Name: 고분해능 X선 흡수 분광법을 이용한 극저온에서의 종분화를 위한 생물학적 시료 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 학습하세요 고분해능 X선 흡수 분광법을 위한 생물학적 극저온 시료 준비 방법을. 전립선암과 난소암 세포를 사용하여 화학적 무결성을 보존하고 실험 재현성을 향상시키는 표준화된 프로토콜을 익히세요.

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우리는 CEMHTI (Orleans, France, ANR-13-BS08-0012-01) 및 Labex OSUG@2020 (Grenoble, France, ANR-10-LABX-0056)의 빔 라인 개발에 재정적 기여에 감사드립니다. FAME-UHD 프로젝트는 프랑스 "그랜드 엠프런트"EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG 컨소시엄 및 INSU CNRS 연구소가 재정적으로 지원합니다. 우리는 실험 중 특히 BM30B 및 BM16에서 일하는 모든 사람들에게 모든 기여에 감사드립니다. 저자들은 싱크로트론 방사선 빔타임의 제공을 위해 유럽 싱크로트론 방사선 시설을 인정한다. 우리는 또한 재정 지원을위한 PHYTOMET ANR 프로젝트 (ANR-16-CE01-0008) 및 재정 지원을위한 SEDMAC 프로젝트 (INCA-Plan cancer-ASC16019CS)를 인정합니다.

<ol><li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104(2012).</li>
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<li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAME%3A+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental%2C+material+and+biological+interests%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+Scripta%22%5BJournal%5D)">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li>
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<li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+of+XAFS%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Mineralogy+%26+Geochemistry%22%5BJournal%5D)">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li>
<li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+%28XANES%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Mineralogy+%26+Geochemistry%22%5BJournal%5D)">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li>
<li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Atomic+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li>
<li>Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019).</li>
<li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li>
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저자는 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 X선 흡수 분광법에 의해 생물학적 샘플에서 셀레늄과 철의 화학적 형태를 연구하는데 사용되었다. 생물학적 샘플 및 참조 화합물의 냉동 준비 및 저장뿐만 아니라 HERFD-XAS 측정에 중점을 둡니다.
Cryo-preparation and storage 벌크 생물학적 샘플 펠릿의 동결-준비는 샘플에 존재하는 종의 화학적 완전성의 보존을 허용한다. 이는 제제6을 위해 동결건조 또는 공기건조를 사용할 때 종분화 변화가 관찰되었기 때문에 매우 중요하다. 이 프로토콜은 측정을 위해 선택된 빔라인에 헬륨 냉동 스탯이 장착되는 즉시 사용해야 합니다.
참조 화합물의 경우, 산화 상태를 보존하기 위해 산화 환원 민감성 요소를 사용할 때 무산소 분위기에서 작업해야합니다. 그런 다음 철 및 철 기준 화합물에 대해 표시된 바와 같이 스펙트럼 에지 위치의 변화로 ...

