Name: 유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 학습하세요 유세포측정을 이용한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량과 막 전위 측정 방법을. TMRM 염색과 니코틴아미드 리보사이드 처리를 통해 대사 적합성을 평가하고 골수이식 및 콜로니형성 분석과 결합할 수 있습니다.

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우리는 UNIL 흐름 세포 분석 코어 시설의 지원에 특히 로메인 베델 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 N.V와 O.N.에 크리스티안 게르하르트 제브슨 재단 보조금에 의해 지원되었다.

원고에 기재된 모든 실험은 우리 기관의 지침을 따르며 동물 실험에 대한 스위스 법(승인: VD3194) 및 인간 시료와 관련된 연구에 따라 수행되었다(프로토콜: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. 조혈 줄기 세포 추출
<ol><li>야생 형 C57BL6/J 마우스를 구입하고 운송 관련 스트레스를 줄이기 위해 적어도 일주일 동안 동물의 집에 보관하십시오.</li>
	<li>실험 당일,CO2 질식을 사용하여 마우스를 안락사시한다.</li>
	<li>모피를 살균하고 뒷다리에서 대퇴골과 경골 뼈를 잘라 해부 가위와 집게와 같은 표준 수술 도구를 사용하여 뱃속에서 마우스를 잘라 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이.</li>
	<li>부드러운 종이 타월을 사용하여 대퇴골, 경골 및 골반에 부착 된 근육을 제거하고 얼음에 1 mMEDA (완충제)가있는 PBS가 들어있는 50 mL 튜브에 깨끗한 뼈를 놓습니다.</li>
	<li>박격포와 유봉에 70 % 에탄올을 뿌리고 세포 배양 후드에 놓습니다. 자외선으로 30분 동안 살균하십시오.</li>
	<li>박격포에 약간의 완충액 (~ 10 mL)으로 깨끗한 뼈를 넣고 부드럽게 현탁액에서 골수를 얻기 위해 그들을 분쇄. 이제, 세포 현탁액을 수집하고 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 50 mL 튜브로 70 μm 세포 스트레이너를 통과시다.</li>
	<li>모든 골수가 추출되고 뼈 파편이 하얗게 변할 때까지 1.6 단계를 반복합니다.</li>
	<li>골수 단세포 현탁액을 포함하는 50 mL 튜브(들)를 원심분리기에 놓는다. 300 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기를 실행하여 세포를 펠렛합니다.</li>
	<li>한편, 오토클레이브 증류수에서 10 mL의 RBC 용해 버퍼를 준비합니다. 0.22 μm 필터를 통해 용액을 필터링합니다.</li>
	<li>원심분리기에서 샘플 튜브를 수집하고 상급체를 제거합니다. 1x RBC 리시스버퍼(재료 표)를세포 펠릿상에 피펫합니다. 펠릿을 빼내고 몇 번 위아래로 파이펫팅하여 균일한 용액을 준비합니다. RBC 용해가 발생할 수 있도록 튜브가 실온에서 1-2 분 동안 되도록 하십시오. 버퍼로 튜브를 채우면 용해 과정을 중지합니다.</li>
	<li>튜브를 원심분리기에 놓고 4°C에서 5분 동안 300 x g으로 돌입니다. 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상급을 장식합니다. 10 mL의 버퍼를 추가하여 펠릿을 다시 중단하고 RBC 용해로 인한 이물질을 제거하기 위해 70 μm 셀 스트레이너를 통해 새로운 50 mL 튜브에 용액을 필터링합니다.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상급을 장식합니다. 500 μL의 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>100 μL aliquot를 제거하고 별도의 1.5 mL 튜브에 보관하십시오. 50 μL의 비오틴 계보 고갈 항체 칵테일을 전구 농축키트(재료 표)에서나머지 450 μL의 세포 현탁액에 추가합니다. 15 분 동안 셰이커에 4 °C에서 배양.</li>
	<li>버퍼 15 mL를 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 300 x g의 튜브를 원심 분리합니다. 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상급을 장식합니다. 460 μL의 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 10 μL aliquot를 제거하고 별도의 1.5 mL 튜브에 보관하십시오.</li>
	<li>선조 농축 키트(재료 표)에서스트렙타비딘 자기 비드 50 μL을 나머지 450 μL 세포 현탁액에 추가하십시오. 15 분 동안 셰이커에 4 °C에서 배양.</li>
