Name: 1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 배우세요 1차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성된 α-시뉴클레인 피브릴을 이용한 단백질 축적 연구 방법입니다. 자동화 이미징과 CellProfiler 분석을 통해 중간에서 고처리량 선별이 가능합니다.

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켈빈 루크 교수님, 신경세포를 확립하고 배양한 콘중 정 교수, 면역염색세포를 이미징하기 위한 헬싱키 생명공학연구소의 광현미경검사부에 감사드립니다. 이 작품은 비즈니스 핀란드 (핀란드 혁신기금 기관), 핀란드 #309489 아카데미, #293392, #319195 3i-재생의 보조금에 의해 지원되었다; 시그리드 주셀리우스 재단, 그리고 약리학의 Maj 연구소의 법정 기금, PAS, 폴란드.

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pS129-αsyn이 주요 성분인 Lewy 병리학을 확산시키는 것은 PD의 조직병리학적 특징입니다. 그러나, pS129-αsyn 집계도 도파민 뉴런의 죽음에 기여하는 방법의 기계적인 이해는 아직도 확립되어야 합니다. 이식된 태아 뉴런에서 pS129-αsyn 양성 포함의 관찰뿐만 아니라 질병의 다른 단계에서 환자로부터 뇌 샘플에 대한 인간 사후 연구에서 증거는 세포16,,17,33사이의 Lewy 병리학의확산을강력하게 시사한다. 따라서, pS129-αsyn의 프리온형 확산은 최근 α-시뉴클레인 PFFs9,,10을사용하여 회수되었다. 특히 도파민 뉴런에서 pS129-αsyn 확산 및 축적의 견고하고 비용 효율적이며 상대적으로 높은 또는 중간 처리량 모델을 확립하면 이 과정을 수정하는 새로운 치료법 및 화합물에 대한 검색 속도가 상당히 빨라질 수 있습니다.
도파민 뉴런의 손실은 PD에서 운동 증상의 주요 원인이기 때문에 이러한 세포는 많은 고유 한특성을가지고2,34,,35,도파민 뉴런에서 pS129-αsyn의 프리온 같은 확산의 모델링은 번역 관점에서 모델의 가장 관련성이 유형이다. 배아 중뇌 뉴런의 마이크로 섬 배양을 활용하는 프로토콜은 4개의 웰 플레이트및 반자동 정량화에 대해 이전에18개에설명되었다. 여기에 설명 된 프로토콜은 96 개의 우물 판에 적응하고 마이크로 섬의 덜 힘든 준비를 제공하므로 숙련 된 연구원이 한 근무 일 동안 각각 60 개의 우물을 포함하는 최대 4 개의 플레이트를 준비할 수 있습니다. 96 웰 플레이트에서 도파민 뉴런을 배양하면 더 적은 양으로 약물을 테스트할 수 있으며 렌티바이러스 벡터로 높은 트랜스듀션 속도를 가능하게 합니다. 또한 더 복잡한 실험을 수행하기 위해 다른 치료법을 결합할 수도 있습니다.
어떤 처리를 적용하기 전에 (PFF를 포함하여), 배양의 질은 밝은 필드 현미경 검사법으로 확인되어야 합니다. 현미경 시스템이 가열된 CO2 챔버를 활용하지 않는 경우, 1차 마우스 도파민 뉴런이 섬세하고 쉽게 스트레스를 받고 있기 때문에 세포는 몇 분 이상 인큐베이터 외부에 보관해서는 안 된다. 같은 이유로, 첫 번째 이미징은 24 h의 잠복식 후에 수행되어야한다는 것이 좋습니다 (DIV1-DIV3 사이). 세포는 현재 세포 체와 동질적으로 마이크로 섬 내부에 확산 살아 있는 것으로 나타납니다. 1 차적인 뉴런은 PO 코팅 된 땅에 정착하고 신경 투영을 확립하기 시작했을 것입니다. 트리튜션 공정이 제대로 이루어지지 않거나 도금 밀도가 권장보다 높으면 형성될 수 있는 작은 덩어리(즉, 150-200 μm 보다 작은 직경)를 관찰할 수 있다. 이 작은 덩어리는 잘 및 / 또는 더 크지 않는 한 실험에 영향을 미치지 않을 것입니다. 응집 세포는 이미지 분석 중에 면역 히스토케미컬 마커 및 개별 세포를 식별하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. 신중한 코팅, 삼중화 및 도금 밀도 를 제어하여 이러한 덩어리를 피하는 것이 필수적입니다. 이러한 조건의 균일성이 특정 우물에서 관찰할 수 없는 경우, 실험에 이러한 결함이 있는 우물을 포함하지 않는다. 이러한 배제는 모든 치료법을 실행하기 전에 수행해야합니다.
