고분해능 X선 흡수 분광법을 이용한 극저온에서의 종분화를 위한 생물학적 시료 준비

이 프로토콜은 세포 표본에 대해 표준화되어 서로 다른 싱크로트론 위치에서 실행되는 실험을 비교할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 샘플의 화학적 통합을 빠르고 안정적으로 보존 할 수있는 간단하고 간단한 워크 플로우입니다. 이 기술을 처음 접하는 개인은 동결 된 반복 된 세포 펠릿 화 및 냉동 샘플 순서로의 세포 펠릿의 빠른 로딩으로 어려움을 겪을 수 있습니다.

극저온에서 샘플을 정확하고 신속하게 분리하는 것이 중요합니다. 따라서 시각적 데모는 기술을 수행하는 방법을 이해하는 데 필수적입니다. 셀레늄 종분화를 위한 인간 전립선 및 난소암 세포주 세포 펠릿을 제조하기 위해, 각 세포주에서 적절한 수의 세포를 층류 후드의 적절한 세포 배양 배지에 있는 조건당 세 개의 T-75 플라스크에 시드하고 플라스크를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 세포 배양 배양기에 넣고 세포가 80%컨플루언트될 때까지 배양한다.

암세포를 셀레늄 처리에 노출시키기 위해, 먼저 새로 제조된 나노입자 원액을 실온에서 30분 동안 초음파 처리한 후 완전한 세포 배양 배지에서 셀레늄 나노입자 용액을 적절한 작동 농도로 연속적으로 희석한다. 층류 후드에서 세척 당 섭씨 37도 PBS 5 밀리리터로 세포를 두 번 부드럽게 씻고 멸균 된 25 밀리리터 피펫을 사용하여 관심있는 셀레늄 처리 15 밀리리터를 플라스크 바닥에 조심스럽게 첨가하십시오. 플라스크를 완전히 밀봉하지 않고 뚜껑을 닫고 플라스크를 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 수평으로 놓습니다.

배양 배지를 세척하고 보충한 후 세포 펠릿을 제조하려면 플라스크 당 하나의 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 분리한다. 배지를 사용하여 플라스크에 붙어있는 모든 세포를 상청액 내로 플러시하고 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집한다. 펠렛을 세척 당 튜브 당 다섯 밀리리터의 PBS로 두 번 세척하여 처리의 나머지 흔적을 모두 제거하고 세포를 PBS의 한 밀리리터에 재현탁시킨다.

세포를 1.5 밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 다른 원심분리로 세포를 수집한다. 그런 다음 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 모든 상층액을 부드럽게 제거하고 각 1.5 밀리리터 튜브의 바닥 부분을 액체 질소로 급락시켜 세포 펠릿 수준으로 떨어 뜨립니다. 동결 직후, 튜브를 액체 질소 탈전으로 옮겨 장기간 보관하십시오.

고해상도 x선 흡수 분광법의 경우, 원하는 형광선 에너지에 대하여 브래그 조건에서 결정 분석기 분광계의 모든 결정을 최적화하고 흡수 에지의 에너지 위치가 입사 단색 빔 에너지를 교정하는 것으로 알려진 기준을 사용합니다. 샘플 홀더를 생물학적 샘플용 액체 헬륨 냉동 상태로 옮기고 냉동 장치를 켈빈도 10도로 설정한 다음, 싱크로트론 안전 규칙에 따라 실험 허치를 닫고 분석을 시작합니다. 여기서, 영양배지로 배양된 셀레늄의 대표적인 고분해능 x선 흡수분광분석 스펙트럼은 초기 셀레늄 나노입자 내의 셀레늄이 셀레늄제로 그리고 셀룰라이트 유사 형태로 모두 존재하였음을 입증한다.

그러나 PC3 세포와의 상호 작용 후, 셀레늄은 주로 셀레늄 제로로 세포에 존재하여 세포 내 셀레늄 종의 변화를 보여주었습니다. 철의 경우, 고해상도 x선 흡수 분광법 기준 스펙트럼은 철 산화 상태에 따라 뚜렷한 엣지 위치를 나타내며, 감소된 철 종은 낮은 에너지 값으로 이동한다. 규조류 펠릿의 동일한 위치에 수집된 두 개의 연속적인 스펙트럼은 유사하였으며, 이는 10 켈빈에서 헬륨 cryostat를 사용할 때 두 번의 획득 사이에 빔 손상이 제한되었음을 나타낸다.

또한, 규조 펠릿의 상이한 위치로부터의 스펙트럼은 동일하여, 샘플 펠릿이 균질하고 스펙트럼이 더 나은 신호 대 잡음비 스펙트럼을 얻기 위해 평균화될 수 있음을 입증하였다. 가장 중요한 단계는 나노 입자 팽창의 준비, 극저온에서의 펠릿 처리 및 표준 참조 샘플의 준비입니다. 이 절차는 다른 벌크 분석 기술, 예컨대 ICP-MS 또는 HPLC-ICP-MS 또는 극저온에서 형태로 수행될 수 있는 다른 비싱크로트론 분광학적 기술에 적용될 수 있다.

다른 과학적 질문은이 절차를 사용하여 탐구 할 수 있으며, 특히 생물 지질학, 생화학, 환경 과학 또는 독성학 연구 분야에서 탐구 할 수 있습니다. 셀레늄 화합물과 셀레늄 나노 입자는 건강에 어려움을 겪을 수 있으며 장갑, 안경 및 안면 마스크를 사용하여 전용 화학 후드에서 조작해야합니다.