덮개 수막을 제거하고 조직을 다시 촬영합니다.다음으로 메스를 사용하여 PMC를 다정합니다. 그런 다음 반구 옆에 있는 절제된 PMC를 촬영합니다. PMC를 6개의 크기 섹션으로 자르고 각 섹션의 로스트랄 측면을 잉크로 변환합니다.그런 다음 다른 모든 섹션을 PFA 채워진 컨테이너에 배치하여 짧은 고정을 합니다. 그리고 스냅 은 쿨러 번호 1에 밀봉 된 냉동고 가방에 보관하기 위해 나머지 섹션을 동결. 오른쪽 반구 전방을 후방으로 절단하여 1센티미터 두께의 관상 부단으로 잘라냅니다.PFA의 다른 모든 섹션을 수정하고 스냅은 밀봉 된 냉동고 가방에 보관하기 위해 나머지 섹션을 쿨러 번호 1로 동결합니다. 뇌간을 소뇌로부터 분리하고 뇌간을 PFA 채워진 용기에 넣고 짧은 고정을 하십시오. 각 소뇌 반구를 동등하게 고정된 4개의 처질 섹션으로 자르고 내측 및 측면 보기를 촬영합니다.그런 다음 왼쪽 소뇌 반구 조각을 PFA 용기에 넣고 짧은 고정을 하십시오. 그리고 스냅은 밀봉 된 냉동고 가방에 보관할 수있는 오른쪽 소뇌 반구 슬라이스를 쿨러 번호 1로 동결합니다. 신경 뿌리로 척수를 얻은 후 척수 dura mater를 제거하고 PFA에 듀라를 저장합니다.좌우 전방 및 후방 신경 뿌리를 분리하고 PFA에서 짧은 고정을 위해 척수에서 왼쪽 전방 및 후방 신경 뿌리를 잘라냅니다. 척추 코드에서 오른쪽 전방 및 후방 신경 뿌리를 잘라 스냅 은 쿨러 번호 2에 밀봉 냉동고 가방에 저장하기 위해이러한 조직을 동결. 그런 다음 척수의 가장 20 센티미터를 촬영하고 PFA 짧은 고정 및 스냅 동결을위한 코드의 장밋 방향으로 코달에서 두 센티미터 전송 섹션을 잘라.그런 다음 척수의 나머지 장밋빛 부분을 촬영합니다. 그리고 PFA 짧은 고정 및 스냅 동결을 위한 코드의 장밋 방향으로 코달에서 2센티미터 전송 섹션을 잘라. 짧거나 긴 고정 조직에서 관심 섹션을 잘라.6 개의 우물 접시의 개별 우물에 섹션을 놓고 3 5 분 세척 당 신선한 PBS2 밀리리터에 티슈를 씻어 흔들어 놓습니다. 항원 회수의 경우, 10 밀리몰라 구연산 완충제의 약 30 밀리리터를 포함하는 유리 비커에서 2 ~ 3 분 동안 섹션을 전자 레인지. 섹션이 실온으로 냉각되면 샘플을 새로운 6 개의 우물 플레이트로 옮겨 3 5 분 세척및 PBS 2 밀리리터, 플러스 0.3 % Triton X-100 의 세차세척당.내인성 과산화수소 3%의 2밀리리터와 실온에서 30분 동안 PBS에서 0.3%트리톤 X-100을 차단합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS2밀리리터와 트리톤 X-100의 2밀리리터로 섹션을 세 번 세척하여 세척할 수 있습니다. 그 다음으로 3%의 일반 염소 세럼과 PBS 플러스 트리톤 X-100의 2밀리리터를 실온에서 1시간 동안 차단합니다.다음으로, 4°C에서 관심있는 1 차 항체에서 하룻밤에서 5 일까지 섹션을 배양한 다음 세척 당 PBS2 밀리리터에서 3 5 분 세척합니다. 