또한 96개의 웰 플레이트를 사용하면 스테인링 절차 와 자동 플레이트 현미경으로 직접 시각화하는 동안 편리한 멀티채널 파이펫 사용을 가능하게 하며, 처리량을 더욱 증가시합니다. 고콘텐츠 이미징 플랫폼의 데이터를 분석하는 데 는 자동화된 이미지 정량화의 활용이 필수적입니다. 각 실험에서 얻은 수천 개의 이미지를 처리하는 기능 외에도 모든 치료 그룹의 편견없고 동일한 정량화를 보장합니다. 이미지 분석을 위해 제안된 워크플로우는 도파민 뉴런을 분할하고, 감독된 기계 학습에 의해 올바르게 분할된 세포를 필터링하고, 표현형(pS129-αsyn 양성 및 pS129-αsyn 음성)의 정량화, 감독된 기계 학습에 의해 다시 정량화하는 간단한 원리를 기반으로 합니다. 비록이 작업에 대 한 몇 가지 다른 접근 을 구상 할 수 있습니다., 우리는 높은 도금 밀도도 도파민 문화에 대 한 가장 강력한 기계 학습세분화의 조합을 발견 했다, 도파민 뉴런의 다양 한 모양, 그리고 강하게 스테인드 neurites의 존재. 제안된 이미지 분석 알고리즘은 CellProfiler 및 CellProfiler 분석가, 오픈 소스, 자유롭게 사용할 수 있는 고함량 이미지 분석소프트웨어(26,27)에서27구현되었다. 이 알고리즘은 오픈 소스(예: ImageJ/FIJI, KNIME) 또는 독점 적인 다른 이미지 분석 소프트웨어로 구현될 수도 있습니다. 그러나 우리의 경험에서 이러한 종종 사용 편의를 위해 사용자 지정 기능을 희생, 따라서 복잡 한 분석에서 잘 수행 하지 않을 수 있습니다. CellProfiler 및 CellProfiler 분석가 소프트웨어 패키지는 구현된 알고리즘의 상당수, 워크플로우 설계에 대한 극도의 유연성, 고콘텐츠 이미징 데이터의 동시에 처리 및 효율적으로 처리함으로써 특히 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 것으로 나타났습니다.
상기 기재된 프로토콜은 또한 다른 신경 집단(예를 들어, DAT, GAD67, 5-HT 등)과 단백질 응집체(예를 들어, 인포타우, 유비퀴틴)의 마커와 같은 다른 항체를 가진 면역스테인링을 특징으로 하는 다른 세포 표현형의 정량화를 위해 적응될 수 있었다. 다중 형광 마커는 또한 다중 표현형을 구별하기 위하여 결합될 수 있었습니다 (예를 들면, 성숙의 다른 단계에서 포함되는 세포). 다중 표현형의 자동화된 분류는 또한 측정 단계에 추가 마커의 면역 형광 이미지를 포함하는 채널을 추가하고 세포를 여러 쓰레기통으로 분류함으로써 설명된 이미지 분석 파이프라인에서 구현하기 쉬워야 합니다. 동시에 여러 마커의 활용은 면역 염색 및 이미징 조건의 최적화를 필요로 한다. 또한 면역 형광 이미징의 더 나은 품질을 위해 형광 현미경을 위해 명시적으로 설계된 특수 검은 벽 96 웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 이들은 우리의 프로토콜에 기술된 분석을 위해 충분한 표준 세포 배양 판 보다는 상당히 더 비쌀 수 있습니다.
