Name: 약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 학습하세요 실시간 생활 세포에서 GPCR-β-arrestin 상호작용을 모니터링하는 구조적 보완 분석법을 통해 약물 발견을 가속화하는 방법을. 이 기술은 수용체 약리학 연구에 활용됩니다.

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이 사업은 과학기술정보통신부가 후원하는 국립연구재단(NRF)의 연구프로그램(NRF-2015M3A9E7029172)의 보조금으로 지원되었다.

1. 프라이머 디자인 전략
<ol><li>pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 벡터에 관심 있는 유전자를 소개하는 프라이머를 디자인합니다.</li>
	<li>도 111에도시된 바와 같이 멀티클로닝 부위를 분할하는 인프레임 스톱 코돈의 존재로 인해 방향 성 클로닝에 필요한 두 가지 독특한 제한 효소 중 하나로서 이들 3개 부위 중 적어도 하나를 선택한다.</li>
	<li>표 1에 나타낸 바와 같이 프라이머내로 뉴클레오티드 서열을 통합하여 표 211에적색으로 표시된 링커 잔기를 인코딩한다.</li>
	<li>pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-C [TK/SmBiT] 벡터의 경우, 5' 프라이머에 ATG 코돈과 강력한 코자크 합의 서열(GCCGCCACC)이 포함되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 벡터의 경우 3' 프라이머에 스톱 코돈이 포함되어 있는지 확인합니다. 참고: 각 벡터는 비특이적 연관성을 최소화하고 실험 적 아티팩트를 감소시키기 위해 HSV-TK 프로모터를 포함하며, 또한 각 벡터는 박테리아에서 암피실린 저항성을 위한 발현 카세트를 갖는다.</li>
</ol>2. PCR
<ol><li>1단계에서 설계된 프라이머를 사용하여 관심 유전자의 삽입 DNA를 증폭시키기 위해 PCR 반응을 설정하고 실행한다. 고충실도 DNA 폴리머라제는 돌연변이를 최소화하는 것이 중요하다.</li>
	<li>정확히 다음 순서를 사용하여 50 μL의 PCR 반응을 준비하십시오. 증류수 35.5μL, 10x 폴리머라제 완충액 5μL, dNTP 혼합물 5μL(각각 2.5mM), 플라스미드 템플릿 1μL(200 ng/μL), 1.25μL의 전진 및 역방향 프라이머(10 μM) 및 고충실도 폴리머(5 U/L)를 추가합니다.</li>
	<li>열사이클러를 사용하여 다음과 같은 DNA 증폭 프로그램을 설정한다.<ol>
<li>95 °C에서 5 분 동안 변성.</li>
		<li>다음 열 주기를 25회 반복합니다: 30s에 대해 95°C, 1분 동안 60°C, 1kbp당 2분 동안 72°C를 증폭한다.</li>
		<li>최종 연장을 72°C에서 10분 동안 실행합니다.</li>
		<li>열순환기 내에서 샘플을 4°C에서 유지합니다. 참고: 긴 서열의 증폭 중에 발생하는 점 돌연변이를 최소화하기 위해 고충실도 폴리머라제(polymerase)를 사용하는 것이 좋습니다. 앰플리온이 길어지면 DNA 복제의 정확도 정도가 감소합니다. PCR 반응을 위해, 올리고스가 프라이머의 모든 서열이 아닌 DNA 템플릿과 직접 혼성화되는 영역의 용융 온도에 따라 어닐링 온도를 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR 제품 정제<ol>
<li>기본 설정12의제조 업체에서 키트를 사용 하 여 PCR 반응의 나머지 부분에서 PCR 제품을 분리. 이제 PCR 제품이 제한 소화를 할 준비가 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNA 소화
<ol><li>PCR 생성물 소화를 위해 소화 반응의 50 μL을 다음과 같이 준비한다.<ol>
<li>1.5 mL 튜브를 사용하여 증류수 12 μL을 추가합니다.</li>
		<li>두 제한 효소와 최상의 호환성으로 10x 버퍼의 5 μL을 추가하십시오.</li>
		<li>2.4 단계에서 PCR 제품의 30 μL추가</li>
		<li>마지막으로, 각 제한 효소의 1.5 μL을 추가합니다.</li>
		<li>소용돌이에 의해 간략하게 혼합하고 밤새 37.5 °C에서 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수용자 플라스미드 소화를 위해 다음과 같이 소화 반응의 50 μL을 준비합니다:<ol>
<li>1.5 mL 튜브를 사용하여 23 μL의 증류수를 추가합니다.</li>