실온에서 아비딘-비오틴 복합 솔루션 또는 ABC 복합 단지에서 1시간 동안 구역을 배양합니다. PBS에서 3 5 분 세차처리와 함께이 후속.3~8분 동안 과산화수소로 보충된 여과된 Diaminobenzidine의 2밀리리터로 섹션에 라벨을 부착하십시오. 색상이 적절하게 개발되면 PBS에서 섹션을 세 번 세척하고 각 섹션을 PBS 채워진 용기로 개별적으로 옮겨냅니다. 개별 조직 슬라이드 아래에 각 섹션을 평평하게 배치합니다.그리고 PBS에서 각 슬라이드를 부드럽게 들어 올려 섹션을 가능한 한 평평하게 유지합니다. 두 개의 페인트 브러시를 사용하여 각 조직을 부드럽게 평평하게 하고 스트레칭합니다. 그리고 여분의 물을 멀리 두드리기 위해 종이 타월을 사용합니다.그런 다음 적절한 장착 매체로 섹션을 장착하고 명확한 매니큐어로 각 커버 슬립을 밀봉합니다. 조직 섹션은 백색 물질 병변의 존재를 위해 검토되고 선택된 지역은 면역 활동 및 탈민화를 위해 염색됩니다. 급성 다중 Sceloris 병변에서 이러한 탈량제 축축의 많은 횡포 축축의 근접 끝을 반영하는 축 축 회수 전구 역할을.급성 병변에 있는 치석 형축의 밀도는 인접한 비 레지오탈 백색 물질 지구에 있는 단지 15에 비교된 활성 병변에 있는 입방 밀리미터 당 11000를 초과합니다. 새로 생성된 올리고드엔드로키테는 또한 많은 만성 MS 병변에 존재한다. 이러한 프로세스는 데미엘리네이트 축축과 관련이 있지만 myelinate하지는 않습니다.만성 MS 환자로부터 얻은 급속냉동 모터 코르텍스트의 신경 유전자 변화에 대한 대표적인 편견없는 검색은 면역 세포화학및 시상 혼성화를 이용한 23개의 핵 및 코딩된 미토콘드리아 메신저 RNA의 자격 증명 연구에서 상당한 감소를 확인했으며, 이러한 유전자는 피질 프로젝션 뉴런에서 매우 풍부하고 미토콘드리아가 돌전으로부터 분리된 것으로 나타났습니다. 골수화 및 탈모증 해마에서 신경 노드 유전자 발현의 비교는 기억과 학습에 관련된 단백질을 포함하여 신경 메신저 RNA의 감소를 알 수 있습니다. 또한, 관제에 비해, 피질 뉴런 손실은 척수와 대뇌 코르텍스트의 탈모가 있지만 대뇌 백색 물질의 경우는 없는 MS 환자의 하위 집단에서 현저히 더 크다.조직 처리 중에 관상 동맥 단면도가 절단될 때 두께및 방향에 대해 일관되게 절단되는지 확인하십시오. 그리고 그들은 고정에 떠있을 때 또는 얼어 붙을 때 평평하게 놓여 있습니다. 면역조직화학적 분석 외에도 동결조직 수집은 유전적 및 프로테오믹 분석을 수행할 수 있는 기회를 제공한다.이 기술은 MRI에 대뇌 백색 물질 병변을 가진 MS 환자의 새로운 집단의 확인에 도움이 되었지만 어떤 중요한 백색 물질 탈근 없이. Myelocortical MS라고 불림.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

