인체 배설물 미생물에 대한 중재 식이요법의 효과를 추정하는 시험관 내 배치 배양 모델

다양한 인간 질환에서 장 내 미생물군유전체의 새로운 역할을 고려할 때, 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 다이어트 및 약물과 같은 여러 장내 미생물군유전체 변조기는 장내 미생물군유전체 관련 건강 질환을 개량하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 빠르고 저렴한 선별 시스템은 이러한 장내 미생물군유전체 변조기의 효과를 예측할 수 없지만, 이 시스템은 특정 내정간섭이 궁극적으로 숙주 건강에 영향을 미칠 수 있는 창자 미생물군유전체에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 예측할 만큼 간단합니다. 이 프로토콜은 창자 미생물군유전체 변조기와 미생물및 숙주 건강에 미치는 영향을 조사하는 실험실에서 간단하고 저렴하며 실용적입니다.

무균 및 혐기성 조건의 유지 보수는이 실험에 매우 중요합니다. 또한 배설물 표본은 수집 시 즉시 새롭게 사용해야 합니다. 그렇지 않으면 실험이 나중에 계획되면 주변 온도와 공기에 노출되지 않고 수집 시 즉시 마이너스 80에 샘플을 저장해야합니다.

aliquot 준비 및 파이펫 팅 중 정확도를 처리하는 것도 정확성과 재현성을 유지하는 데 중요합니다. 낮에는 12시간 미만이 소요됩니다. 24시간 안에 샘플을 필요로 하는 경우 하룻밤 사이에 문화를 구축할 수 있습니다.

그런 다음, 짧은 사슬 지방산과 미생물군유전체 결정의 뒤를 따랐다. 이 과정은 두 위대한 유니 학생에 의해 입증 될 것이다, 쇼코 아마디와 라비나 마날리 내 실험실에서. 연기 후드 아래 발효 매체를 준비하려면 자석 혼합물의 시약 병에, 혼합 용액 A, 용액 B, 미량 미네랄 용액, 수용성 비타민 용액, 엽산 비오틴 용액, 리보플라빈 용액, 헤민 용액, 짧은 사슬 지방산 믹스 및 레사쥐린.

그런 다음 병 효모 추출물, 탄산 나트륨, 시스테인 염산염 모노 하이드레이트 및 트립티케이스에 넣습니다. 증류수 296.1 밀리리터를 추가하고, 일반 염산염 또는 수산화 나트륨으로 pH를 조정하여 약 7.0이 되도록 합니다. 비커를 무균 워크스테이션으로 옮기고, 0.22 마이크로미터의 모공 크기가 있는 진공 필터를 사용하여 멸균을 위해 미디어를 필터링합니다.

1리터 혐기성 희석 액액을 준비하려면 염화 나트륨 5그램, 포도당 2그램, 이온화 물에 시스테인 염산염 모노하이드레이트 0.3그램을 녹입니다. 시약 병을 섭씨 121.1도에서 15분간 오토클레이브하고 혐기성 챔버 안에 보관합니다. 발효 실험이 시작되기 전에 혐기성 챔버 내부의 발효 실험에 필요한 모든 재료, 솔루션 및 도구를 최소 48시간 동안 유지하여 잔류산소가 제거되도록 합니다.

발효 실험 전에 적어도 24 시간, 무게 300 이눌린의 밀리 그램, 그리고 50 밀리 리터 튜브로 전송, 다음 혐기성 챔버 내부에 배치됩니다. 26 밀리리터의 멸균 발효 매체를 튜브에 넣고 소용돌이를 섞어 넣습니다. 약 24시간 동안 섬유질을 수분하게 하십시오.

발효 실험의 날은 대변 접종을 준비합니다. 첫째, 50 밀리리터 원모 튜브에 신선한 배설물 샘플 5 그램의 무게를 측정합니다. 튜브에 혐기성 희석 용액을 추가하여 최종 50 밀리리터에 도달합니다.

15 분 동안 또는 완전히 균질화 될 때까지 소용돌이. 혐기성 챔버 내부의 섭씨 37도에서 접종 된 튜브를 유지하고 섬유와 접종을 다시 중단하기 위해 매 시간마다 부드럽게 반전하십시오. 3, 6, 9 또는 24 시간 후에, 발효 된 매체의 적당한 양을 꺼내고, 4섭씨에서 10 분 동안 14, 000 배 g에서 샘플을 원심 분리합니다.

즉시 액체 질소에 상체와 펠릿을 동결, 다음 스냅 동결 후, 짧은 사슬 지방산 분석을위한 상체를 저장하고, 미생물군유전체 분석을위한 펠릿, 영하 80섭씨. 이 프로토콜은 특정 프리바이오틱의 효과를 입증하는 데 사용됩니다. 건강한 인간 과목의 대변은 이눌린으로 치료한 후 9시간 동안 비교적 안정된 pH를 보였으며 24시간 후에 극적으로 떨어졌습니다.

이눌린의 접종은 비처리 배설물 미생물 배양과 비교하여 이눌린 처리된 대변 시편에서 짧은 사슬 지방산 및 젖산의 수준을 현저히 증가시켰습니다. 주요 좌표 분석은 이눌린 처리및 처리되지 않은 견본 사이 베타 다양성의 가중 및 무가중치 UniFrac 측정에 다른 microbiota 조성물을 보여줍니다. PD 전체 나무, 종 풍부함, 운영 분류학 단위, 종 균등뿐만 아니라 주요 필라와 제네라의 상대적 풍부를 통해 알파 다양성 대 물리 유전 적 다양성의 지수는 모두 이눌린 처리 및 치료되지 않은 샘플 사이의 다른 장 내 미생물 을 제시한다.

16S 서열의 선형 차별 효과 크기 분석에서 파생된 분류학 클라도그램은 다양한 샘플 그룹 간의 차별화된 풍부한 taxa를 나타낸다. 모든 단계를 신중하게 따르십시오. 가장 중요한 것은 엄격한 무균 및 혐기성 조건을 유지하는 것입니다.

상체 및 실험에서 섬유에 기반한 발효의 결과로 단락 지방산 수준 변화를 치료하는 데 사용할 수 있다. 추가적으로, 펠릿내는 장내 미생물군유전체 조성물의 변화를 분석하는 데 사용될 수 있다. 문화 매체를 만드는 데 사용되는 일부 화학 물질은 잠재적으로 위험합니다.

MSDS 시트를 기재해 그에 따라 주의하십시오.