	<li>버퍼 15 mL를 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 300 x g의 튜브를 원심 분리합니다. 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상급을 장식합니다. 5 mL의 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단하고 용액을 15 mL 튜브로 옮김.</li>
	<li>튜브를 자동 셀 분리기(재료표)로가져가십시오. 세척 프로그램을 실행하여 셀 분리기의 튜브를 헹구고 프라이밍합니다. 샘플과 두 개의 수집 튜브를 튜브 홀더에 놓습니다. "고갈"프로그램을 사용하여 분리를 수행합니다. 실행이 종료되면 자동화된 셀 구분 기호에서 양수 및 음수 분수를 수집합니다. 참고: 자동 셀 분리기의 부재에서 사용자는 사용자 매뉴얼에 따라 수동 자기 열과 해당 자석을 사용할 수 있습니다. 사용자는 수동 분리 프로세스가 자동화된 분리 프로세스보다 느리다는 것을 명심해야 합니다. 또한 수동 열이 막히는 경향이 있습니다. 따라서 사용자는 샘플을 희석하고 컬럼에 천천히 로드하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>양수 분수를 삭제합니다. 음의 분획 튜브를 버퍼로 채웁니다. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.</li>
	<li>한편, 최종 부피 용액의 1 mL에서 항체 혼합을 준비하고 최종 부피 용액의 200 μL에서 단일 색상 제어를 재료 표 1에기재한다. 참고: TMRM과 녹색 형광 미토콘드리아 얼룩이 줄기 세포 마커 염색과 결합될 경우 CD150-PE를 CD150-PEcy5 및 스트렙타비딘-Tx 레드와 스트렙타비딘-팩 오렌지로 대체합니다.</li>
	<li>원심분리기에서 샘플 튜브를 수집하고 상급체를 제거합니다. 항체 혼합물 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 각 단일 색상 제어 튜브(계보 제외)에 10 μL의 셀(단계 1.13에서)을 추가합니다. 리니지 단일 컬러 튜브에 10 μL의 셀(단계 1.14에서)을 추가합니다.</li>
	<li>시료와 단색 제어 튜브를 셰이커에서 4°C에서 45분 동안 배양합니다.</li>
	<li>모든 튜브를 버퍼와 원심분리기로 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 채웁니다. 상급을 폐기하고 버퍼의 200 μL에서 버퍼 및 단일 색상 컨트롤의 1 mL에서 샘플을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>샘플 및 단일 색상 컨트롤을 5 mL 필터 상단 FACS 튜브로 전송합니다.</li>
	<li>튜브를 선별 기계로 가져가 서 줄기 세포 확장 배지의 400 μL을 포함하는 1.5 mL 튜브에서 HSC 인구 (그림 1A의게이팅 전략)를 분류합니다.</li>
</ol>2. 조혈 줄기 세포의 전 생체 배양
<ol><li>정렬된 셀이 포함된 튜브를 수집합니다(셀 추출의 경우 섹션 1 참조). 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 펠릿을 제거하지 않고 상한체의 대부분을 부드럽게 제거하고 세포 펠릿 위에 50-80 μL을 둡니다. 이렇게 하면 셀 손실이 최소화됩니다.</li>
	<li>테스트할 조건의 수에 의존하는 최종 부피로 줄기 세포 팽창 배지에서 세포 펠릿을 재중단합니다(배양 조건당 100 μL에 대한 카운트).</li>
	<li>줄기세포 확장배지, 줄기세포인자(200ng/mL), FLT3 리간드(4ng/mL) 및 펜-스트렙 항생제(1%)를 함유하는 2배 배양배지를 준비한다. (2배 기저 배지; 재료 표)를 참조하십시오.</li>
	<li>멸균 조직 배양처리된 96 U-bottom 웰플레이트(표 의 재료)를취하고 세포가 배양될 웰을 식별한다(도 1B의플레이트 디자인). 참고: 사용자는 증발에 더 취약하기 때문에 한계 우물을 피하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>이 우물에서 2.3단계에서 이전에 제조된 2x 기저 배지의 100 μL을 넣습니다. 100x NR 용액(재료 표)의2 μL을 잘 추가 표시된 NR. 24시간마다 NR을 보충하십시오. 참고: 보충은 NR에만 해당됩니다. 다른 대사 변조기 는 보충을 필요로 할 수도 있거나 필요하지 않을 수도 있습니다.</li>
	<li>종자 100 μL의 세포는 2x 기저 배지를 함유하는 웰 위에 단계 2.2에서 제조하였다. 본 실험에서 웰당 종자된 HSC의 수는 800-1,000개의 세포 사이였다.</li>
