Name: 환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 학습하세요 환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA를 검출하고 모니터링하는 디지털 PCR 방법을. 최소 침습으로 종양 돌연변이를 정량 분석하여 치료 결정에 활용할 수 있습니다.

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저자는 모든 환자와 그 가족의 관대함을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 스매싱 호두 재단 (미들 버그, 버지니아), V 재단 (애틀랜타, GA), 가브리엘라 밀러 키즈 퍼스트 데이터 리소스 센터, 어린이 국립 임상 및 번역 과학 연구소의 자금 지원으로 지원되었다 5UL1TR001876-03), 무셀라 재단 (휴렛, NY), 매튜 라슨 재단 (프랭클린 레이크, 뉴저지), 소아 뇌암 연구를위한 라일라비 재단 (실버 스프링, MD), 어린 시절 뇌 종양 재단 (저먼 타운, MD), 어린이 뇌 종양 조직 컨소시엄 (필라델피아, PA), 그리고 소아 암 연구를위한 집회 재단 (애틀랜타, 조지아).

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</ol>

본 원고에 기재된 방법은 자바드 나자리안 & 에시니 판디타라트나에 의한 국제 특허 출원 "암 바이오마커 검출 방법"에 포함되어 있다.

여기에서 우리는 참을성 있는 액체 생검에서 cfDNA에 있는 종양 돌연변이의 eelic 주파수를 검출하고 정량화하기 위한 우리의 방법을 제시했습니다. 당사는 사전 분석 시료 처리, cfDNA 추출, PCR 분석 설계 및 데이터 분석을 포함하여 이 방법의 성공을 위한 중요한 단계를 강조합니다. 사용된 샘플 부피를 제한하기 위해 cfDNA는 1 mL의 혈장에서 추출되지만 CSF의 500 μL만 추출됩니다. CSF에서 추출할 때, 소변의 1 mL에서 추출하기 위한 프로토콜(cfDNA 추출 키트 핸드북12)은제조업체의 권고에 따라 사용된다. 혈장과 CSF 사이에서 요구되는 견본 양에 있는 다름은 뇌종양을 가진 환자의 CSF에 비교된 혈장에서 종양 특정 cfDNA의 더 낮은 수준 때문이, 돌연변이 검출을 위한 더 큰 견본 부피를 필요로하는8. 시료를 사용할 수 있는 경우, 1 mL 이상의 혈장으로부터 추출되어 더 높은 DNA 수율을 생성할 수 있다. 그러나 소아 환자의 경우, 혈액 채취와 같은 간단한 절차조차도 방사선 요법을 받는 소아 환자에게 는 피곤하기 때문에 가능한 한 사용되는 혈액의 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 플라즈마의 1 mL aliquots에서 추출하는 것은 또한 분석이 반복될 수 있는 그런 복제 추출을 가능하게 합니다 (예를 들면, DNA 추출 또는 견본 오염에 있는 실패의 케이스).
반드시 필요하지 않은 샘플 사용을 줄이기 위한 노력의 일환으로 cfDNA는 일반적으로 정량화되지 않습니다. 그러나, 우리는 플라즈마와 CSF에 있는 0.2-2 ng/μL 및 0.6-13 ng/μL 사이 cfDNA 농도의 범위를 각각 찾아냈습니다. 낮은 양의 cfDNA와 종양 특이적 돌연변이 대집합체가 낮은 주파수로 존재한다는 사실을 감안할 때, dPCR에 사용되는 동일한 프라이머 세트를 이용한 사전 증폭 단계는 시료에서 표적 DNA의 양을 현저히 증가시키고, 돌연변이 검출8. DNA 서스펜션 버퍼에서 미리 증폭된 제품을 희석하면 기술 복제에 충분한 부피가 제공되어 진정한 긍정을 구별하는 데 도움이 됩니다. 돌연변이 방울의 수가 낮을 수 있기 때문에 (예를 들어, 혈장 샘플에서 0-2 돌연변이 방울 사이), 기술 복제의 포함은 돌연변이 상태를 해결하기위한 열쇠입니다. 하나의 PCR은 0개의 돌연변이 액적을 산출할 수 있지만, 다른 두 개는 삼중항으로 분석된 단일 혈장 샘플에 대해 1-2를 산출할 수 있습니다. 따라서 복제를 포함하면 돌연변이 상태를 결정할 때 더 높은 정확도를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 MAF는 복제 값의 평균으로 계산됩니다.