		<li>두 제한 효소와 최상의 호환성으로 10x 버퍼의 5 μL을 추가하십시오.</li>
		<li>15 μL의 수신자 플라스미드(200 ng/μL)를 추가합니다.</li>
		<li>각 제한 효소의 1.5 μL을 추가합니다.</li>
		<li>소용돌이에 의해 간략하게 혼합하고 밤새 37.5 °C에서 배양합니다. 참고: DNA 아가로오스 겔 정제 후 충분한 물질을 얻기 위해서는 3 μg의 수용자 플라스미드를 사용하는 것이 중요하다. 그것은 또한 높은 복제 효율을 얻기 위해 두 효소를 사용 하 여 하룻밤 DNA 소화를 두고 관련.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DNA 아가로오스 젤 정제 및 복제
<ol><li>1% 아가로즈 겔을 준비하여 소화된 DNA 플라스미드 및 삽입을 실행하고 해당 밴드를 절단진행한다. 해당 벡터 및 삽입 밴드가 정제되면12, 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 결정한다.</li>
	<li>DNA 결찰을 수행하여 인서트를 수용자 플라스미드에 융합시다.</li>
	<li>플라스미드 벡터의 50 ng를 포함하여 총 DNA의 약 100 ng의 결찰 반응을 준비한다.</li>
	<li>약 1:3의 수신자 플라스미드 인서팅 비율을 설정; 벡터 삽입계산기(13)를사용하여 계산할 수 있습니다.</li>
	<li>네거티브 컨트롤을 병렬로 설정합니다. 예를 들어, 어떤 삽입없이 수용자 플라스미드 DNA의 결찰은 소화되지 않거나 자가 결찰 받는 사람 플라스미드가 존재하는 얼마나 많은 배경에 대한 정보를 제공할 것이다.</li>
</ol>5. 클론의 변환
<ol><li>냉동고에서 유능한 DH5α 세포의 튜브를 -80°C에 놓고 즉시 얼음에 20분 간 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다.</li>
	<li>그 시간 후, DH5α 유능한 세포의 55 μL을 취하고 4 μL의 결찰 반응을 추가하고 튜브를 가볍게 두어 혼합하고 얼음에 45 분 동안 저장합니다.</li>
	<li>이전에 42 °C에서 48초 동안 데운 수조에 튜브를 놓고 즉시 튜브를 얼음에 다시 3 분 동안 다시 가져옵니다.</li>
	<li>이전에 37.5 °C에서 데운 루리아 국물 (LB) 배지 600 μL을 넣고 200 rpm에서 1 시간 동안 흔들어 서 배양하십시오.</li>
	<li>200 μL을 암피실린 100 μg/mL이 함유된 한천 판에 옮기고 액체가 대부분 흡수되어 표면에 부드럽게 퍼질 수 있습니다.</li>
	<li>다음날 아침 식민지를 보기 위해 밤새 접시를 배양합니다. 인서트 플레이트상에 있는 수용자 플라스미드는 수용자 플라스미드 단독 플레이트보다 훨씬 더 많은 콜로니를 가져야 한다.</li>
</ol>6. 완성 된 플라스미드의 절연
<ol><li>3-10개의 개별 세균 성 콜로니를 선택하고 암피실린(100 μg/mL)을 함유한 1 mL의 LB 배지로 옮기고 6시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>200 μL의 세균 현탁액을 취하고 6.1 단계에서와 동일한 암피실린 농도를 함유하는 LB 배지의 5 mL로 이송하고 200 rpm에서 흔들어 37.5°C에서 밤새 배양한다.</li>
	<li>miniprep DNA 키트 정제를 사용하여, 제조자 지침14에따라 하룻밤 재배 LB의 5 mL을 사용하여 미니프렙 DNA 정제를 수행한다.</li>
	<li>성공적인 결찰을 확인하기 위해, 제2 단계에서 얻은 DNA를 제1 PCR 동안의 제2항에서와 동일한 프라이머를 가진 템플릿으로 사용하여 섹션 2에서와 같은 방식으로 PCR 반응을 설정한다. 포지티브 클론은 해당 크기의 PCR 제품을 생산합니다.</li>
	<li>양성 클론의 큰 준비 DNA 정제 후, 복제 단계 동안 사용되는 효소와 함께 정제 된 DNA 의 500 ng의 진단 제한 소화를 실시하고 1 % 아가로즈 젤에 소화 된 제품을 실행합니다. 두 개의 밴드가 있어야합니다 : 하나의 벡터 크기와 새 삽입의 크기.</li>
	<li>다음 프라이머를 사용하여 시퀀싱하여 시퀀싱을 확인합니다: 포워드 5'- aaggtgacgtttttttttttaac-3'와 역5'-gcatttttcctttagtt-3'. 참고: DNA가 PCR을 사용하여 복제될 때, 고충실도 폴리머라제를 사용하는 경우에도 증폭 중에 항상 오류가 발생할 가능성이 있으므로 최종 구문서열을 정하는 것이 매우 중요합니다.</li>
</ol>7. 형질 감염 및 단백질 발현