	<li>기저 배지 2개가 들어 있는 5개의 추가 우물을 준비합니다. 이들 각각에서 100,000개의 전체 골수 세포(단계 1.13로부터)를 100 μL의 줄기세포 팽창 배지에 재중단하여 배양 후 유동 세포 분석분석의 염색 대조군으로 사용한다. 참고: 사용자가 포스트 배양 분석을 위한 줄기 세포 마커 및 미토콘드리아 마커를 결합하려는 경우 전구 집단(Ckit+ 세포 또는 LKSCD150-세포)을 추가로 정렬하는 것이 좋습니다. 종자 이러한 정렬된 선조는 포스트 배양 유세포 분석용 스테인링 제어 웰에서. 단일 얼룩 색상당 1개의 웰을 준비합니다.</li>
	<li>200 μL의 오토클레이브 수를 모든 주변 우물에 넣어 세포를 포함하는 우물에서 증발을 줄입니다. 배양 기간(72h)의 기간 동안 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이터에 방해받지 않고 방치한다. 플레이트를 제거하여 24시간마다 NR을 보충하고 인큐베이터에 다시 놓습니다.</li>
</ol>3. 미토콘드리아 질량 및 멤브레인 전위 측정
<ol><li>배양 기간이 끝나면 줄기 세포 확장배지(표)에서TMRM(20 μM) 및 미토트래커 그린(10 μM)(녹색 형광 얼룩)의 100x 용액을 준비한다.</li>
	<li>각 테스트 웰에 100x TMRM 용액 2 μL과 100x 녹색 형광 얼룩 용액 2 μL을 추가합니다. TMRM 컨트롤에 100x TMRM 의 2 μL을 잘 추가합니다. 미토트래커 컨트롤에 100x 녹색 형광 얼룩 2 μL을 추가합니다. 플레이트를 37°C및 5%CO2에서 45분 동안 인큐베이터에 다시 놓습니다. 참고: ABC 펌프 매개 염료 유출을 테스트해야 하는 경우 Verapamil(ABC 펌프 억제제)을 사용하여 추가적인 제어를 준비할 수 있습니다. 이를 위해 TMRM 및 녹색 형광 얼룩에 대한 염색 전에 테스트 웰 1 시간 중 하나에 50 μM Verapamil을 추가하십시오.</li>
	<li>인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 표준 FACS 버퍼(PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS)를 200 μL 추가하고 플레이트를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 이 세탁 단계를 3x 반복합니다. 사용자는 직접 적인 빛에 최소한의 노출을 제공하기 위해 플레이트가 항상 호일로 덮여 있는지 확인해야합니다. 참고: 사용자가 줄기 세포 염색과 미토콘드리아 염색을 결합해야하는 경우, 샘플은 모든 줄기 세포 마커의 항체 혼합으로 배양되어야하며 단색 컨트롤은 30-45 분 동안 4 °C에서 개별 항체로 별도로 염색해야합니다. 참고: 모든 단계에서 사용자는 알루미늄 호일로 덮인 판을 유지해야합니다. 사용자는 이 추가 염색 단계 및 후속 세척 단계는 추가 세포 손실을 초래할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.</li>
	<li>FACS 버퍼의 200 μL에서 세포를 다시 중단하고 FACS 튜브로 옮김.</li>
	<li>유량 세포계에서 샘플을 실행합니다(그림 1참조). WBM을 포함하는 단 하나 색깔 관은 다음을 포함한다: (1) 얼룩이 없는; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) 녹색 형광 얼룩 (FITC); (5) 전체 얼룩 (PE 및 FITC).</li>
	<li>먼저 단일 색상 컨트롤을 획득하여 컴퓨터를 설정합니다. 컴퓨터에서 실행 중인 소프트웨어를 사용하여 보정을 계산합니다. 보정이 적용되면 HSC 샘플을 획득하고 가능한 한 많은 이벤트를 기록합니다. 참고: 줄기 세포와 미토콘드리아 마커가 결합되는 경우, 사용자는 TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) 및 Sca-1 (APC) 사이의 보상에 특히 주의해야합니다. 또한, 샘플은 즉시 얼룩 후 실행되어야한다.</li>
	<li>세포계에서 FACS 파일을 내보내고 분석소프트웨어(재료 표)에서데이터를 분석합니다.<ol>
<li>분석을 위해 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. FSC-A 및 SSC-A 게이팅을 사용하여 세포 집단을 식별합니다. DAPI 음수 분수(라이브 셀)를 플로팅하기 전에 다음 게이트에서 싱글을 식별합니다. 라이브 셀 게이트에서 TMRM 및 녹색 형광 얼룩 채널에서 윤곽 플롯을 만들어 ΔΘm 및 질량을 각각 측정한다(도2A). 라이브 셀 게이트에서 이들 두 채널의 평균 형광 강도(MFI)를 내보냅니다.</li>
		<li>TMRM 로우 게이트는 TMRM 채널의 어깨 모집단에 기초하여 설정됩니다. TMRM 단색 컨트롤은 게이트를 설정하기 위해 이 어깨 모집단을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. TMRM 로우 게이트에서 셀의 수분 비율을 제어및 플롯에 대한 테스트 샘플로 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