다중화 된 사전 증폭 (관심있는 두 가지 돌연변이의 전형 및 돌연변이 대문자)는 동일한 시작 물질이 두 개의 돌연변이를 테스트하는 데 사용될 수 있기 때문에 단일 샘플의 유용성을 증가시킵니다. 중요한 것은, 멀티플렉스 프리앰프 생성물은 여기에 설명된 바와 같이 더 큰 단순성을 위해 dPCR 동안 단일 플렉스에서 분석될 수 있다. 그러나, 전암화 PCR 및 dPCR 모두 다중화될 수 있다. 멀티플렉싱할 때 는 프라이머와 프로브 세트 모두에 대해 조건을 최적화해야 합니다: 프라이머 어닐링 온도는 PCR 증폭에서 함께 실행되도록 유사해야 하며, 프로브는 뚜렷한 클러스터를 생성하도록 설계되어야 합니다(형광 신호 및 강도)를 참조하십시오. 새로운 프라이머 및 프로브 세트를 검증할 때 어닐링 온도 그라데이션을 실행하여 제조업체가 제안한 범위에 따라 최적의 어닐링 온도를 결정합니다. 환자 cfDNA 견본에 프로브를 시험하기 전에, 다른 입력의 합성 DNA 구조물 및/또는 종양 조직 gDNA를 사용하여 그(것)들을 유효하게 합니다 (즉, 최대 10 ng).
표적 DNA에 대한 프로브의 혼성화에서 더 큰 특이성과 감소된 불일치를 가진 돌연변이 대문자의 검출을 위해, 잠긴 핵산(LNA) 프로브가 사용된다. LNA는 리보오스 링 9의 2'-산소 및 4'-탄소를 연결하는 메틸렌브리지를 가진 핵산 유사체이다. 메틸렌 브리지는 유연성을 제한하고 열 이중 안정성을 증가시키고 DNA10,18을대상으로 프로브 혼성화의 특이성을 향상시키는 단단한 bicyclic 변형으로 핵산을 잠그고있습니다. 19. LNA 프로브와 템플릿 DNA 사이에 단일 염기 불일치가 존재하는 경우 프로브와 표적 사이의 이중 형성이 불안정해집니다. 따라서 LNA 프로브는 프로브 결합의 특이성을 향상시키고 더 높은 신호 대 잡음 비11을초래합니다. 비 CNS 병에 걸린 소아 환자에서 플라즈마 와 CSF의 분석은 H3F3A p.K27M을 표적으로 하는 LNA 프로브를 사용하여 우리의 분석의 특이성을 확립했습니다, 0.001% 이하의 allelic 주파수가 거짓 양성으로 간주된다는 것을 결정하기 위하여 8.GC 함량, 앰플리콘 크기, 프로브 리포터 염료 및 퀴커스를 포함한 프로브 및 프라이머의 설계를 최적화하기 위한 추가 고려 사항은 dPCR 제조업체 지침14,17을참조하십시오. 우리의 방법은 RainDance 시스템과 함께 사용하도록 최적화되어 있지만 프로토콜은 다른 dPCR 플랫폼과 함께 사용하도록 조정 될 수 있습니다.
여기에 제시된 방법은 cfDNA에 있는 희소한 종양 돌연변이를 검출하기 위한 선택의 발판으로 남아 있는 dPCR에 의해 달성된 높은 감도 및 표적 농축에서 힘을 그립니다. 강력하지만, dPCR은 단일 분석에서 시험될 수 있는 돌연변이의 수에 제한된다. dPCR에 대한 대안은 차세대 염기서열 분석(NGS)으로, 많은 유전자에 걸쳐 여러 돌연변이를 검출하여 단일 샘플의 유용성을 증가시킬 수 있습니다. NGS는 CSF와 뇌간 gliomas20를가진 환자의 혈장에서 돌연변이를 검출할 수 있습니다, 그러나, 현재 PCR 기지를 둔 접근에 있는 0.001%에 비교된 0.1-10% MAF의 검출 한계를 가진 cfDNA에 있는 종양 돌연변이를 검출에 dPCR 보다는 보다 적게 과민합니다21 . 또한 dPCR은 NGS보다 처리 시간이 단축되어 관심 있는 돌연변이를 신속하게 감지할 수 있습니다. PCR 접근은 암 모형에 걸쳐 적용가능하고 핫스팟 돌연변이 및 메틸화된 cfDNA22를검출하기 위하여 확장될 수 있습니다.
액체 생검은 실제로 그것의 초기 단계에 있고 특정 질병에 맞추기위한 추가 발달을 요구할 것입니다. 종양 진화의 맥락에서 종양 감시는 높은 감도를 가진 신흥 돌연변이를 검출할 수 있는 플랫폼이 요구될 다음 도전이 될 것입니다. 또한 다양한 생체 분자(펩티드, 사이토카인, RNA)를 검출할 수 있는 플랫폼은 치료에 대한 종양 반응을 평가하고 개인화된 임상 개입을 진행하는 데 매우 도움이 될 것입니다.