음성을 지원하는 생리적 메커니즘의 목적 평가는 ALS와 사람에서 질병 발병과 진행을 모니터하고 임상 실험에서 치료 효과를 계량이 필요합니다. 이 비디오에서는, 우리는 임상 인구의 음성 모터 성능을 quantifying에 대한 포괄적인, 계측 기반 프로토콜을 제시한다.

루게릭병에 안구 장애의 종합 평가 (ALS)에 대한 프로토콜

루게릭병 (ALS)에 대한 마우스 모델은 임상 및 behaviorally 면밀히 검토합니다. 동반 immunohistological 분석을위한 전제 조건으로서 척수의 준비가 상세하게 그려져 있습니다.

루게릭병에 대한 마우스 모델 (ALS)의 임상 시험 및 척수 제거

다발성 경화증이 있는 환자의 머리를 MRI 기계의 무선 주파수 또는 RF 코일 내부에 배치합니다.유체 감쇠 반전 회수 또는 FLAIR 이미징을 시작합니다. CSF가 풍부한 영역 근처에 병변이 포함된 뇌 절편을 선택합니다.이 시스템은 강력한 자기장을 생성하여 건강한 뇌 조직과 병변이 있는 뇌 조직의 양성자와 CSF를 그 방향으로 정렬하여 순 자화를 생성합니다.반전 RF 펄스를 적용하여 모든 양성자의 자화를 뒤집어 자기장과 반대 방향으로 정렬합니다.CSF 양성자가 자화가 0에 도달하는 동안 조직 양성자는 일부 잔류 자화를 유지하는 반전 회복 시간을 허용합니다.병변 부위의 양성자는 수분 함량 증가로 인해 정상 조직보다 더 높은 자화를 유지합니다.두 번째 RF 펄스를 적용하여 잔류 자화로 양성자를 여기시켜 감지 가능한 신호를 생성합니다.자화가 전혀 없는 CSF는 신호를 생성하지 않고 어둡게 보입니다.잔류 자화가 높은 병변 부위는 더 강한 신호를 방출하고 주변 조직보다 더 밝게 보입니다.

Fluid-Attenuated Inversion Recovery Magnetic Resonance Imaging - 다발성 경화증 병변을 시각화합니다.

고유 손 근육의 해리 위축, 분할 손이라고, 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)의 특정 기능이 나타납니다. 따라서, 새로운 neurodiagnostic 시험은 모방 질환 ALS 차별화 분할 손의 임상 현상을 정량화하기 위해 개발 된, 분할 색인 손이라고.

루게릭 병의 진단에 해리 고유 손 근육 위축의 유틸리티

다발성 경화증에있는 신경 및 신경 심리학 적 손상과 장애의 정확한 측정은 도전이다. 우리는 새로운 시험, 다발성 경화증 성능 테스트 (MSPT)에 대한 방법 론적 세부 사항을보고한다. MS 관련 장애의 정량화의 목적이 새로운 접근 방식은 MS의 심각도의 정확한 유효 측정을위한 컴퓨터 기반의 플랫폼을 제공합니다.

다발성 경화증 성능 테스트 (MSPT) : 아이 패드 기반 장애 평가 도구

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 기반 이미징 질량 분석기 (MALDI-IMS)와 분자 이미징 생물 학적 샘플에서 여러 analytes의 동시 매핑을 수 있습니다. 여기, 선물이 Alzheimer의 질병과 MALDI IMS를 사용 하 여 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy 샘플의 뇌 조직에 감지 및 아 밀 로이드 β 단백질의 시각화에 대 한 프로토콜.

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징와 인간의 뇌에서 아 밀 로이드 β 예금의 시각화

여기, 선물이 스트로크 (고양이-FAS)의 기능 평가의 전산화 적응 테스트 시스템을 개발 하는 프로토콜. 고양이-FAS 충분 한 안정성 및 관리 효율성과 동시에 4 개의 기능 (두 모터 기능 [위와 더 낮은 사지], 자세 제어, 및 일상 생활의 기본 활동)를 평가할 수 있습니다.

뇌졸중의 기능 평가의 전산화 적응 테스트 시스템

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증의 동물 모델 역할을 합니다. 이 기사에서는 EAE에서 척수 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 채점하는 접근 방식을 설명합니다. 또한, 생쥐 혈청에서 용해성 신경 필라멘트 광 수준을 정량화하는 방법이 제시되어 살아있는 생쥐의 축삭 손상 평가를 용이하게 합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

실험적 자가면역 뇌척수염은 다발성 경화증에서 가장 널리 사용되는 쥐 모델 중 하나입니다. 현재 프로토콜에서는 남녀 모두의 C57BL/6J 마우스에 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드를 면역하여 주로 꼬리와 팔다리의 상행 마비를 초래합니다. 여기서는 EAE 유도 및 평가 프로토콜에 대해 논의합니다.

두 성별의 다발성 경화증 모델링: MOG35-55-유도 실험적 자가면역 뇌척수염

배우세요 다발성 경화증의 병인을 규명하기 위한 급속 부검 프로그램 방법론을. 사후 6~8시간 이내에 뇌 조직을 채취하고 생체 내 MRI를 수행하여 병리학적 변화와 영상 소견을 상관시킵니다. RNA 분석, 면역염색 및 면역블로팅을 위한 조직 처리 기술을 익혀 MS 연구에 활용하세요.

다발성 경화증을 가진 개별을 위한 포괄적인 부검 프로그램

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