<ol><li>이전에 폴리-L-리신 코팅 화이트 96 웰 플레이트에서, 덜베코의 수정 된 독수리의 배지를 사용하여 잘 당 2.5 x 104 세포에서 형질전환 하기 전에 하루 세포 파종을 수행 10% 태아 소 소 세럼의 보충, 100 U/mL 페니실린 G, 그리고 100 μg/ mL 연쇄상 구균.</li>
	<li>60개의 내부 웰만 사용하여 증발로 인한 플레이트 및 엣지 효과전반에 걸친 열 그라데이션의 가능성을 최소화합니다. 36개의 외부 우물에 200 μL의 멸균 증류수를 추가하고 37.5°C및 CO2의 5%에서 하룻밤 동안 배양하는우물과 배양 사이의 공간에 150 μL을 추가합니다.</li>
	<li>다음날 아침 총 DNA 100 ng(각 구조50 ng)를 사용하여 형질혈을 수행한다.</li>
	<li>도 2b에따라 4개의 상이한 플라스미드 조합(receptor:β-arrestin)을 설정한다.</li>
	<li>각 플라스미드 조합에 대해 20 μL의 수정된 이글의 최소 필수 매체를 HEPES로 완충하여 웰당 0.3 μL의 지질 형질 전환 시약을 사용한다.</li>
	<li>20 μL의 지질 형질 전환 시약-DNA 혼합물을 각 우물에 넣고 10s동안 원형으로 접시를 섞습니다.</li>
	<li>37.5 °C 및 5 % CO2에서 6시간 배양 후 신선한 배지를 변경합니다.</li>
	<li>37.5 °C 및 5 % CO2에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.</li>
</ol>8. HEK293 세포에서 수용체-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링
<ol><li>배지를 흡인하고 HEPES로 버퍼링된 수정된 독수리의 최소 필수 미디어 100 μL을 각각 잘 추가하고 플레이트가 RT에서 10분 동안 안정화하도록 합니다.</li>
	<li>1부부피의 100x 기판을 LCS 희석 완충제(20배 희석)(20배 희석)(11)와 결합하여후리마진 기판을 준비하고, 세포 배양 배지와 혼합하여 5배 스톡을 생성한다.</li>
	<li>각 우물에 25 μL의 5x 후리마진을 넣고 10s를 위해 원을 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>RT에서 신호 안정화를 위해 발광을 10분 동안 측정합니다. 참고 : 각 웰의 반응을 정상화하기 위해이 기준선 신호를 사용하여 잘 당 도금 된 셀 수의 차이, 형질 감염 효율의 차이 등으로 인한 변동성을 줄이는 데 도움이됩니다. 일단 계산되면, 주어진 약물 치료를 위해 복제 웰로부터의 정규화된 반응을 평균화한다.</li>
	<li>HEPES로 버퍼링된 수정된 이글의 최소 필수 미디어에 13.5x 리간드 솔루션을 준비합니다.</li>
	<li>10 μL의 13.5x 리간드 첨가로 실온에서 실험하는 경우, 인젝터 또는 멀티 채널 파이펫을 사용하여 화합물을 추가하고 손으로 또는 궤도 셰이커 (200 rpm에서 20s)를 사용하여 플레이트를 혼합하십시오.</li>
	<li>37.5°C에서 13.5x 리간드를 첨가한 10 μL의 실험의 경우 인젝터를 사용하여 화합물을 분배하고 계측기 궤도 셰이커를 사용하여 혼합합니다. 인젝터를 사용하지 않는 경우, 발광계에서 플레이트를 제거하고, 리간드를 추가하고 손으로 또는 궤도 셰이커 (200rpm에서 20s)를 사용하여 플레이트를 혼합하십시오. 참고: 검출 기기 내에서 인젝터와 셰이커를 사용하여 발광계에서 플레이트를 제거하는 것과 관련된 온도 변동을 최소화하십시오. 표준 벤치탑 발광계는 이 분석에 사용할 수 있습니다. 0.25-2s의 통합 시간을 사용합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 방법을 사용하여, 임의의 GPCR 및 β-arrestin1/2 사이의 상호작용은 이 GPCR-β-arrestin 구조적 보완 분석법을 사용하여 실시간 생활 시스템에서 모니터링될 수 있다. 이와 관련하여, 우리는 GLP-1r (프로토 타입 클래스 B GPCR)에 의해 두 개의 β-arrestin 이소폼 사이의 차동 β-arrestin 모집을 관찰 할 수 있었고, 우리는 또한 수용체 β-arrestin 복합체의 해리를 최대에 도달한 후 몇 분 후에 관찰했습니다. 발광 신호.
구조적 보완 분석 시스템에서 최고의 감도를 갖기 위해, 수용체와 각 β-arrestin 이소폼 사이의 4가지 공간 배향으로 스크리닝하였고, 가장 높은 발광 신호를 가진 것을 후방에 사용했습니다. 투여량 반응 자극 곡선과 같은연구 (그림 4). 이러한 방법론을 이용하여 당뇨병15와같은 내분비학적 질환에서 ...

