Name: 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 학습하세요 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용한 뉴라이트 아웃그로스 분석 및 소분자 화합물의 신경독성 평가 방법을. 이 프로토콜은 신경약리학 연구와 약물 발굴 스크리닝에 높은 임상적 전환 가능성을 제공합니다.

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이 연구는 NIMAD 연구 보조금에 의해 투자되었다 (940714) MAF에 수여.

<ol><li>Sherman, S. P., Bang, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+compounds+that+modulate+neurite+growth+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).</li>
<li>Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of axon regeneration.</a> Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).</li>
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<li>Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+enhances+NGF-induced+neurite+elongation+which+is+not+mediated+by+Hsp25+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells.</a> Brain Research. 1221, 14-23 (2008).</li>
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<li>Grandjean, P., Landrigan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobehavioural+effects+of+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurobehavioural effects of developmental toxicity.</a> The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).</li>
<li>Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+screening%3A+extracting+meaning+from+complex+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-based screening: extracting meaning from complex data.</a> Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).</li>
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<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li>
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<li>Ryan, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+as+a+high-throughput+screen+for+developmental+neurotoxicity+or+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).</li>
<li>Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomics+profiling+of+Alzheimer%27s+disease+reveal+neurovascular+defects%2C+altered+amyloid-%CE%B2+homeostasis%2C+and+deregulated+expression+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).</li>
<li>Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+primary+human+and+rodent+embryonic+neural+progenitor+cells+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuronal+Cell+Culture%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons.</a> Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).</li>
<li>Gil-Perotín, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+from+the+subventricular+zone%3A+a+review+of+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay.</a> The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).</li>
<li>Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating%2C+expanding%2C+and+infecting+human+and+rodent+fetal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2(2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676(2012).</li>
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<li>Bagheri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC+Inhibitors+Induce+BDNF+Expression+and+Promote+Neurite+Outgrowth+in+Human+Neural+Progenitor+Cells-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109(2019).</li>
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<li>Conde, C., Cáceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly%2C+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319(2009).</li>
<li>Schmitz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+neuronal+morphology%2C+synapse+number+and+synaptic+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).</li>
<li>Grandjean, P., Landrigan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+of+industrial+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity of industrial chemicals.</a> The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).</li>
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<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li>
<li>Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+phenotyping+of+cell+lines+and+primary+cells+to+assess+preservation+of+cell+type-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).</li>
<li>Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+profiling+of+primary+versus+immortalized+human+RPE+cells+identifies+expression+patterns+associated+with+cytoskeletal+remodeling+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival.</a> Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).</li>
<li>Yeo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neural+Lineages+as+In+Vitro+Models+for+Screening+the+Neuroprotective+Properties+of+Lignosus+rhinocerus+%28Cooke%29+Ryvarden%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden.</a> BioMed Research International. 2019, (2019).</li>
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모든 저자는 잠재적인 이해 상충이 없음을 나타냅니다.

이 프로토콜은 시험 화합물을 가진 처리시 neurite 길이에 대한 시험을 설명하는 몇몇 간행된 논문 의 한개입니다. 또한, 우리는 중성자 아웃 성장 분석 및 신경 독성 평가에 hNPC를 사용하는 방법을 설명합니다. hNPC 유래 뉴런에 대한 이러한 중성기 내성장 분석 및 신경 독성 평가를 활용하여 후생유전학 소분자 화합물, HDAC 억제제의 범주의 신경성 잠재력을 유동적으로 유도하여22개의신경질적 성장을 유도하는 것으로 입증된다. 더욱이, Sartor 등.al.에 의해 제시된 또 다른 논문에서, 이 프로토콜은 여러 후생유전학 수정자화합물(23)으로처리되는 시히스톤 단백질인 H4K5ac의 형광 강도를 정량화하는 데 사용된다.
인지 기능은 신경 회로 내에서 적절한 배선 및 기능적 연결에 의존합니다. 현상 전형 검열 접근으로 신경 형태학의 각종 양상의 상세하고 일관된 정량화는 신경 발달에서 정신 장...