이 작품의 일부 요소는 유럽 특허청에 P1828EP00의 출원으로 제출되었습니다.

HSC 기능의 엄격한 조절은 유기체의 일생 동안 안정적인 조혈을 유지하는 것이 중요합니다. 본문에 다양 한 다른 세포 유형 처럼, HSC 기능의 조절에 기여 하는 주요 구성 요소는 세포 대사. 우리의 실험실에서 이전 연구9 그리고 다른사람 2,3 HSC에서 뚜렷한 대사 상태를 유지에 미토 콘 드리 아의 중요성을 연루 했다. murine 골수에서 분리 된 HSCs의 매우 낮은 수로 인해, 표준 대사 분석 (예를 들어, SeaHorse와 산소 소비)를 통해 그들을 분석 하기 어렵다. 우리의 이전 작업을 기반으로, 우리는 안정적으로 세포의 낮은 수 (즉, HSC)에서 미토콘드리아 질량과 막 전위 (활성에 대한 간접 판독)를 측정하기 위해 간단한 유세포 분석 분석. 이 분석법은 생존력을 손상시키지 않고 살아있는 세포에 대한 측정을허용합니다 9,사용...

조혈 줄기 세포 (HSCs)는 유기체의 일생 내내 혈액 생산 및 항상성을 지키는 골수에 거주하는 세포의 작은 인구입니다. HSCs는 세포 분열및 잘 조율된 분화 단계1을통해 말단분화 된 성숙한 혈액 세포 혈통을 생성하는 선조를 초래함으로써 이러한 과정을 중재한다. 중요한 것은, HSC는 혐기성 glycolysis를 통해 그들의 에너지를 생성합니다. 대조적으로, 더 헌신적이고 적극적인 조혈 선조는 미토콘드리아 물질 대사를 향해 그들의 신진 대사를 전환2,3,4. 이러한 뚜렷한 대사 상태는 활성 미토콘드리아에 의해 생성된 반응성 산소 종(ROS)에 의해 가해지는 세포 손상으로부터 HSC를 보호하는 것으로 여겨지며, 이에 따라 생체 내에서 장기간 의 기능5,6,7,8을유지한다. HSC 대사 상태의 직접 측정은 그들의 제한된 수로 인해 도전적이고 종종 낮은 처리량입니다. 여기서, 우리는 HSCs에서 녹색 형광 미토콘드리아 스테인(Mitotracker Green)을 이용한 테트라메틸호다민 메틸 에스테르(TMRM) 형광 및 미토콘드리아 질량을 이용한 미토콘드리아 막 전위(ΔΘm)의 강력한 측정을 위한 유세포분석기반 분석기를 기술한다. 우리는 이전에 낮은 ΔΔm이 고도로 정제 된 HSCs9및 ΔΘm을 낮출 수있는 대사 변조기의 보나 - 선의 기능 마커가 HSC 기능9,10을향상시키는 것을 입증했습니다. 여기에서 우리는 HSC의 장기 혈액 재구성 잠재력을 향상할 수 있는 새로운 분자를 확인하기 위한 전략으로 HSCs 미토콘드리아 프로파일링에 대한 우리의 방법을 제안합니다.
일례로, 우리는 이 분석이 비타민 B3 아날로그 니코틴아미드 리보사이드(NR)에 노출될 때 HSC ΔΘm의 하강을 안정적으로 측정한다는 것을 입증한다. 따라서, 최근 발표된 연구에서 NR은 조혈줄기 및 전구 기능을 직접 개선하여 마우스 및 인간화된 마우스 시스템 모두에서 혈액 회복 후 이식을 강력하게 개량한다는 것을 입증한다10. 이러한 대사 조절제의 용량은 이식 후 환자에서 25%의 사망률이 혈액 및 면역 회복의 지연과 관련이 있다는 점을 고려할 때 임상적 가치가크다(11,12).
더욱이, 우리는 이 방법론이 인간 T 세포의 신진 대사 단면도 및 기능의 특성화를 위해 적용될 수 있다는 증거를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 자가 종양 침윤 림프구 (TILs)를 이용한 입양 세포 치료 (ACT)의 개발은 매우 불리한 예후를 가진 특정 유형의 고급 암에 가장 효과적인 접근법이되었습니다 (예를 들어, 전이성 흑색종, 환자의 >50 %가 치료에 반응하고 환자의 최대 24 %가 완전한 회귀를 가지고있습니다). 그러나, 충분한 항종양 활성을 수용하는 TILs는14를생성하기 어렵다. EX 생체 확장 동안 TIL이 겪는 광범위한 증식 및 자극은 T 세포 항종양 반응을 극적으로 손상시키는 T 세포 고갈 및 노화를 야기한다15. 중요한 것은, TILs의 항종양 용량은 그들의 신진대사에 밀접하게 연결되어있으며, 17및 PI3K/Akt 통로의 억제를 통해 신진대사를 조절하기 위한 접근법은 고무적인 결과를18,19로생성했다. 이러한 이유로, 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 환자 유래 TiLs에서 파생 된 T 세포의 ΔΘm을 비교하고, 덜 분화 된 PBMC 유래 T 세포가 말기 분화 된 TiLs에 비해 더 낮은 ΔΔ및 미토콘드리아 질량을 가지고 있음을 보여줍니다.
우리는 이 분석이 ΔΘm의 변조를 통해 HSC와 T 세포 기능을 향상시키는 새로운 대사 조절기를 식별하는 데 사용될 수 있다는 것을 구상합니다.