GPCR은 현재 시중에서 약품의 약35%를 대상으로 하고 있으며, 이들의 약리학에 대한 명확한 이해는 새로운 치료제 의 개발에 매우 중요하다 3. GPCR 약 발견에 있는 중요한 양상의 한개는, 특히 편향된 작용제의 발달 도중 수용체 β-arrestin 상호 작용4 및 β-arrestin 상호 작용과 같은 그밖 cytosolic 단백질을 향한 새로운 리간드의 특성입니다 클래트린5.
β-arrestin 의존성 신호는 양극성 장애, 주요 우울증 및 정신 분열증 6과 같은 신경 장애에 중요한 역할을 하며 모르핀7과 같은 일부 약물에서도 심각한 부작용을 가지고 있다는 것이 문서화되었다.
이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 사용되는 현재의 방법은 일반적으로 연구에서 단백질의 실제 내인성 수준을 나타내지 않으며, 어떤 경우에는 약한 신호, 광표백및 GPCR에 따라 8을 설정하는 것이 기술적으로 어려울 수 있습니다. 이러한 새로운 구조적 보완 분석법은 내인성 생리학적 수준을 모방하기 위해 낮은 발현 프로모터벡터를 사용하고 현재 방법 9에 비해 높은 감도를 제공한다. 이러한 접근법을 사용하여, 갈라닌 수용체-β-arrestin1/2 및 또한 β-arrestin2-클라트린 상호작용10을쉽게 특성화할 수 있었다. 이 방법론은 β-arrestins가 중요한 생리기능을 재생하거나 그들의 신호가 몇몇 질병에서 관련있는 특정 관심사의 어떤 GPCR든지에 널리 이용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>항생제 페니실린 스트렙토마이신</td><td>Welgene</td><td>LS202-02</td><td>페니실린/스트렙토마이신</td></tr><tr><td>세균 인큐베이터</td><td>JEIO Tech</td><td>IB-05G</td><td>인큐베이터(에어 재킷), 염기성</td></tr><tr><td>세포 배양 배지</td><td>Welgene</td><td>LM 001-05</td><td>DMEM 세포 배</td></tr><tr><td>양 배지</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Optimem 1X 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>NUAIRE</td><td>NU5720</td><td>직접 가열 CO2 인큐베이터</td></tr><tr><td>디지털 수조</td><td>실험실 기술</td><td>LWB-122D</td><td>디지털 수조 실험실 기술</td></tr><tr><td>DNA 중합 효소 증명 판독</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1011</td><td>PfU DNA 중합 효소</td></tr><tr><td>DNA 정제 키트</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>miniprepLaboPass 정제 키트 플라스미드 미니</td></tr><tr><td>DNA Taq 중합 효소</td><td>효소학</td>: <td>P750</td><td>nTaq DNA polymerase</td></tr><tr><td>Enzyme restriction BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>BglII</td></tr><tr><td>Enzyme restriction buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B72045</td><td>CutSmart 10X Buffer</td></tr><tr><td>Enzyme restriction EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>EcoRI-HF</td></tr><tr><td>Enzyme restriction NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R01315</td><td>NheI</td></tr><tr><td>효소 제한 XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>XhoI</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco Canada</td><td>12483020</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>Gel/PCR DNA MiniKit</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>KH23108</td><td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td></tr><tr><td>Ligase</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1025</td><td>T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>광 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX53SF</td><td>CKX53 현미경 올림푸스</td></tr><tr><td>지질 형질주입 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>리포펙타민 2000</td></tr><tr><td>광도계</td><td>Biotek/Fisher Scientific</td><td>12504386</td><td>Synergy 2 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td></tr><tr><td>NanoBiT 시스템</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>NanoBiT PPI MCS 스타터 시스템</td></tr><tr><td>나노루시페라제 기판</td><td>Promega</td><td>N2012</td><td>Nano-Glo Live Cell assay system</td></tr><tr><td>PCR Thermal cycler</td>, <td>Eppendorf</td><td>6336000015</td><td>Master cycler, Nexus SX1</td></tr>, <tr><td>Poly-L-lysine</td>, <td>Sigma, Aldrich</td><td>P4707-50ML</td>, <td>Poly-L-lysine solution</td></tr><tr><td>, Trypsin EDTA,</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td>, <td>Trysin EDTA, 10X</td></tr><tr><td>White Cell culture, 96웰 플레이트</td>, <td>Corning</td><td>3917</td>, <td>Assay Plate, 96웰 플레이트</td></tr></tbody></table>