분자 분석을 위한 종양 조직의 가용성의 한계로 인해, 혈장, 혈청 및 뇌척수액(CSF)을 포함한 환자 생체 유체에서 종양 체세포 돌연변이를 검출할 수 있는 매우 민감한 방법의 개발이 필요합니다. . 예를 들면, 소아 확산 미드라인 신경교종 (DMGs)는 그들의 신경 해부학적인 위치 때문에 도전을 제출합니다. 지난 10 년 동안, DMG 조직 표본의 분자 프로파일링은이 종양 유형 1에서 드라이버 돌연변이를 발견하고 돌연변이의 공간적 및 시간적 이질성을 밝혀, 질병 내에서 환자를 특성화하는 데 필요한 생검을 만들기 서브 그룹 및 분자 표적치료를 촉진 2. 이와 같이, 임상 시험은 선행 진단 3,4,5,6에서종양 분자 프로파일링을 위한 외과 생검을 통합하기 위한 옹호합니다. 치료 중, DMg에서 치료 반응의 모니터링은 MRI로 제한됩니다, 이는 작은 변화 또는 종양 게놈 진화를 감지하는 감도 부족. MRI는 또한 화상 진찰에 참된 진행을 모방하고 종양 반응7의 해석을 잘못 알릴 수있는 종양의 사이트에 의사 진행, 일시적인 염증을 검출하는 경향이 있습니다. 따라서, DMGs는 종양 돌연변이를 검출하고 임상 반응을 모니터링하는 대안, 최소 침습적 수단에 대한 높은 필요성을 가진 종양 유형을 나타낸다. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 중질 질라8을 가진 아이들의 혈장, 혈청 및 CSF에서 cfDNA에 있는 종양 돌연변이를 검출하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발하고 최적화했습니다. 어린 시절 DMGs를 자주 감안할 때 (>80%) 히스톤 변이체 H3.1(H3.1K27M, 20%의 경우) 또는 H3.3(H3.3K27M, 60%의 경우)의 위치에서 체세포 리신-메티오닌 돌연변이를 항만1,이들 및 기타 DMGs의 특징(즉, ACVR1, PIK3R1)을표적으로 하였다. cfDNA8을사용하여 돌연변이 알레일 정량화. 이 분석은 서열 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 다른 종양 유형에서 핫스팟 돌연변이를 검출하도록 맞춤화될 수 있다. 이 접근의 다양성은 cfDNA 기지를 둔 진단 공구 및 치료 감시의 통합에서 유익할 암의 다양한에 적용합니다.
cfDNA에서 낮은 말기 유전자 순도 돌연변이를 민감하게 검출하기 위해, 우리는 액적 디지털 PCR (dPCR) 기반 접근법을 사용합니다. 이 방법에서, PCR 반응 혼합물은 dPCR 플랫폼(예를 들어, RainDance)을 사용하여 이론상 최대 1,000만 방울로 분할되고, PCR당 7-9백만 방울은 일반적으로 실험적으로 잘 볼 수 있다. 높은 수준의 샘플 분할로 인해, 각 액적에 1~2개의 DNA 분자만 존재할 수 있다. PCR 증폭 및 서열별 형광 프로브 혼성화는 각 액적에서 발생할 수 있으며, 따라서 수백만 개의 반응이 일어난다. 이것은 감도를 최대화하고 그렇지 않으면 야생형 DNA의 배경에 대하여 검출되지 않을 지도 모르다 희소한 돌연변이 대틀기의 탐지를 가능하게 합니다. 잠긴 핵산(LNA) 프로브의 활용은 불일치 혼성화를 제한하고정확한 돌연변이 검출9,10,11을지원함으로써 분석의 특이성을 향상시킨다. 여기에서는 시료 처리, cfDNA 추출, 표적 대금 류의 사전 증폭, dPCR 및 데이터 분석 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA 현탁액 버퍼 (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T0227</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg 혈액 채취 튜브 (10 mL)</td><td>Becton Dickinson 진단</td><td>367525</td><td>혈장 채취 용</td></tr><tr><td>BD Vacutainer 플라스틱 혈청 튜브 (10 mL)</td><td>Becton Dickinson 진단</td><td>367895</td><td>혈청 수집 용</td></tr><tr><td>표백제</td><td>일반 실험실 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>버퍼 ATL</td><td>Qiagen</td><td>19076</td><td></td></tr><tr><td>무세포 DNA 채혈 튜브</td><td>스트렉</td><td>218961</td><td>cfDNA 채혈 튜브 (선택 사항)</td></tr> <tr><td>CentriVap 농축기</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>맞춤형 디자인</td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 절대 에탄올(200 proof)</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>돌연변이 프로브</td><td>통합 DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>맞춤형 설계</td></tr><tr><td>PAXgene Blood ccfDNA 튜브</td><td>PreAnalytiX</td><td>768115</td><td>cfDNA 채혈 튜브(옵션)</td></tr><tr><td>PCR 8웰 스트립 튜브 캡</td><td>VWR</td><td>10011-786</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8웰 스트립 튜브</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td></td></tr><tr><td>피펫(p20, p200, p1000)</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 필터 팁(p20, p200, p1000)</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q5 핫 스타트 하이파이티 2x 마스터 믹스</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스 Inc</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp 순환 핵산 핸드북;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>cfDNA 추출 키트 핸드북 (2013년판)</td></tr><tr><td>QIAamp 순환 핵산 키트</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>cfDNA 추출 키트 (프로토콜 단계 4)&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td>소형 (< 또는 =200 &micro; L) 시료 부피</td></tr><tr><td>Qiavac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>QIAamp 순환 핵산 키트와 함께 사용 Raindance</td></tr><tr><td>소모품 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>20-04411</td><td>액적 생성 기기 칩, 정량화 기기 칩, 고속 캡을 포함한 PCR 스트립 캡 및 액적 안정화 오일을 포함합니다</td></tr>. <tr><td>Raindance Sense 기기 Bio-Rad</td><td></td><td></td><td>정량화 기기(에서 사용됨) 프로토콜 단계 9)</td></tr><tr><td>Raindance Source Instrument</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>액적 생성 기기(프로토콜 단계 9에서 사용됨)</td></tr><tr><td>RainDrop Analyst II 소프트웨어</td><td>데이터 분석에 사용되는 RainDance Technologies</td><td></td><td></td> Analyst 소프트웨어(프로토콜 단계 10)</tr><tr><td>Refrigerated Vapor Trap</td><td>Savant</td><td>RVT5105-115</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>맞춤형 설계</td></tr><tr><td>Smartblock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>05 412 506</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genotyping Master Mix</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4371353</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>14 285 562PM</td><td></td></tr><tr><td>WT Probe</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>맞춤형 디자인</td></tr></tbody></table>