<table><tbody><tr><td>5 mL FACS 튜브</td><td>, Falcon</td><td>352235</td>, <td>시료 준비</td></tr>, <tr><td>96-U 바닥판</td>, <td>Corning</td><td>3799</td>, <td>세포 배양</td></tr><tr><td>AutoMACS 프로 분리기</td>, <td>Miltenyi Biotec,</td><td></td><td>자동 세포 분리</td></tr>, <tr><td>BD FACS, AriaIII, Becton</td><td>및 Dickinson</td><td></td><td>세포 분류</td></tr><tr><td>BD, IMag 마우스, 조혈전구 세포 농축 키트</td>, <td>BD</td><td>558451</td><td>계통 고갈</td></tr><tr><td>BD, LSRII</td>, <td>Becton 및 Dickinson</td><td></td>, <td>FACS 수집 기계</td></tr>, <tr><td>BD-DIVA</td><td>Becton 및 Dickinson</td><td></td><td>수집 소프트웨어</td></tr>, <tr><td>CD150 PE</td>, <td>Biolegend</td><td>115904</td><td>항체 염색 믹스</td></tr>, <tr><td>CD150, PE-Cy5</td>, <td>Biolegend</td><td>115912</td><td>항체 염색 믹스</td></tr>, <tr><td>CD48 PB</td>, <td>Biolegend</td><td>103418</td><td>항체 염색 믹스</td></tr><tr><td>Centrifuge- 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Centrifugation</td></tr><tr><td>Ckit PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>105814</td><td>항체 염색 혼합물</td></tr><tr><td>Flow jo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>FACS 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>GraphPad-Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>그래프로 데이터 플로팅</td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>미토콘드리아 질량을 측정하기 위한 녹색 형광 미토콘드리아 염색; 작업 농도 = 100 nM; 재고 농도 = 1 mM</td></tr><tr><td>니코틴아미드 리보시드 (NR)</td> <td>집에서</td><td></td> 합성된 <td>맞춤형 대사 조절제;작업 농도 = 500 &마이크로; M; 스톡 농도 = 50 mM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>CHUV</td><td></td> 1000324 <td>완충액 준비; 작업 농도 = 1x; 스톡 농도 = 1x</td></tr><tr><td>Pen-Strep (P/S)</td><td>생명 기술</td><td>15140122</td><td>생체 외 배양; 작업 농도 = 1x; 스톡 농도 = 1x</td></tr><tr><td>RBC 용해 버퍼</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>Lysing Red blood Cells; 작업 농도 = 1x; 스톡 농도 = 10x</td></tr><tr><td>재조합 마우스 Flt-3 리간드 (FLT3)</td> <td>RnD</td><td>427-FL-005 / CF</td><td>Ex vivo 배양; 작업 농도 = 2 ng / mL; 재고 농도 = 10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>재조합 마우스 줄기 세포 인자 (SCF)</td><td>RnD</td><td>455-MC-010/CF</td><td>Ex vivo culture; 작업 농도 = 100 ng/mL; 재고 농도 = 50 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>Sca1 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5981-82</td><td>항체 염색 혼합물</td></tr><tr><td>StemlineII 조혈 줄기 세포 확장 매체</td><td>SIGMA</td><td>S0192</td><td>Ex 생체 배양</td></tr><tr><td>Streptavidin Pac orange</td><td>Life Technologies</td><td>S32365</td><td>항체 염색 혼합물</td></tr><tr><td>Streptavidin Tx red</td><td>Life Technologies</td><td>S872</td><td>항체 염색 혼합물</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>염색 미토콘드리아 막 전위; 작업 농도 = 200 nM; 스톡 농도 = 10 mM</td></tr><tr><td>초순수 EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>버퍼 준비; 작업 농도 = 0.5 M; 스톡 농도 = 1 mM</td></tr></tbody></table>