필수 또는 독성 요소의 세포 생물 변환에 대한 연구는 높은 감도의 종분화 기술을 필요로하며 종종 화학 종의 변형되기 쉬운 샘플 준비 단계를 최소화해야합니다.
셀레늄 및 철과 같은 생리 원소는 복잡한 화학, 셀레늄 또는 철 종의 다양한 안정성, ppm (mg / kg) 또는 심지어 ppm 이하 범위의 낮은 농도로 인해 지정하기가 특히 어려운 것으로 알려져 있습니다. 따라서 XAS에 의한 이러한 요소의 종분화에 대한 연구는 매우 어려울 수 있습니다. 싱크로트론 XAS 및 특히 매우 낮은 신호 대 배경 비율1을 허용하는 고에너지 분해능 형광 검출 XAS (HERFD-XAS)는 싱크로트론 소스에서 복잡한 생물학적 매트릭스 2,3에서 고도로 희석된 원소를 지정하기 위해 사용할 수 있다. 기존의 형광-XAS 측정은 유럽 싱크로트론 방사 시설(ESRF)4의 CRG-FAME 빔라인에서 에너지 대역폭이 150–250eV에 달하는 에너지 분해 고체 상태 검출기(SSD)를 사용하여 수행할 수 있으며, HERFD-XAS 측정에는 ESRF2의 CRG-FAME-UHD 빔라인에서 에너지 대역폭이 ~1–3eV인 크리스탈 분석기 분광계(CAS)가 필요합니다. . 형광 광자는 각각 전자 또는 광학 공정으로 에너지에 대해 차별됩니다.
샘플 냉동 준비는 구조를 보존하고 조성 화학적 완전성을 유지하는 데 필수적이며, 따라서 생물학적 자연 상태에 가까운 분석을 허용합니다5. 또한 액체 헬륨 극저온 냉각(LN2)을 사용하여 최저 10K의 극저온에서 수행된 분석을 통해 방사선 손상이 느려지고 XAS의 원소 종분화를 보존할 수 있습니다. 생물학적 샘플에 적용된 XAS 기술에 대한 일부 리뷰가 극저온 조건에서 샘플을 준비하고 분석 할 필요성을보고하지만 (예 : Sarret et al.6, Porcaro et al.7), 이들 중 어느 것도 관련 세부 프로토콜을 명확하게 설명하지 않습니다. 이 간행물에서, 암 세포 및 플랑크톤 미생물의 냉동-제조 방법이 극저온에서Se8 및Fe9 의 HERFD-XAS 종분화에 대해 기술되어 있다.
최첨단 XAS 분광법 측정 중 샘플 준비 및 환경에 대한 좋은 관행은 1) 설정이 필요합니다. 2) 방사선 손상의 영향을 가능한 한 제한하는 분석 절차; 및 3) X선 광자 빔 크기에 대하여 가능한 한 균질한 샘플(또는 모델 화합물 참조)을 포함한다. 첫 번째 항목은 액체 헬륨 냉동 스탯을 사용하여 저온에서 수집을 수행하여 고려됩니다. 두 번째 항목은 빔에 대해 이동함으로써 샘플의 새로운 영역에서 각 획득을 수행함으로써 처리됩니다. 마지막으로, 세 번째 조건을 고려하여, 샘플(펠릿) 및 참조(분말)는 가능한 한 다공성 및 불균질성을 제한하고, X선 프로브된 샘플 표면 상의 빔 크기에 대하여 거칠기를 피하기 위해 가압된 벌크 펠릿으로 조절된다. 우리는 프로토콜이 이러한 모든 점을 어떻게 처리하는지 설명합니다.
우리는 인간 전립선 세포주 PC-3 (높은 전이성 전위)와 난소 세포주 OVCAR-3 (모든 난소 암 사례의 최대 70 %를 차지함)을 사용하여 셀레늄 나노 입자 (Se-NPs)의 암세포에 대한 항 증식 특성을 조사하고 Phaeodactylum tricornutum diatom을 모델 종으로 사용하여 식물성 플랑크톤의 철 격리를 조사했습니다.