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 dna의 검출 및 모니터링

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

선행 및 반복 외과 조직 샘플링과 관련되었던 합병증은 치료에 종양 반응의 분자 하위 분류 및 시간적 모니터링이 가능한 최소 침습 적 플랫폼에 대한 필요성을 제시한다. 여기에서, 우리는 세포 자유로운 DNA (cfDNA)에 있는 종양 체세포 돌연변이의 검출을 위한 우리의 dPCR 기지를 둔 방법을 기술합니다, 참을성 있는 생체 유체에서 쉽게 이용 가능. 각 분석법에서 시험될 수 있는 돌연변이의 수는 제한적이지만, 이 방법은 높은 수준의 민감도 및 특이성을 제공한다. MAF에 의해 계산된 돌연변이 풍부의 감시는, 치료에 종양 반응의 평가를 허용하고, 방사선 사진 화상 진찰에 많이 필요한 보충을 제공하.

그림 1은 DMG를 가진 2명의 아이들로부터 미리 증폭된 플라즈마(위 쪽 패널) 및 CSF(오른쪽 상단 패널) cfDNA에서 H3F3A p.K27M 돌연변이의 성공적인 검출을 위한 대표적인 결과를 나타낸다. cfDNA 샘플은 복제로 분석되었지만 각 샘플 유형에 대해 하나의 대표 그래프만 표시됩니다. dPCR 플롯은 PCR 당 7-9백만 방울의 성공적인 액적 생성을 보여줍니다 (대부분은 표적 DNA를 포함하지 않는 부정적인 액적입니다). PCR당 최소 7백만 방울은 성공적인 액적화를 나타내며, 700만 개 미만은 분석의 실패를 나타내며, 이 경우 사용자는 데이터 분석을 진행해서는 안 됩니다. 도 1은 각각 x축과 y축을 따라 돌연변이체와 야생형 군집 간의 명확한 분리를 나타낸다. 강력한 야생형 클러스터는 템플릿 DNA가 존재하기 때문에 cfDNA 추출이 성공했음을 나타냅니다. 돌연변이 클러스터는 혈장 및 CSF 샘플에 대해 각각 1.60% 및 39.92%의 MAF를 나타내며, 돌연변이의 양성 검출을 입증하였다. 이들 환자에 대해, dPCR 결과는 생검 종양 조직의 게놈 분석에 의해 확인된바와 같이 종양 돌연변이 상태에 따라 8. 음의 대조군(왼쪽 아래 패널)은 0개의 돌연변이체 및 0개의 야생형 방울을 나타내며, 이는 PCR 반응 혼합물의 오염이 없음을 나타낸다. 양성 대조군 종양 조직 gDNA(오른쪽 아래 패널)는 선택된 특정 종양 샘플에 대한 예상 된 대조군 주파수에서 검출되는 돌연변이를 나타낸다.
도2에서 대표적인 결과는 DMG를 가진 아이로부터의 혈장 cfDNA에서 관심 있는 돌연변이의 실패검출, H3F3A p.K27M에 대한 것으로 나타났다. 종양 조직의 게놈 분석에 의해 돌연변이상태를 확인하였다 8. 두 개의 복제 PCR 웰의 대표적인 결과가 도시됩니다(상단 패널). 음수 방울을 포함한 총 액적 수는 PCR 당 7-9백만 개사이이며 성공적인 액적화를 나타냅니다. y축을 따라 플롯된 야생형 클러스터는 혈장 cfDNA에 대해 PCR당 약 7-8,000개의 야생형 방울을 보여주며, 성공적인 cfDNA 추출을 나타냅니다(샘플에 표적 야생형 DNA가 있기 때문에). 그러나, 0 돌연변이 방울은 혈장 샘플에서 검출된다. 왼쪽 하단 패널은 야생형 또는돌연변이 액적없이 음의 대조군(MB H2 O)을 나타낸다. 및 오른쪽 하단 패널은 양성 돌연변이 검출을 가진 양성 대조군 전습화된 종양 조직 gDNA(0.025 ng)를 나타낸다. 이 도면에 도시된 바와 같이, 혈장내 돌연변이 검출의 부재는 반드시 환자가 관심의 돌연변이를 위한 야생형임을 의미하지않을 수 있으며, 거짓 부정이발생하는바와 같이 8. 일부 경우에, 선행 생검에서 수집된 혈장에서 돌연변이가 누락되면, 이후 시점8에서동일한 환자로부터 수득된 혈장에서 검출된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2.jpg"> 그림 1 : 성공적인 검출 H3F3A p.K27M 돌연변이는 미드라인 글리오마를 가진 아이들에게서 미리 증폭된 혈장 및 CSF cfDNA에서. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig2.jpg"> 그림 2 : 관심 있는 돌연변이를 품은 것으로 알려진 환자로부터 미리 증폭된 혈장 cfDNA 샘플의 분석에서 얻은 거짓 음성 결과, H3F3A p.K27M, 종양. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