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 t세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

정지, 자기 재생 및 분화의 미세 한 균형은 조혈 줄기 세포를 보존하는 열쇠 (HSC) 풀과 모든 성숙한 혈액 세포의 평생 생산을 유지. 최근 몇 년 동안 세포 대사HSC 기능과 운명의 중요 한 레 귤 레이 트로 등장 했다. 우리는 이전에 미토콘드리아 대사의 변조가 HSC 운명에 영향을 미친다는 것을 입증했습니다. 특히, 전자 수송 사슬을 화학적으로 분리함으로써 우리는 일반적으로 급속한 분화를 유도하는 배양 조건에서 HSC 기능을 유지할 수 있었습니다. 그러나, HSC 수를 제한하는 것은 수시로 HSC 물질 대사를 측정하고 그러므로 그들의 기능을 예측하기 위하여 표준 측정법의 사용을 배제합니다. 여기에서, 우리는 HSC와 같은 희소한 세포에 있는 미토콘드리아 막 전위 그리고 미토콘드리아 질량의 믿을 수 있는 측정을 허용하는 간단한 교류 세포 분석분석서를 보고합니다. 우리는 마우스 골수에서 HSC의 격리 및 미토 콘 드리 아 질량 및 막 잠재적인 포스트 생체 배양의 측정을 논의. 예를 들어, 우리는 대사 변조기로 치료를 통해 HSC에서 이러한 매개 변수의 변조를 보여줍니다. 더욱이, 우리는 인간 말초 혈액 유래 T 세포 및 인간 종양침투 림프구 (TILs)에 이 방법의 응용 프로그램을 확장하여 미토콘드리아 프로필에 극적인 차이를 보이며 아마도 다른 T 세포를 반영합니다. 기능. 우리는 이 분석이 다른 문맥에 있는 각종 세포 모형에 있는 미토콘드리아 물질 대사의 변조기를 확인하기 위하여 검열에서 채택될 수 있다는 것을 믿습니다.

도 1에서 우리는 마우스 골수로부터 조혈 줄기 세포의 분리를 위한 게이팅 전략과 그들의 생체 배양에 대한 플레이트의 레이아웃을 보여준다. 도 1A는 SSC-A/FSC-A 플롯에서 림프구 분획의 식별을 나타낸다. 더블ts는 DAPI 신호의 부재에 의해 살아있는 세포의 식별에 이어 단일 게이트에서 제거되었다. 계보-Sca1+cKit+로정의된 LKS 집단이 확인되었다. 이 인구는 줄기와 전구 세포를 포함 하는 것으로 알려져 있다. HSC는 LKS 집단에서 세포의 약 5-10%를 형성하고 CD150+CD48-집단에 대한 게이팅에 의해 확인되었다. 도 1B는 생체 배양에 대한 96웰 플레이트의 레이아웃을 나타낸다. 정렬된 HSC는 서로 다른 ...