중성성장은 뉴런 네트워크 형성과 신경재생1,,2의형성에 근본적인 과정이다. 부상 후, neurite 아웃 성장 신경계의 재생에 중요 한 역할을 한다. Neurite 아웃성장은 또한 신경 퇴행성 질환 및 신경 손상에 대한 결과를 향상시키기 위해 신경 재생 활동을 유도하는 세포 외 신호의 중요한 요소입니다3,,4,,5,,6.
다양한 신경 계보를 생성하는 데 있어 분화 잠재력을 유지함으로써, 인간 신경 전구 세포(hNpC)는 중추 신경계(CNS) 기능 및 개발7,,8,,9의연구를 위한 모델 시스템을 제공할 수 있다. 1 차인간 세포 모델로 hNPC의 높은 번역 잠재력 및 생리적 관련성은 neurite 아웃성장 관련 약물 발견 선별에서 상당한 이점을 제공합니다. 그러나, 고처리량 에 대한 1차 세포 모델의 유지 보수 및 스케일링은 시간이 많이 소요되고 노동 집약적인10,,11,,12,,13일수 있다.
중성기 외성장 연구에서 제시된 방법의 적용 외에도, 신경 독성 평가는 hNPC 유래 뉴런을 이용한 또 다른 응용이다. 검사되지 않거나 제대로 이해되지 않는 신경 독성 잠재력을 가진 수천 개의 상업적인 화학 화합물이 있습니다. 따라서, 보다 안정적이고 효과적인 스크리닝 실험은 개발 신경 독성을 유도하는 그들의 잠재력에 기초하여 화합물을 평가, 구별 및 순위를 매기는 데 큰 수요가14이다. 환경에서 테스트되지 않은 화합물의 풍부와 함께 신경 장애의 보급 및 발생률이 증가함에 따라 신경 독성을 유발할 수 있는 위험한 환경 화합물을 식별하기 위해 보다 신뢰할 수 있고 효율적인 실험이필요합니다(15)
본 명세서에서 제시된 방법은 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용하여 중성기 의 성장과 신경 독성을 유도하는 화합물의 능력을 선별하는 데 활용될 수 있으며, 이는 인간 생물학을 밀접하게 대표하는 세포 모델이다.

<table><tbody><tr><td>4웰 유리 챔버 슬라이드</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균성</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta;-Tubulin III</td><td>Thermo</td><td>MA1-118X</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td></td><td></td>17504001</tr><tr><td>B27 - 비타민 A 마이너</td>스 <td>Thermo</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning</td><td>432000</td><td>세포 동결 용기 표준화 된 제어 속도 보장 -1&#176; C/분 세포 동결 -80&#176; C freezer</td></tr>, <tr><td>CryoStor CS10</td>, <td>StemCell Technologies</td><td>7930</td>, <td>10% DMSO 함유 동결 보존 배지</td></tr>, <tr><td>DAPI</td><td>, Thermo</td><td>D1306</td><td></td></tr>, <tr><td>DMEM/F12</td>, <td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td>, <td>Sigma</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr>, <tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG6015</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Thermo</td><td>FB002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanyl-L-glutamine 보충제</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Thermo</td><td>50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Calbiochem</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma</td><td>A92902-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5854</td><td>인간 배아 및 유도 만능 줄기세포</td>N2 Gibco</tr><tr><td></td><td></td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>의 동결 보존을 위해 설계된 무혈청 동결 보존 배지NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-Well 폴리스티렌 화이트 마이크로플레이트</td><td>Thermo</td><td>164610</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소를 함유한 세포 분해 시약</td></tr><tr><td>Synaptophysin</td><td>Thermo</td><td>MA5-14532</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가는 본원에 제시된 방법을 사용하여 수행될 수 있는 2개의 주요 연구이다. 이 프로토콜은 뉴라이트 길이 및 시냅스 단백질 국소화에 대한 수정의 정량적 측정과 함께 뉴런 형태학의 신뢰할 수있는 분석을 제공하고 작은 분자 화합물로 치료시 풍부합니다. 중성염 외성장 연구에서 제시된 방법의 적용 외에도, 신경 독성 평가는 잠재적인 발달 신경 독성 효과에 기초하여 상업적 화학 화합물을 평가, 구별 및 순위를 매기기 위해 수행될 수 있다.
세포주신경과학의 화합물 스크리닝 에세이에서 요즘 널리 사용되고 있지만, 종종 조직 기원과 는 유전적으로 다르습니다. 반면에 1차 세포는 생체 내에서 관찰되는 중요한 마커와 기능을 유지한다. 따라서, 이러한 세포가 중성자 성장 분석및 신경 독성 평가를 제공할 수 있는 번역 잠재력 및 생리적 관련성으로 인해 인간 신경 전구 세포(hNpC)를 1차 인간 세포 모델로 사용하여 상당히 유익할 수 있다.
본 명세서에서 제시된 방법은 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용하여 중성기 의 성장과 신경 독성을 유도하는 화합물의 능력을 선별하는 데 활용될 수 있다, 인간 생물학을 밀접하게 대표하는 세포 모델."

원고에 제시 된 프로토콜은 성공적으로 두 개의 최근에 출판 된논문22에서사용되었습니다 22,,23. 도 3은 중성염 아웃성장과 소분자 화합물의 후속 신경유발능력에 대한 마커로서 중성염의 연장에 대한 후성유전학적 화합물로서 HDAC 억제제의 효과를 검사하는 hNpC 유래 뉴런의 사용을 입증한다.
더욱이, 도 4에서 시험된 화합물(HDAC 억제제)의 신경독성은 또한 384웰 플레이트에서 hNpC를 동시에 분화하여 평가되며, 제시된 세포 모델(hNpC)의 잠재력을 나타내고, 더 많은 수의 화합물에 대한 신경 독성을 테스트하기 위해 확장할 수 있는 능력을 보여준다.
Sartor 외.(도5)에...