이 프로토콜은 종양 관련 돌연변이의 검출을 가능하게 하고 현재 침략적인 외과 적 절차를 칭찬합니다. 또 다른 강도는 종양 돌연변이 부하 초과를 모니터링하기 위해이 프로토콜을 사용하는 기능입니다. 이 기술은 제한된 조직 접근을 가진 두뇌 줄기 같이 도전적인 위치에 있는 종양에 특히 도움이되는 실제 외과 조직 생검을 요구하지 않고 종양 지평을 가능하게 합니다.반복 생검의 부재에서, 세로 분자 데이터는 MRI를 칭찬하기 위하여 유효하지 않습니다. 디지털 PCR 모니터링은 진단에 대한 분자 기반 보충제를 용이하게 하여 보다 정보에 입각한 치료 의사 결정 과정을 가능하게 합니다. 유사한 방법은 종래의 플루오-4 및 담관-연결된 프로브를 사용하여 특정 시스템에서 유전자의 발현을 검출하는 데 사용될 수 있지만 정량적 PCR보다 더 높은 감도를 갖는다.물방울 디지털 PCR 절차를 시작하기 전에 벤치 공간과 장비를 10 % 표백제와 70 %에탄올로 청소하고 부드럽게 소용돌이및 액적 안정화 오일을 제외한 모든 시약을 간략하게 원심합니다. 압축 질소 가스 실린더가 액적 생성 기기에 부착되어 있고 실린더 탱크가 평방 인치당 90 파운드로 설정되어 있는지 확인합니다. 그리고 디지털 PCR 반응 혼합물의 38 마이크로리터는 깨끗한 파이펫 팁으로 거품을 제거하여 8 개의 잘 PCR 튜브 스트립의 각 우물의 바닥에 직접 들어갑니다.튜브 스트립의 적절한 우물에 삼중 항에 미리 증폭 된 DNA 샘플 12 마이크로 리터를 추가합니다. 전체 부피를 10회 부드럽게 피펫하여 반응 혼합물을 DNA 샘플과 파이펫을 혼합하여 각 웰의 전체 부피를 해당 A채널로 혼합하여 물방울 생성 기기 칩의 H 채널을 통해서. 새로운 PCR 튜브 스트립을 물방울 생성 기기에 삽입하고 계측기 컴퓨터의 소프트웨어에 계측기 칩 ID를 생성하는 물방울을 스캔합니다.그런 다음 실행 시작을 클릭하여 샘플 을 삭제하기 시작합니다. 액적 제거가 완료되면 PCR 튜브 스트립을 제거하고 튜브 스트립 캡을 적용합니다. 튜브 스트립을 열 사이클러로 옮기고 튜브와 우물당 80 마이크로리터가 들어있는 다른 튜브 스트립의 균형을 유지합니다.그런 다음 적절한 열 순환 조건에서 열 순환을 실행합니다. 스트립 캡을 고속 캡으로 교체합니다. 열 순환이 완료되면 튜브 스트립을 정량화 기기로 옮기고 계측기 소프트웨어에서 실행 설정을 클릭하고 튜브 스트립을 정량화 기기에 배치합니다.새로운 정량화 계기 칩 위에 금속 방패를 놓고 칩 ID를 기기에 스캔하고 칩을 기계에 삽입합니다. 악기의 뚜껑을 닫습니다. 컴퓨터 소프트웨어에서 디지털 PCR 실행 및 8개 채널 각각의 이름을 입력한 다음 빠른 모드를 선택하고 시작을 클릭하여 정량화를 시작합니다.원시 스펙트럼 데이터를 분석하려면 분석가 소프트웨어를 실행하고 FCs 파일을 엽니다. 