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 gpcr-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

G 단백질 결합 된 수용 체 사이 상호 작용 (GPCRs) 그리고 β-arrestins는 매우 중요 한 생리적 의미와 중요 한 과정. 현재, β-arrestins 및 그밖 cytosolic 단백질과의 상호 작용을 향해 새로운 약의 특성은 GPCR 편향된 agonism의 연구 도중 특히 GPCR 약 발견의 필드에서 극단적으로 귀중합니다. 여기서, 우리는 실시간 살아있는 시스템에서 수용체-β-레체아핀 상호작용을 정확하게 모니터링하기 위한 새로운 구조적 보완 분석법의 적용을 보여준다. 이 방법은 간단하고 정확하며 관심 있는 임의의 GPCR까지 용이하게 확장될 수 있으며 또한 각 벡터 시스템에 존재하는 낮은 발현 프로모터의 존재로 인해 비특이적 상호작용을 극복할 수 있다는 장점이 있다. 이 구조적 보완 분석법은 수용체-β-arrestin 상호 작용의 정확하고 정확한 모니터링을 허용하는 주요 기능을 제공하여 GPCR 시스템의 편향된 작용뿐만 아니라 GPCR c-종단 '인산화의 연구에 적합합니다. 다른 GPCR 키나아제 (GRKs)와 수용체 β-arrestin 복합체를 안정화하거나 불안정하게 하는 체포의 번역 후 수정에 의해 작성된 코드.