<table><tbody><tr><td>질산암모늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3795</td><td>NH4NO3, 2.66 mg/L의 milliQ 물</td></tr><tr><td>혐기성 챔버</td><td>Coy Laboratory, 미국</td><td></td><td>혐기성 모니터(CAM-12)를 갖춘</td></tr> <tr><td>항생제 재고</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166, 스트렙토마이신 황산염용 S9137</td><td>milliQ 물 1mL/L(암피실린 나트륨 및 스트렙토마이신 황산염, 100mg/mL)</td></tr><tr><td>질화붕소 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255475</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 챔버</td><td></td><td></td><td>Neubauer 또는 Malassez</td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td>칼슘, 마그네슘, 페놀 제외</td></tr>, <tr><td>Red Eppendorf 튜브</td><td></td><td></td><td>0.5 mL 및 1.5 mL</td></tr><tr><td>Falcon 튜브</td><td></td><td></td><td>15 mL 및 50 mL</td></tr><tr><td>구연산철 Fe / 구연산염 = 1/20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3388</td><td>수용액 FeCl3 50 mM 및 Na-citrate 1M pH 6.5</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>GIBCO</td><td>A31604-02</td><td>Performance Plus, 인증 된 One Shot 형식, 미국 원산지</td></tr><tr><td>플라스크</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503</td><td>TPP 150 cm2 영역</td></tr><tr><td>성장 챔버</td><td>Sanyo</td><td>Sanyo MLR-352</td><td>20 &deg에서 ; C 및 12:12 라이트 (3,000lux) 다크 체제</td></tr><tr><td>HEPES 버퍼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>1 g / L의 milliQ 물 HEPES</td></tr><tr><td>고급 serous, OVCAR-3</td><td>ATCC, Rockville, MD</td><td>HTB-161</td><td>보관 온도 : 액체 질소 증기 온도</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td>37 °C에서 인큐베이터; C,</td></tr><tr><td>소 췌장에서 5% CO2 인슐린 용액으로</td> 가습된 분위기 <td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td>25mM HEPES의 10mg/mL 인슐린, pH 8.2, BioReagent, 멸균 여과, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>수동 유압 프레스</td><td>Specac, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해양 규조류 Phaeodactylum tricornutum</td><td>Roscoff 배양 컬렉션</td><td>RCC69</td><td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td></tr><tr><td>모르폴린프로판설폰산</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3183</td><td>걸레, 250mg/L의 milliQ 물(pH 7.3)</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC-3</td><td>ECCAC, 솔즈베리, 영국</td><td>90112714</td><td>보관 온도: 액체 질소 증기 온도</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4333</td><td>페니실린 10,000 단위 및 10mg 스트렙토마이신/mL로 안정화된 용액, 멸균 여과, BioReagent, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>Pipette-boy</td><td></td><td></td><td>25mL-, 10mL- 및 5mL 멸균 플라스틱 피펫</td></tr><tr><td>플랑크톤 배양 제품, Mf 배지: Sea salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883</td><td>40g/L의 milliQ 물. 구성: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td></tr><tr><td>플라스틱 핀셋</td><td>Oxford Instrument</td><td>AGT 5230</td><td></td></tr><tr><td>RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td><td>GIBCO</td><td>A10491-01</td><td>4.5 g / L D- 포도당, 1.5 g / L 중탄산 나트륨, 110 mg / L (1 mM) 피루브 산 나트륨, 2.388 g / L (10 mM) HEPES 완충액 및 연구 용</td></tr><tr><td>셀레늄 나노 입자 (Se-NP), BSA 코팅, 2 mg / mL</td><td>NANOCS Company, 미국</td><td>Se50-BS-1</td><td>BSA 안정화 Se-NP 용액. 평균 크기는 약 30nm입니다. 4°deg에 저장; C 어둠 속에서 빛으로부터 보호됩니다.</td></tr><tr><td>셀레늄 나노 입자 (Se-NP), 키토산 코팅, 2 mg / mL</td><td>NANOCS Company, 미국</td><td>11. Se50-CS-1</td><td>키토산 안정화 Se-NP 용액. 평균 크기는 약 30nm입니다. 4°deg에 저장; C 어둠 속에서 빛으로부터 보호됩니다.</td></tr><tr><td>메타규산 나트륨 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>71746</td><td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L 밀리큐 물</td></tr> 질<tr><td>산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5022</td><td>NaNO3, 75 mg/L 밀리큐 물</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td>성 <td>시그마-알드리치</td><td>S5011</td><td>NaH2PO4, 15 mg/L 밀리큐 물</td></tr><tr><td>T-75 플라스크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>미량 금속 원료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td><td>1 mL/L의 milliQ 물(MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20 mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution (0.4%)</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>GIBCO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>비타민 스톡</td> 티아민에 대한 <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270, 비오틴에 대한 B4639, B12에 대한 V6629</td><td>milliQ 물 1 mL / L (티아민 HCl 20 mg / L, 비오틴 1 mg / L, B12 1 mg / L)</td></tr> <tr><td>수조 37 &deg; 씨</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

고분해능 x선 흡수 분광법을 이용한 극저온에서의 종분화를 위한 생물학적 시료 준비

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

X 선 흡수 분광법 (XAS)을 가진 원소에 대한 연구는 생물학적 시스템에서 금속의 역할을 연구 할 때 특히 중요합니다. 샘플 준비는 특히 생물학적 샘플의 경우 중요하고 종종 복잡한 절차입니다. X선 종분화 기술이 널리 사용되고 있지만, 이 기술의 사용자를 위한 상세한 프로토콜은 아직 보급되지 않았다. 또한, 화학적 상태 변형이 우려되며, 냉동 기반 기술은 세포 또는 조직의 화학적 완전성의 최대 보존을 제공하기 위해 그들의 거의 자연적인 수화 상태에서 생물학적 샘플을 분석하는 것이 좋습니다. 여기에서, 우리는 냉동 보존 샘플에 기초한 세포 준비 프로토콜을 제안한다. 그것은 암세포에서 셀레늄에 대한 높은 에너지 분해능 형광 검출 X 선 흡수 분광법 연구와 식물성 플랑크톤의 철분 연구에서 입증되었습니다. 이 프로토콜은 조사에 의해 손상될 수 있는 다른 생물학적 샘플 및 다른 X선 기술과 함께 사용될 수 있다.