분석 보기에서 그대로 선택합니다. 샘플 보기에서 8개의 샘플 각각 옆에 있는 상자를 클릭합니다.이 소프트웨어는 각각 x및 y 축을 따라 돌연변이 및 야생 유형 본선에 대한 신호를 플롯합니다. 계산된 매트릭스 함수를 사용하여 제조업체 강사에 따라 그대로 물방울에 스펙트럼 보정을 적용하고 축 옵션에서 축 설정을 조정합니다. x 축을 최소 0으로 설정하고 최대 30, 000 및 y 축을 최소 5, 000 및 최대 10, 000으로 설정합니다.액적 클러스터가 식별되면 축을 조정하여 그래프의 빈 공간을 줄입니다. 양성 조절 종양 조직 유전체 DNA에 대응하는 샘플을 선택하여 음극 돌연변이 및 야생 형 게이트를 설정하여 클러스터가 구별되고 쉽게 식별되도록 합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 을 클릭하고 선택한 샘플에 대한 모든 설정 적용을 선택하여 모든 샘플에 긍정적 인 컨트롤의 게이트 설정을 적용합니다.그래픽 뷰에서 여러 샘플을 클릭하여 선택한 모든 샘플에 대한 플롯을 보고 이미지를 tif 파일로 내보냅니다. 그런 다음 작업 영역 에서 내보내기 분석을 선택하고 분석된 데이터 파일을 csv 파일로 저장합니다. 여기서, 확산성 중음질증을 가진 두 어린이로부터 미리 증폭된 혈장 및 뇌척수액 세포 에서 돌연변이의 성공적인 검출을 위한 대표적인 결과가 나타난다.본 실험에서는, 돌연변이체와 야생형 클러스터 사이의 명확한 분리는 각각 x 및 y 축을 따라 관찰될 수 있다. 견고한 야생 형 클러스터는 템플릿 DNA가 존재하기 때문에 세포 없는 DNA 추출이 성공했다는 것을 나타냅니다. 이들 환자의 경우, 돌연변이 클러스터는 생검 종양 조직의 유전체 분석에 의해 확인된 바와 같이 종양 돌연변이 상태에 따라 각각 혈장 및 뇌척수액 샘플에 대해 1.6 및 39.32%의 돌연변이 알꼴 주파수를 나타낸다.반면에 음의 조절은 PCR 반응 혼합물의 오염이 없음을 나타내는 0 돌연변이 및 제로 야생 형 물방울을 나타낸다. 양성 조절 종양 조직 유전체 DNA는 선택된 특정 종양 샘플에 대한 예상 된 알꼴 주파수에서 검출되는 돌연변이를 나타낸다. 플라즈마 내의 돌연변이 검출이 없다는 것은 환자가 거짓 네거티브가 발생하기 때문에 관심의 돌연변이를 위한 야생 타입이라는 것을 의미할 필요는 없습니다.예를 들어, 이 환자에서는 관심있는 돌연변이가 발견되지 않았지만, 종양 조직의 게놈 분석에 의해 돌연변이 상태를 확인하였다. PCR은 거짓 긍정 데이터의 수집을 피하기 위해 작업 영역및 장비의 빈번한 오염 제거를 요구하는 매우 민감한 기술입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