활용된 PFF의 유형과 품질은 실험 결과에 매우 중요합니다. PFF는 분석의 견고성과 결과의 해석에 영향을 줄 수 있습니다. 준비 조건은 PFFs의 파종 효율에 영향을 미칠 수 있으며, 실제로, 다른 생리적 특성을 가진 PFF "균주"가36보고되었습니다. 그럼에도 불구하고, PfF의 준비 및 검증은이 문서의 범위를 넘어 여러 간행물(11,,28,,29,,30)에설명되었습니다. 제제 프로토콜 이외에, PFFs(예를 들어, 마우스, 인간)에서 α-synuclein의 기원종 및 야생 형 또는 돌연변이 단백질의 사용(예를 들어, 인간 A53T α-synuclein)은 특정 실험 조건에 따라 고려되어야 한다. PFF에 의한 pS129-αsyn 축적의 유도는 배양연령(즉, 체외에서일)에 의존하는 것으로 나타났으며, 더 성숙한 배양은 더 뚜렷한유도(11)를나타냈다. 이것은 아마 더 성숙한 배양에 있는 신경 연결의 증가한 수 때문이고, 증가한 α-synuclein 단백질 수준. 우리의 손에, DIV8에서 PFFs와 치료는 가장 강력한 결과 준, 도파민 뉴런 소마에 pS129-αsyn의 뚜렷한 축적, 신경 생존을 손상 하지 않는 동안. 설명된 프로토콜은 PS129-αsyn 양성 포함을 비교적 초기 시점에서 정량화하기 때문에, PFF를 접종한 후 7일 후에 내인성 α-synuclein의 응집으로 이어지는 초기 이벤트를 수정하는 치료에 적합합니다. 이 시점에서, 내혈 포함은 세포의 상당한 분수에 존재하고 PFF 유도 세포 사멸이 관찰되지 않는 동안 면역 염색에 의해 쉽게 구별 될 수있다, 결과의 해석을 단순화. 중요한 것은, PFF 유도 포함의 형태 및 조성물이시간이지남에 따라 변경될 수 있기때문에,13,기재된 프로토콜은 원칙적으로, 나중에 고정 및 면역스테인팅에 의해 보다 성숙한 포함을 연구하도록 수정될 수 있다. 그러나, 보다 더 이상 문화에 도파민 뉴런을 유지 15 일 극단적인 치료를 필요로, PFF 접종에서 독립적으로 살아남지 못하는 세포 때문에 추가 변화를 유도할 수 있습니다. 추가적으로, 더 확장된 문화는 약 처리 일정을 복잡하게 합니다. 많은 화합물은 세포 배양 배지의 안정성을 제한하거나 제대로 특성화하지 않으며, 약물의 보충은 중간의 완전한 교환이 도파민 배양의 생존을 손상시키기 때문에 사소한 것이 아니다.
Ser129에서 α-synuclein의 인산화는 Α-synuclein 집계의 PFF 기반 모델에서 일관되게 보고되고 티오플라빈 S, 유비퀴틴 또는 형태 특이적 항체11,,12와같은 오접및 응집의 마커와 공존한다. 우리 손에는 pS129-αsyn용 면역 염색은 가장 낮은 배경을 가진 가장 강력한 신호를 제공하며 분석하기가 가장 간단하여 여러 치료법을 선별할 때 강력한 결과를 제공합니다. 중요한 것은, pS129-αsyn 항체를 가진 면역 염색은 세포 외부에 남아 있는 PFF를 검출하지 않으며, 배경을 현저하게 감소시킵니다. 그러나, Ser129 인산화는 아마 α-synuclein의 잘못 접기와 연결된 초기 프로세스 중 하나이며 특정 조건하에서 다르게 조절될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, pS129-αsyn에 긍정적인 영향을 보이는 모든 사실 인정은 다른 마커에 의해 확인되어야 한다.