이 제제의 주요 목적은 셀레늄 나노 입자 (Se-NPs)와 암세포 간의 상호 작용, 그리고 식물성 플랑크톤에서의 철 결합 및 격리를 조사하는 것이 었습니다.
초기 상태(BSA Se-NPs) 및 영양 배지에서 배양된 세포(BSA Se-NPs)에서의 셀레늄의 HERFD-XANES 스펙트럼(24시간 배양 후 BSA Se-NPs)은 도 10에 나타내었다. 결과는 초기 Se-NPs의 셀레늄이 Se(0)와 셀레나이트-유사 형태로 모두 존재하는 반면, PC-3 세포와의 상호작용 후 세포의 셀레늄은 주로 Se(0)으로 존재하여 세포에서 셀레늄 종의 변화를 입증하였다. 철의 경우, 참조의 HERFD-XANES 스펙트럼은 철 산화 상태에 따라 뚜렷한 엣지 위치를 보였으며, 감소된 철 종은 낮은 에너지 값으로 이동했습니다(그림 11). 규조류 펠릿의 동일...

이 프로토콜은 싱크로트론 기반 X선 흡수 분광법 실험을 위한 생물학적 냉동 샘플을 준비하기 위한 상세한 절차를 제시합니다. 우리는 암 및 식물성 플랑크톤 세포를 사용한 프로토콜의 예를 통해 샘플 준비 및 냉동 보존을 최적화하는 데 필요한 모든 단계를 설명합니다. 이 방법은 샘플 냉동 준비의 보편적 인 표준을 제공합니다.

고분해능 X선 흡수 분광법을 이용한 극저온에서의 종분화를 위한 생물학적 시료 준비

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

이 프로토콜은 세포 표본에 대해 표준화되어 서로 다른 싱크로트론 위치에서 실행되는 실험을 비교할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 샘플의 화학적 통합을 빠르고 안정적으로 보존 할 수있는 간단하고 간단한 워크 플로우입니다. 이 기술을 처음 접하는 개인은 동결 된 반복 된 세포 펠릿 화 및 냉동 샘플 순서로의 세포 펠릿의 빠른 로딩으로 어려움을 겪을 수 있습니다.극저온에서 샘플을 정확하고 신속하게 분리하는 것이 중요합니다. 따라서 시각적 데모는 기술을 수행하는 방법을 이해하는 데 필수적입니다. 셀레늄 종분화를 위한 인간 전립선 및 난소암 세포주 세포 펠릿을 제조하기 위해, 각 세포주에서 적절한 수의 세포를 층류 후드의 적절한 세포 배양 배지에 있는 조건당 세 개의 T-75 플라스크에 시드하고 플라스크를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 세포 배양 배양기에 넣고 세포가 80%컨플루언트될 때까지 배양한다.암세포를 셀레늄 처리에 노출시키기 위해, 먼저 새로 제조된 나노입자 원액을 실온에서 30분 동안 초음파 처리한 후 완전한 세포 배양 배지에서 셀레늄 나노입자 용액을 적절한 작동 농도로 연속적으로 희석한다. 층류 후드에서 세척 당 섭씨 37도 PBS 5 밀리리터로 세포를 두 번 부드럽게 씻고 멸균 된 25 밀리리터 피펫을 사용하여 관심있는 셀레늄 처리 15 밀리리터를 플라스크 바닥에 조심스럽게 첨가하십시오. 플라스크를 완전히 밀봉하지 않고 뚜껑을 닫고 플라스크를 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 수평으로 놓습니다.배양 배지를 세척하고 보충한 후 세포 펠릿을 제조하려면 플라스크 당 하나의 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 분리한다. 배지를 사용하여 플라스크에 붙어있는 모든 세포를 상청액 내로 플러시하고 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집한다. 펠렛을 세척 당 튜브 당 다섯 밀리리터의 PBS로 두 번 세척하여 처리의 나머지 흔적을 모두 제거하고 세포를 PBS의 한 밀리리터에 재현탁시킨다.세포를 1.5 밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 다른 원심분리로 세포를 수집한다. 그런 다음 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 모든 상층액을 부드럽게 제거하고 각 1.5 밀리리터 튜브의 바닥 부분을 액체 질소로 급락시켜 세포 펠릿 수준으로 떨어 뜨립니다. 동결 직후, 튜브를 액체 질소 탈전으로 옮겨 장기간 보관하십시오.고해상도 x선 흡수 분광법의 경우, 원하는 형광선 에너지에 대하여 브래그 조건에서 결정 분석기 분광계

