박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링
September 2nd, 2019
Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.
이 방법은 박테리아와 효모 와 같은 유기체및 다른 세포 모형에서 일시적인 단백질 상호 작용을 포착합니다. 여기서 우리는 세포 프로테오스타시스에 관여하는 과도하게 형성된 특정 샤페론 복합체를 모니터링합니다. 이 기술의 주요 장점은 대핵 세포및 진핵 세포에서 단백질 어셈블리의 역학 및 세포 소세포 지역화에 대한 정보를 생성하는 능력입니다.
박테리아와 효모 같이 단세포 유기체에 있는 이 기술의 적응은, 연구원이 미생물 감염과 관련있는 질병을 조사하기 위하여 강력한 공구로 그것을 이용하는 것을 허용합니다. 이 기술은 프로토콜의 샘플 준비 단계에서 조건을 단순히 변경하여 거의 모든 유기체에서 단백질 상호 작용을 분석하기 위하여 잠재적으로 이용될 수 있었습니다. 면역히스토화학, 면역형광, ELISA 또는 면역성수량중 하나에서 특이적이고 시험된 양질의 항체를 선택하는 것이 중요합니다.
폴리 L-Lysine와 함께 10웰 진단 슬라이드를 사전 치료하는 것으로 시작합니다. 멸균 및 필터링 된 0.0001 % 폴리 L-Lysine의 100 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 멸균 라미나르 플로우 후드에서 30 분 동안 슬라이드를 배양합니다. 그런 다음, 여분의 폴리 L-리신을 제거하기 위해 멸균 물 50 마이크로 리터로 각각 잘 씻으시다.
세포 유형에 따라 약 15, 000 세포를 잘 추가하고, 멸균 습한 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 60~80%의 수렴성으로 성장시다. 24시간 후, 각 웰의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 성장 배지를 제거하고, PBS의 50 마이크로리터로 세포를 세 번 세척한다. 그런 다음 PBS에 새로 준비된 4%파라포름알데히드50마이크로리터를 각 우물에 추가하고 실온에서 10분 동안 슬라이드를 배양하여 세포를 수정합니다.
고정 후 PBS로 슬라이드 염색 항아리에 슬라이드를 잠급하여 슬라이드를 세 번 씻으십시오. 부착된 세포의 막을 투과화하기 위해 PBS에서 0.5%트리톤-X100의 100밀리리터에 슬라이드를 잠수하고 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 TBS-T에서 슬라이드를 세 번 씻습니다.
마지막 세척 후 티슈 페이퍼로 과도한 버퍼를 제거합니다. S.cerevisiae 세포를 원고 의 방향에 따라 재배하고 희석한 다음 50 밀리리터 원심분리기 튜브와 펠릿을 3분 동안 665배 g에서 원심분리로 옮긴다. 상체를 제거하고 신선한 배지의 다섯 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
그런 다음 최종 농도4%를 위해 37%의 포름알데히드의 550 마이크로리터를 추가하고 세포를 고치기 위해 실온에서 배양을 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 셀펠릿, 상류제를 제거하고, 세척 버퍼로 새로 준비된 4%파라포름알데히드의 1밀리리터로 펠릿을 재보펜한다. 45 분 동안 실온에서 세포를 배양.
한편, 각 웰에 0.0001%의 폴리-L-Lysine 용액의 100마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 슬라이드를 배양하여 진단 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 여분의 폴리 L-리신을 초순수물로 씻어내고 슬라이드를 공기 건조하게 합니다. 인큐베이션 단계 후, 원심 분리에 의해 세척 버퍼 의 1 밀리리터로 세포를 두 번 세척.
상체를 제거하고 세척 버퍼에서 셀을 다시 중단합니다. 마지막 세척 후 세포를 펠렛, 상체를 제거하고 1.2 어어 소르비톨을 포함하는 세척 버퍼의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단. 세포 벽을 소화하기 위해 세포를 다시 펠릿하고 갓 준비 된 Lyticase 용액의 250 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하십시오.