제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

작은 분자 화합물의 인간 생물학 및 신경 독성 평가와 매우 관련이 있는 neurite 아웃growth 분석기를 기술하는 제시된 프로토콜. 1차 인간 세포 모델로서 인간 신경 전구 세포의 높은 번역 잠재력 및 생리적 관련성은 중성염 아웃성장 관련 약물 발견 선별 및 신경 독성 평가에서 상당한 이점을 제공한다. 제시된 프로토콜을 활용하여, 인간 유도만능 줄기 세포 및 인간 배아 줄기 세포 유래 뉴런은 또한 중성자 내성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 대체 세포 공급원으로 사용될 수 있다.부동 신경구로 미디어를 수집하고 50 밀리리터 원추형 튜브로 전송하는 것으로 시작합니다. 3 분 동안 300 ~ 400 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 그런 다음 신중하게 슈퍼 나티를 흡인.해동된 세포 해리 시약의 500 마이크로리터에서 구를 다시 중단한다. 5~15분 동안 37도에서 구체를 배양합니다. 그런 다음 미리 데운 배양 배지의 5~10밀리리터를 추가하고 신경구를 퇴적시키기 위해 5분 동안 300~400배 g의 원심분리기를 추가합니다.슈퍼나티를 흡인하고 신경구가 단일 세포 현탁액을 형성할 때까지 1000 마이크로리터 파이펫으로 위아래로 파이프를 하는 문화 매체의 2밀리리터를 추가합니다. 세포를 계산한 후, 배양 매체의 10 밀리리터에서 T25 플라스크에 2~300만 개의 세포를 추가합니다. 3일마다 문화 미디어의 절반을 교체하십시오.시판되는 냉동 보존 매체를 사용하여 세포를 동결하십시오. 신경구를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 구체가 바닥에 정착할 수 있도록 합니다. 200 또는 1000 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 큰 신경구를 새로운 50 밀리리터 튜브로 전달한 후 통과하십시오.3 분 동안 300 ~ 400 배 g에서 나머지 신경 구체를 원심 분리하고 조심스럽게 상체를 제거합니다. 냉동 보존 시약의 1 밀리리터에 천 구까지 다시 중단하고 냉동 튜브로 전송합니다. 하룻밤 동안 튜브를 영하 80도에서 보관한 다음 장기 보관을 위해 액체 질소로 이동합니다.신경 성장을 측정하려면 피지에서 이미지를 열고 분석, 도구 및 ROI 관리자를 선택합니다. 도구 막대 직선의 다섯 번째 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 Freehand 선으로 전환합니다. 선택적으로 동일한 아이콘을 두 번 클릭하여 줄 너비를 10으로 변경합니다.그런 다음 세포 체 근처에서 시작하여 팁으로 확장되는 가장 긴 중성염을 추적합니다. 제어 및 T를

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 소설 프로토콜 및 시약 높은 컨텐츠 분석을 사용하여 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 화합물과 치료의 neurotoxic 효과 민감한 측정을위한 설정에 대해 설명합니다. 결과는 높은 컨텐츠 분석 neurotoxicity 평가에 대한 흥미 진진한 소설 기술을 대표하는 것을 보여줍니다.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

이 비디오 프로토콜 유동세포계측법 기술을 사용하여 물리적 (크기 및 내부 단위) 및 형광 특성을 바탕으로 신경 줄기 세포의 재생 소스 (NSCs)에서의 연결 전구 세포의 생성과 이후의 정화를위한 소설 방법을 보여줍니다.

Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

이 비디오는 현미경 분석을 통해 신경 전구체 세포의 이동 반응을 연구하기 위한 체외 분석인 신경 전구체 세포 신경구 이동 분석을 보여줍니다.

NPC Neurosphere Assay: 신경권에서 신경 전구 세포의 이동 반응을 평가하기 위한 In Vitro Assay

이 비디오에서는 hNPC 유래 뉴런의 생존 가능성에 대한 신경돌기 성장 촉진 소분자 화합물의 신경독성을 평가하는 발광 기반 방법에 대해 설명합니다. 이 분석은 세포 생존율의 지표인 세포 내 ATP 수준을 측정하여 테스트 화합물 처리 후 신경 독성을 평가합니다.

뉴런에 대한 테스트 화합물의 신경독성을 평가하기 위한 발광 기반 분석

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

신경생물학에서는 인간 뉴런에서 생체 내에서 일어나는 일에 대한 번역 모델 역할을 하는 신뢰할 수 있고 복제 가능한 체외 시스템을 보유하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포를 in vitro 응용 프로그램에 사용할 수 있는 생존 가능한 뉴런으로 배양하고 분화하는 방법을 설명합니다.

SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포 라인의 차별화

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

이 보고에서는, 우리는 EGFP 및 관심있는 단백질과 공동 으로 transfecting에 의해 배아 쥐 피질 뉴런에 있는 neurite outgrowth를 공부하기 위한 간단한 프로토콜을 기술합니다.

1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석

학습하세요 인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 이용한 뉴라이트 아웃그로스 분석 및 소분자 화합물의 신경독성 평가 방법을. 이 프로토콜은 신경약리학 연구와 약물 발굴 스크리닝에 높은 임상적 전환 가능성을 제공합니다.

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

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