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

극저온 전자 현미경은 스캐닝 (SEM) 또는 전송 (TEM) 중 하나는, 널리 높은 수분 함량 1 생체 시료 또는 기타 자료의 특성에 사용됩니다. SEM / 집중 이온 빔 (FIB)는 샘플에 대한 관심의 기능을 식별하고 극저온 TEM에 전송을위한 얇은 전자 투명한 얇은 판을 추출하는 데 사용됩니다.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

여기에 제시된 것은 싱크로트론 극저온 X선 나노프로브를 사용한 X선 형광 이미징 이전에 실리콘 질화물 멤브레인 및 플런지 동결에 대한 세포 배양 프로토콜이다. 실온 나노 분석만 이 제공되면, 동결된 시료는 더욱 동결건조될 수 있다. 이들은 세포내 원소 조성물에 대한 정보를 얻기 위한 중요한 단계이다.

싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 실리콘 질화물 멤브레인의 세포 배양 및 저온 준비

여기에 제시된 것은 동결된 시료를 동적 핵 편광(DNP) 매직 앵글 방적(MAS) 핵자기 공명(NMR) 프로브로 전송하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜에는 실험 전의 로터 저장 방향과 실험 전후의 생존 가능성 측정을 위한 방향이 포함됩니다.

셀룰러 생존력을 보존하는 마법의 각도 회전 핵 자기 공명 분광기에 극저온 샘플 로딩

여기서, 25 nm 하프 피치의 해상도로 전체 냉동 보존된 세포의 초구조를 이미지화하기 위해 냉동 소프트 X선 단층촬영(SXT)에 필요한 샘플 준비 및 데이터 수집 단계를 기술하는 프로토콜이 제시된다.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

우리는쌀(Oryza sativa L.)을 모형 종으로 사용하여 습지 환경에서 온전한 뿌리와 주변 의체 토양을 시료, 보존 및 섹션화하는 프로토콜을 설명합니다. 일단 보존되면, 시료는 싱크로트론 X선 형광(XRF) 화학적 분석 영상과 같은 원소 이미징 기술을 사용하여 분석될 수 있다.

원소 이미징을 위한 습지 뿌리와 류스피어를 보존하는 방법

이 프로토콜은 극저온 구조조명 현미경을 사용하여 생물학적 냉동 보존 샘플을 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 U2OS 세포의 세포 골격을 화상 진찰하여 방법론을 보여줍니다.

극저온 보존 된 세포에서 극저온 구조 조명 현미경 데이터 수집

여기서, 우리는 다이아몬드 광원에서 빔 라인 I23에 진공 엔드 스테이션으로 결정의 극저온 샘플 준비 및 전송을위한 프로토콜을 제시, 긴 파장 대식차 X 선 결정학 실험.

다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

이 백서는 Cryo-EM 실험을 위한 플런지 동결 전에 70°C의 높은 온도에서 샘플 그리드를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Cryo-EM용 고온 시료 그리드 준비

이 방법은 in situ 세포 cryotomography 및 correlative light and electron microscopy(CLEM)를 위한 전자 현미경(EM) 그리드 준비를 위한 접근 가능하고 유연한 프로토콜을 제공합니다.

포유류 세포의 In Situ Cryotomography를 위한 시료 전처리

이 프로토콜은 시료 전처리 최적화를 통해 불균일한 입자 분포를 해결하기 위한 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)를 예로 사용하는 실용적인 방법을 제시하며, 연구자가 극저온 전자 현미경(cryo-EM)을 사용하여 고분자 구조를 효율적으로 규명할 수 있는 참고 자료를 제공합니다.

극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

학습하세요 고분해능 X선 흡수 분광법을 위한 생물학적 극저온 시료 준비 방법을. 전립선암과 난소암 세포를 사용하여 화학적 무결성을 보존하고 실험 재현성을 향상시키는 표준화된 프로토콜을 익히세요.

고분해능 X선 흡수 분광법을 이용한 극저온에서의 종분화를 위한 생물학적 시료 준비

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