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 미토콘드리아 막 전위 및 미토콘드리아 질량을 측정할 수 있는 간단한 유동 세포계 기반 분석입니다. 표준 신진 대사 분석은 조혈 줄기 세포와 같은 희소한 인구로 일할 때 실패합니다. 이 방법은 사용자가 세포의 낮은 수로 작업 할 때 미토콘드리아 막 프로파일링을 가능하게하고 HSC와 같은 세포의 새로운 대사 변조기를 결정할 수 있습니다.더욱이, 당신은 당신의 세포 포스트 배양의 기능을 결정하기 위해 골수 이식 또는 식민지 형성 소와 같은 다운스트림 기능적 작용과 결합 할 수 있습니다. 우리의 기술은 골수 이식및 조혈 면역 회복의 맥락에서 HSC 기능을 향상할 수 있는 새로운 분자의 식별을 위해 이용될 수 있습니다. 우리의 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 우리의 방법은 면역 T 세포의 신진 대사 적 적합성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.세포가 염색 한 후 빛에 최소한의 노출을 갖는 것이 매우 중요합니다. 더욱이, 펌프 억제제 베라파밀의 사용은 펌프 efflux의 기여를 평가하기 위해 포함되어야 한다. 그러나, 사용자는 verapamil 심오닉 평형을 심오하게 perturbs 하 고 미토 콘 드리 아 막 잠재력에 대사 변조기의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 없습니다 알고 있어야.이 방법의 시각적 데모는 셀 수가 적은 작업할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 단계가 있기 때문에 매우 중요하며 이러한 단계는 사용자가 PubMed에서 읽는 일반 논문에서 매우 자주 누락됩니다. FAC 정렬의 경우, 계보 네거티브, Sca1 양성, cKit 양성으로 정의된 LKS 모집단이 식별됩니다. LKS 인구에 있는 세포의 약 5에서 10%에서 조혈 줄기 세포는 HSC로 표지된 CD150 양성, CD48 음성 인구에 대한 게이팅에 의해 확인됩니다.조혈 줄기 세포 분류 후, 원심 분리는 섭씨 4도에서 5 분 동안 300 배 g에서 튜브를 분리합니다. 펠릿을 손상시키지 않고 대부분의 상체를 부드럽게 제거하고 셀 펠릿 위에 50~80마이크로리터를 둡니다. 줄기 세포 팽창 매체에서 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 최종 부피로 재중단한다.멸균 조직 배양을 준비하여 96U-바닥 우물 플레이트를 처리하고 세포가 배양될 우물을 식별한다. 이전에 이러한 우물에서 제조 된 2 배 기저 배지의 100 마이크로 리터를 전송합니다. NR에서 잘 표시, 100 x 니코틴 아미드 리보 사이드 솔루션의 두 마이크로 리터를 추가합니다.염색 제어를 위해 2배 기저 배지의 100마이크로리터를 우물로 옮기다. 2배 기저매질을 함유한 우물 위에 준비된 조혈 줄기세포의 100마이크로리터를 시드한다. 스테인링 컨트롤로 표시된 우물에 전체 골수 세포의 100 마이크로 리터를 시드.모든 주변 우물에 200 마이크로리터의 오토클레이터를 추가하여 세포가 함유된 우물의 증발을 줄입니다. 72시간 동안 5%의 이산화탄소를 37도의 인큐베이터에 보관하십시오. 24시간마다 니코티나미드 리보사이드를 보충하기 위해 접시를 꺼내 인큐베이터에 다시 넣습니다.배양 기간이 끝나면 각 테스트 웰에 100x TMRM 용액의 마이크로리터 2개와 100x 녹색 형광 얼룩 용액 2개를 추가합니다. TMRM 염색 제어에 100x TMRM의 마이크로리터 2개를 잘 추가합니다. MitoTracker 염색 컨트롤에 100x 녹색 형광 얼룩의 두 개의 마이크로리터를 잘 추가합니다.알루미늄 호일로 접시 의 상단을 덮습니다. 접시를 37°C의 인큐베이터에 다시 놓고 이산화탄소를 5%에서 45분간 조리합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 원심분리기를 300배 g에서 5분간 분리합니다.플레이트를 반전하여 상체를 제거하고 표준 FACS 버퍼 200 마이크로리터를 추가하여 다시 일시 중지합니다. 호일로 접시를 덮습니다. 접시를 300배 g에서 5분간 원심분리합니다.이 세탁 단계를 세 번 반복하십시오. FACS 버퍼의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 FACS 튜브로 전송합니다. 유량 사이토미터에서 샘플을 실행하려면 먼저 단일 색상 컨트롤을 컴퓨터에 로드하고 각각 5, 000개 이상의 이벤트를 하나씩 기록합니다.소프트웨어에서 다운로드를 누르고 대시보드에 기록하여 단일 색상 컨트롤을 획득하고 기록합니다. 보상 설정을 누르고 보상 계산을 클릭하여 보상을 계산합니다. 보상이 적용되면 조혈 줄기 세포 샘플을 획득하고 가능한 한 많은 이벤트를 기록하십시오.사이토미터에서 FACS 파일을 내보내고 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. FlowJo에서, 세포 인구를 확인하기 위해 전방 산란 및 측면 산란 게이팅을 사용합니다. 다음 게이트에서 싱글을 식별한 다음 라이브 셀을 나타내는 DAPI 음수 분수를 플롯합니다.살아있는 세포 게이트에서, 각각 미토콘드리아 막 전위와 질량을 측정하기 위해 TMRM 및 녹색 형광 얼룩 채널에서 윤곽 플롯을 합니다. 라이브 셀 게이트에서 이 두 채널의 평균 형광 강도를 내보냅니다. 그런 다음 모든 샘플에서 TMRM 로우 게이트에서 셀의 비율을 내보냅니다.니코틴아미드 리보사이드 치료는 TMRM 낮은 인구에 있는 명확한 증가를 보여주었습니다. 또한 TMRM 낮은 게이트에서 세포의 비율을 크게 증가시키고 TMRM 형광 강도의 현저한 저하를 보였다. 미토콘드리아 질량은 니코틴아미드 리보사이드 보충제에 따라 변하지 않았다.또한, 줄기 세포 마커 염색은 미토콘드리아 염색 후 배양과 결합되었다. 조혈 줄기 세포를 식별하는 게이팅 전략으로 니코틴아미드 리보사이드에 대한 노출은 TMRM 저인구의 현저한 증가와 게이트 HSC의 TMRM 형광 강도의 현저한 감소를 보였다. 녹색 형광 미토콘드리아 얼룩 녹색 신호는 두 가지 조건에서 변경되지 않았습니다.염색된 시료에 대한 빛의 노출을 최소화하기 위해 알루미늄 호일로 염색 판을 덮는 것이 중요합니다. 이 방법은 골수 이식 및 콜로니 형성 소법과 같은 다운스트림 소법과 결합하여 줄기 세포의 기능을 결정할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 HSC의 새로운 신진 대사 변조기의 식별을위한 간단한 스크리닝 방법을 허용합니다.