여기에 제시된 절차를 사용하여, 프로토타입 GPCR과 2개의 β-arrestin 이소폼 사이의 상호작용을 모니터링했다. 글루카곤 유사 펩티드 수용체(GLP-1r) 컨스트럭트는 NheI 및 EcoRI 효소 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 만들어졌으며, β-레아핀의 경우 2개의 벡터를 추가로 pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-C [TK/SmBiT]로 복제하였다. β-arrestin2 및 NheI 및 XhoI의 경우 β-arrestin1의 경우 효소 제한 부위 BgIII 및 EcoRI를 사용하여 pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-N [TK/SmBiT]를 사용하였다. HEK293 세포는 N-1r-LgBiT/SmBiT 의 50 ng및 N-C-말단에서 LgBiT 또는 SmBiT로 태그된 β-레퍼틴 50 ng를 사용하여 형질감염되었다. 4개의 상이한 플라스미드조합을 스크리미큐어(도 3)하고 가장 높은 발광 신호를 가진 플라스미드 조합을 ...

GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

이 프로토콜은 약물 발견 및 개발 분야에서 특히 최소한의 부작용을 가진 새로운 일류 약물의 개발에 큰 영향을 미칩니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 GPCR 시스템에 적용될 수 있고, 실시간 생활 시스템에서 수용체 약리학에 대한 정확한 정보를 얻는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 베타 체포가 관련이 있는 새로운 치료와 밀접한 관련이 있습니다.이들은 정신 분열증에 있는 고통 및 도파민 수용체에 있는 opiod 수용체를 포함합니다. 이 방법은 신경학에서 심장 폐 질환에 이르기까지 많은 의학 과학 연구 분야에서 유용 할 수 있습니다. 기존의 출판에서는 불가능할 프로토콜의 중요한 단계를 상세히 제시할 수 있기 때문에 우리의 방법의 PCR 데모가 중요합니다.pBiT 벡터에 관심 있는 유전자를 소개하는 프라이머를 디자인하여 시작합니다. 다중 복제 부위를 나누는 인프레임 스톱 코돈으로 인해 방향 복제에 필요한 두 가지 고유 제한 효소 중 하나로 3개 부위 중 적어도 하나를 선택합니다. 뉴클레오티드 서열에 대한 원고를 참조하여 링커 잔류물을 인코딩하고 프라이머에 통합하십시오.pBiT1.1-C 및 pBiT2.1-C의 경우 앞으로 프라이머에 ATG 코돈과 강력한 코작 컨센서스 시퀀스가 포함되어 있는지 확인합니다. pBiT1.1-N 및 pBiT2.1-N의 경우 역프라이머에 스톱 코돈이 포함되어 있는지 확인합니다. 관심 있는 유전자의 삽입 DNA를 증폭하기 위하여 디자인된 프라이머를 이용하십시오.원고 방향에 따라 PCR 시약을 결합하여 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 돌연변이를 최소화하십시오. 열순환을 프로그래밍하고 반응을 시작합니다. PCR을 완료한 후 50 마이크로리터 소화 반응으로 제품을 소화합니다.1.5 밀리리터 튜브에서 증류수 12마이크로리터, 적절한 10X 제한 소화 버퍼5개, PCR 제품의 마이크로리터 30개 등을 결합합니다. 그런 다음 각 제한 효소의 1.5 마이크로리터를 추가합니다. 반응 혼합물을 소용돌이.그리고 하룻밤 사이에 37.5도에서 배양하십시오. 받는 사람을 소화하기 위해 두 번째 반응을 준비합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서, 물 23 마이크로리터, 적절한 10X 제한 소화 버퍼의 5 마이크로리터, 수신자 플라스미드의 15 마이크로리터, 각 제한 효소의 1.5 마이크로리터를 결합합니다.튜브를 짧게 섞습니다. 그리고 하룻밤 사이에 37.5도에서 배양하십시오. 