부드러운 흔들림으로 15 분 동안 섭씨 30도에서 세포를 배양하십시오. 소화 단계 후, 세척 버퍼에서 세포를 세 번 세척하고 1.2 어어 소르비톨을 포함하는 세척 버퍼의 250 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 각 폴리 L-Lysine 코팅웰에 다시 중단된 세포의 20 마이크로리터를 추가하고 고정 및 투과 된 세포가 30 분 동안 부착할 수 있도록 합니다.
50 마이크로리터의 세척 버퍼로 우물을 세 번 세척하여 비 부착 세포를 제거하고 근접 결찰 분석으로 진행합니다. 근접 계각 분석, 또는 PLA 프로토콜을 시작하여 각 우물에 블로킹 버퍼를 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양한다. 각 우물의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 차단 버퍼를 제거하고, 세척 버퍼 A.Next의 100 밀리리터에 세포를 두 번 세척하고, 각 우물에 1 차 항체 용액의 40 마이크로리터를 추가하고 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 60 분 동안 슬라이드를 배양합니다.
1차 항체 용액을 제거하고 세척 버퍼 A.에서 슬라이드를 두 번 세척한 후, 각 웰에 이차 항체 용액의 40 마이크로리터를 추가하고 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 60분 동안 슬라이드를 배양한다. 그런 다음 용액을 제거하고 세척 버퍼 A.Then에서 슬라이드를 두 번 세척하십시오.다음 커넥터 올리고뉴클레오티드와 DNA 리그가 들어있는 DNA 결찰 혼합물의 40 마이크로리터를 각각 양호한 챔버에 넣고 30분 동안 습한 챔버에서 슬라이드를 배양한다. 인큐베이션 후, 리설주 혼합물을 제거하고 세척 버퍼 A.40 마이크로리터를 DNA 폴리머라제와 형광폴리티드를 각각 양호에 첨가하고, 습한 챔버에서 100분 동안 배양한다.
증폭 혼합물을 제거하고 세척당 10 분 동안 세척 버퍼 B의 100 밀리리터로 슬라이드를 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 세척 버퍼 B의 100 밀리리터로 세척하여 초순수 수에서 1~100을 희석시 세척합니다. 잘 당 DAPI 함유 마운팅 매체20 마이크로리터를 추가합니다.
슬라이드의 우물을 커버 슬립으로 덮고 매니큐어로 밀봉하십시오. 이 프로토콜은 HeLa, S.cerevisiae 및 E.coli 세포에서 구별되는 J 도메인 단백질과 Hsp70 샤페론 및 J 도메인 단백질 사이에 형성된 일시적인 샤페론 어셈블리를 성공적으로 모니터링하는 데 사용되었습니다. 인간 클래스 A 및 클래스 B J-도메인 단백질은 매우 구체적인 1 차적인 항체로 표적으로 했다.
각각의 적색 형광 펑크는 HeLa 세포에 있는 2개의 명백한 J 도메인 단백질 사이에서 형성된 단백질 복합체를 나타냅니다. 유사한 혼합급 J-도메인 단백질 복합체는 단세포 진핵생물 S.cerevisiae, 또는 제빵사의 효모에서 관찰됩니다. PLA에서 생성된 형광 펑크 중 일부는 작은 세포 크기로 인해 개별 적인 초점으로 해결하기가 더 어려웠습니다.
클래스 A와 B J 도메인 단백질 사이의 복잡한 형성은 정제 된 단백질과 수행 생화학 연구와 일치하는 E.coli 세포에서 관찰되지 않았다. 그러나 J-도메인 단백질과 Hsp70 샤페론을 포함하는 다른 샤페론 어셈블리는 PLA 프로토콜을 사용하여 포착되었다. 그렇지 않으면 완전한 PLA 반응에서 상호 작용하는 J-도메인 단백질 또는 샤페론 중 하나에 대한 1 차항체가 부족한 기술적 제어는 세포에서 형광 천티 형성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았으며, 이는 거짓 양성 신호 증폭의 부족을 나타낸다.
근접 결찰 분석기를 사용하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 사용되는 항체가 충분한 품질인지 미리 확인하십시오. 또한 세포벽을 함유한 세포의 과다 소화를 피하는 예방 조치를 취하십시오.