measurement-mitochondrial-mass-membrane-potential-hematopoietic-stem

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체, 미토콘드리아 DNA 관련 단백질 및 미토콘드리아 외막 단백질에 대한 항체로 신경 세포를 라벨링한 후 유세포 분석을 통해 그 수준을 정량화하는 방법을 보여줍니다.

유세포분석을 사용한 뉴런의 다중 미토콘드리아 파라미터 측정

여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역

여기, 선물이 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 세포의 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜.

Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

이 문서에서는 미토 콘 드리 아 또는 살아있는 세포에서는 리소좀을 계량 하는 강력한 방법을 보여 줍니다. 표면 표식에 놓여있는지 활용 된 항 체와 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료의 조합 사용 하 여 조직 샘플에서 수확 하는 1 차 셀 같은 혼합된 세포 인구에 이러한 세포의 부 량 수 다 색 cytometry입니다.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

대사 적응은 분화, 지속성 및 세포 독성을 지시하기 때문에 T 세포의 기본입니다. 여기서, 생체외 사이토카인-분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡을 모니터링하기 위한 최적화된 프로토콜이 제시된다.

사이토카인 분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡의 실시간 모니터링

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

면역 세포에서 생리학적으로 관련된 기질 농도 하에서 미토콘드리아 생체 에너지학을 연구하는 방법은 제한적입니다. 당사는 고분해능 폐활량 측정법을 사용하여 인간 T 세포, 단핵구 및 말초 단핵 세포의 에너지 수요에 대한 미토콘드리아 막 전위의 반응 변화를 평가하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

인간 면역 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 동적 변화를 평가하기 위한 고분해능 폐활량 측정법

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

학습하세요 유세포측정을 이용한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량과 막 전위 측정 방법을. TMRM 염색과 니코틴아미드 리보사이드 처리를 통해 대사 적합성을 평가하고 골수이식 및 콜로니형성 분석과 결합할 수 있습니다.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

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