복제 및 변형 다음 날에, 3 ~10 개별 세균 성 식민지를 선택하고 암피실린과 LB 매체의 1 밀리리터로 전송.6 시간 동안 세포를 배양. 그리고 암피실린을 가진 신선한 LB 매체의 5밀리리터로 세균 현탁액의 200 마이크로리터를 전송합니다. 하룻밤 사이에 200 rpm에서 흔들리면서 37.5도에서 문화를 배양하십시오.다음 날, 플라스미드를 미니 준비 DNA 정화 키트로 분리합니다. PCR로 성공적인 결찰을 위해 정제 된 플라스미드를 선별하십시오. 트랜스펙트 하루 전에, Dulbecco의 수정 된 독수리의 매체를 사용하여 폴리 L-리신 코팅 96 웰 플레이트에 세포를 씨앗 10% 태아 소 혈청, 100 페니실린 G의 밀리리터 당 단위, 그리고 100 streptomycin의 밀리리터 당 마이크로 리터.60개의 내부 우물에만 셀을 추가하여 플레이트 전체의 열 그라데이션 및 증발로 인한 에지 효과의 가능성을 최소화합니다. 멸균 증류수 200마이크로리터를 36개의 외부 우물에 추가하고 150마이크로리터를 우물 사이의 공간에 넣습니다. 그런 다음 하룻밤 사이에 접시를 섭씨 37.5도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.다음 날, 총 100 나노그램 DNA를 사용하여 형질 전환을 수행합니다. 원고 방향에 따라 네 가지 플라스미드 조합을 설정합니다. HEPES로 버퍼링된 수정된 Eagle의 최소 필수 매체 20마이크로리터와 잘 어울리한 1회당 0.3 마이크로리터를 사용한다.각 웰에 20 마이크로리터의 립지딕 트랜스펙션 시약및 DNA 혼합물을 넣고 10초 동안 원을 그리며 접시를 섞습니다. 플레이트를 섭씨 37.5도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 배양합니다. 매체를 새로 고칩니다.그리고 또 다른 24 시간 동안 배양. 인큐베이션 후, 매체를 흡인하고 각 우물에 HEPES로 버퍼링 수정 된 독수리의 최소 필수 미디어의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트가 실온에서 10분 동안 안정화되도록 합니다.한편, 100X 기판의 1부피를 LCS 희석 버퍼 19권과 결합하여, 세포 배양 배지와 혼합하는 5배 스톡을 생성하여 퓨리마진 기판을 준비한다. 세포가 준비되면 각 우물에 25 마이크로리터를 추가하고 10 초 동안 접시를 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 신호 안정화를 위해 실온에서 10 분 동안 발광을 측정합니다.리간드 추가 실험을 위해 HEPES로 버퍼링된 수정된 Eagle의 최소 필수 미디어에 13.5X 리간드 솔루션을 준비하고 멀티채널 파이펫을 사용하여 웰당 10마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 손으로 또는 궤도 셰이커와 접시를 혼합합니다. 이 프로토콜은 프로토타입 GPCR과 두 개의 베타 체포 동소형태 간의 상호 작용을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다.4개의 다른 플라스미드 조합을 선별하고, 발광 신호가 가장 높은 것을 가진 조합은 추가 실험을 위해 선택되었다. 각 베타-아테인 이소폼에 대한 EC50 값은 운동 연구에서 각 농도의 최대 반응으로부터 얻은 용량 반응 곡선을 사용하여 결정되었다. PCR 프라이머를 디자인할 때 특별한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.올바른 구조의 개발은 이러한 에세이의 성공에 필수적입니다. 이 방법론에 따라, 당신은 수용체 베타 - 체포 상호 작용을 모니터링 할 수있을 것입니다, 뿐만 아니라 다른 세포성 단백질과 수용체 상호 작용. 이 방법론은 GPCR 베타-아테인 상호 작용이 리간드 구조의 수정에 의해 변조 될 수있는 방법을 연구하여 GPCR 약리학 분야의 근본적인 질문에 대답하는 데 도움이 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