프로토콜은 폴리 (N -iso - 프로필 아크릴) 효과적인 캡처 및 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 thermoresponsive 릴리스 (PIPAAm) 코팅 된 마이크로 제시를 활용합니다. 이 방법은 분석 및 특성, 하류 오프 - 칩 문화에 대한 환자의 혈액과 가능한 CTC의 후속 릴리스에서 CTC를 캡처 할 수 있습니다.

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

우리는 종양 세포의 특성에 대 한 새로운 접근을 제시. 우리 DNA 형광-제자리에서면역 형광 결합-셀 기능성된 의료 와이어에 vivo에 직접 환자의 혈액에서에서 CTCs를 풍부 하 게의 수에 의해 점령을 평가 하는 교 잡.

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

순환 혈액에서 ribonucleic 산 (cRNA)의 임상 진단에 unmet 필요 이다. 여기 우리가 과민 하 고 특정 디지털 연쇄 반응을 사용 하 여 비 작은 세포 폐 암 환자에서 cRNA를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 테스트 72 시간 이내 퓨전 변종 감지 하 디자인 요구 사항을 충족.

혈액 기반 ROS1의 검출을 위한 테스트 및 RET Ribonucleic 산 디지털 연쇄 반응을 사용 하 여 순환에서 퓨전 성적표

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

이 논문에서 우리는 혈액 수집, 혈장 및 버피 코트 분리, cfDNA 및 생식선 DNA 추출, cfDNA 또는 생식선 DNA의 정량화 및 cfDNA 단편 농축 분석을 포함한 비 침습적 액체 생검 기술에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

액체 생검은 종양학 번역 연구에 대한 우리의 접근 방식에 혁명을 일으켰으며, 샘플 수집, 품질 및 보관은 성공적인 임상 적용을위한 중요한 단계입니다. 여기에서는 대부분의 번역 연구 실험실에 적용 할 수있는 다운스트림 순환 프리 DNA 응용 프로그램에 대한 표준화되고 검증 된 프로토콜을 설명합니다.

다운스트림 순환 프리 DNA 응용을 위한 표준화된 액체 생검 사전 분석 프로토콜

이 백서에서는 전혈에서 무세포 DNA 및 순환 종양 세포와 같은 물질을 쉽고 효율적으로 분리하고 수집하기 위한 자동화 장비의 적용에 대해 설명합니다.

임상 샘플에서 암 관련 물질의 자동 분리 및 수집

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

학습하세요 환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA를 검출하고 모니터링하는 디지털 PCR 방법을. 최소 침습으로 종양 돌연변이를 정량 분석하여 치료 결정에 활용할 수 있습니다.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

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