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개요
본 연구는 다양한 생물학적 과정을 촉진하기 위해 샤페론 Hsp70과 함께 작용하는 J-domain 단백질의 역할을 조사합니다. 현장 근접 연결 분석법(in situ proximity ligation assay, PLA)을 활용하여 연구진은 세균, 효모, 인간 세포에서 일시적인 샤페론 복합체를 모니터링하며 세포성 항상성(cellular proteostasis)에 대한 통찰력을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 세포성 항상성
- 단백질 상호작용 및 복합체
- 미생물 감염에서의 생물학적 의미
배경
- 단백질 역동성에서 샤페론 기계 장치의 중요성
- 세포 생물학에서 일시적인 상호작용의 관련성
- 질병 연구에서의 잠재적 응용
사용된 방법
- 현장 근접 연결 분석법 (PLA)
- 원핵생물 (E. coli) 및 진핵생물 (HeLa, S. cerevisiae) 세포 모델
- 면역 형광 및 특정 항체 기술
주요 결과
- J-domain 및 Hsp70 샤페론 상호작용의 성공적인 모니터링
- 단백질 조립체의 세포 내 소위 위치 시각화
- 다양한 생물종에 대한 방법의 적응성
결론
- 본 연구는 J-domain 단백질이 단백질 접힘 및 분해에 있어 중요한 역할을 수행함을 입증합니다.
- 이 방법은 다양한 생물학적 시스템에서 단백질 역동성에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Monitoring transient protein interactions in prokaryotic and eukaryotic systems enables mechanistic de-risking of chaperone-mediated proteostasis pathways relevant to neurodegenerative and infectious disease targets. The proximity ligation assay (PLA) provides quantitative, subcellular resolution of transient chaperone assemblies, supporting target validation and assay development in early discovery. This cross-species applicability enhances predictive confidence in lead identification by capturing dynamic protein quality control networks in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transient J-domain protein heterocomplexes that fine-tune Hsp70-mediated disaggregase activity.
- Operational Value: Provides subcellular localization data to clarify functional relevance of chaperone interactions in stress response pathways.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by capturing dynamic assemblies linked to protein quality control under acute/chronic stress conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescent readouts proportional to transient chaperone complex formation in fixed cells.
- Operational Value: Delivers reproducible, amplification-based signal detection compatible with high-content imaging workflows.
- Assay Readiness: Adapted to bacterial, yeast, and human cell models, enabling platform reuse across prokaryotic and eukaryotic systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects chaperone complex dynamics to proteostasis failure in models of protein aggregation and microbial infection.
- Operational Value: Enables cross-species comparison of J-domain protein interactions to assess conservation of disaggregase mechanisms.
- Translational Continuity: Supports mechanistic de-risking by linking transient complex formation to functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing dynamic interaction data that informs target confidence prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chaperone co-complex formation in subcellular compartments under stress-inducing conditions.
- Screening: Enables assay standardization through quantitative PLA signal measurement across bacterial, yeast, and mammalian cell platforms.
- Analytics: Delivers puncta-based readouts that correlate with transient complex abundance, facilitating condition comparison and pathway modulation studies.
- Translational Research: Links chaperone assembly dynamics to proteostasis capacity in models relevant to neurodegenerative and infectious disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized PLA protocol adaptable to diverse organisms via sample preparation adjustments, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by resolving transient, subcellular chaperone interactions invisible to bulk biochemical methods.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, permeabilization, and antibody validation steps across cell types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic insight into chaperone network functionality under disease-relevant stress.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on chaperone-mediated disaggregase activity and complex conservation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, antibody validation, and proximity ligation assay optimization.
- Dependent on high-quality primary antibodies validated for immunohistochemistry, immunofluorescence, ELISA, or immunoprecipitation.
- Necessitates standardized wash buffers, blocking agents, and humid chamber incubation for consistent signal amplification.
- Requires optimization of cell wall digestion (e.g., lyticase for yeast) to prevent over-digestion and maintain epitope accessibility.
- Practical limitation: Signal resolution may be challenged in small cells (e.g., yeast) where fluorescent puncti overlap, necessitating super-resolution imaging for precise quantification.