G 단백질 결합 수용체에 의한 G 단백질의 선택적 활성화를 감지하는 간단한 방법은 세포 신호 전달에서 뛰어난 과제로 남아 있습니다. Fӧrster 공명 에너지 전달(FRET) 바이오센서는 GPCR을 G 단백질 펩타이드에 쌍으로 연결하여 살아있는 세포의 제어된 농도에서 구조적 변화를 조사하는 방식으로 개발되었습니다.

G 단백질 선택적 G​​PCR의 입체는 라이브 셀 서스펜션 형광 분석에서 FRET 센서를 사용하여 측정

여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

GPCRs가 매력적인 약물 성 표적이라는 점을 감안할 때, GPCR 리간드 스크리닝은 따라서 납 화합물의 식별및 탈판화 연구에 필수적입니다. 이러한 노력에 대해, 우리는 PRESTO-탱고, TEV 기반 기자 분석기를 사용하여 약 300 GPCRs에서 과도 β arrestin2 모집의 동시 프로파일링에 사용되는 오픈 소스 자원 플랫폼을 설명합니다.

PRESTO-탱고 분석기를 사용하여 GPCR 전체 규모의 리간드 스크리닝을 위한 β-Arrestin2 모집의 병렬 심문

S1P는 S1P 수용체(S1PRs) 서브패밀리를 통해 다양한 생리적 효과를 발휘한다. 여기에서는 S1PR의 구조와 기능에 대해 설명하기 위해 파이프 라인에 대해 설명합니다.

스핑고신 1-인산염 수용체의 구조와 신호전달 경로를 조사하는 파이프라인

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

이 연구에서 제시된 프로토콜은 두 가지 방법을 통해 cAMP를 측정하는 데 있어 cAMP Difference Detector In Situ  의 효과를 보여줍니다. 한 가지 방법은 HEK-293 셀이 있는 96웰 플레이트 판독 분광 광도계를 사용하는 것입니다. 다른 방법은 형광 현미경으로 개별 HASM 세포를 보여줍니다.

In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학

이 프로토콜은 G 단백질 결합 수용체 리간드 자극 시 살아있는 HEK293 세포에서 G 단백질 활성화를 실시간으로 측정하기 위한 BRET 기반 바이오센서의 사용을 설명합니다. 여기서, β2-아드레날린성 수용체와 칸나비노이드 1형 수용체는 여러 G 단백질 아형과 다양한 GPCR에 걸쳐 센서의 효율성을 입증하는 예로 사용됩니다.

살아있는 세포에서 G 단백질 결합 수용체 활성을 측정하기 위한 BRET 기반 G 단백질 바이오센서

학습하세요 실시간 생활 세포에서 GPCR-β-arrestin 상호작용을 모니터링하는 구조적 보완 분석법을 통해 약물 발견을 가속화하는 방법을. 이 기술은 수용체 약리학 연구에 활용됩니다.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

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