통계 분석은 실험 설계에 따라 조정되어야 합니다. 적어도 3개의 독립적인 생물학 복제에서 실험을 수행하는 것이 필수적입니다 (즉, 별도의 1차 신경 배양). 이러한 복제는 다른 플레이트에 도금되고 독립적으로 처리되어야 합니다. 우리는 다른 실험 판에 대한 데이터의 페어링을 고려하기 위해 무작위 블록 디자인 ANOVA37과 다른 플레이트에 복제에서 얻은 데이터를 분석합니다.

파킨슨병(PD)은 지하 니그라(SN)에서 중뇌 도파민 뉴런의 사망, 기저신경질에서 도파민 톤의 후속 손실, 그리고 그에 따른 운동 장애1,,2를특징으로 하는 신경퇴행성 질환이다. PD 환자의 두뇌에 있는 중요한 조직 병리학 특징은 Lewy 바디 (LB)에게 불린 신경 세포 내 단백질/지질 집계, 또는 신경질에서, Lewy neurites (LN), 통칭Lewy병리학으로알려져 있습니다 3. 두뇌에 있는 Lewy 병리학은 신경 연결을 통해 병원성 요인의 퍼짐을 닮은 전진 PD와 함께 진행하는 것처럼 보입니다. 풍부한 Lewy 병리학은 신경 변성 4에 의해 영향을 받는 그밖 지역에 있는 SN및 세포에 있는 도파민 뉴런에서 찾아낸다4. 그러나, 질병 진행 도중, 단백질 집계의 퍼짐 및 개시는 항상 신경 죽음과 상관관계가 있지 않으며 신경 죽음에 Lewy 병리학의 정확한 기여는 아직도불분명5.
LB 와 LN은 membranous 및 단백질 성분3로구성된 것으로 나타났다. 전자는 막 파편, 혈관 구조 (아마도 리소좀 및 자가식) 및 미토콘드리아3입니다. 후자는 적어도 300 가지 다른 단백질6로구성됩니다. Spillantini외. 7에 의한 특징적인 연구 결과는 Lewy 병리학의 주요 단백질 성분이 α-synuclein이다는 것을 보여주었습니다. 뉴런에서 발현되고, 막 융합 및 신경전달물질 방출과 연계되고, 루이 병리학에서 α-synuclein은 대부분 잘못 접혀, 아밀로이드 피브릴 형태로 존재하며, 그 중 대부분은 Ser129(pS129-αsyn)4,,8에서인광된다.
중요한 것은, 또한 프리온과 같은 특성으로 인해 잘못 접힌 α-synuclein이 루이 병리학 형성4에서원인 역할을 할 수 있음을 입증하였다. 잘못 접힌 α-synuclein의 프리온 유사 특성은 환자로부터 중뇌 추출물과 외인성으로 제조된 α-synuclein 전형성 피브릴(PFF)으로 모두 배양 및 생체 내99,10의뉴런뉴클레인 골재를 유도하였다. PFF는 도파민 뉴런에서 α-synuclein 병리학의 진행을 연구하는 신뢰할 수 있고 강력한 모델을 제시합니다. PFF는 배양 된 1 차적인 뉴런에 적용되거나 동물 뇌에 주입될 때, 그들은 루이 병리학에서 볼 수있는 많은 특징을 재구성하는 신경질과 세포 소마(11)에 α-synuclein 함유 포함 포함의 형성으로 이어집니다. 관찰된 포함은 트리톤 X에서 세제-용용성, 유비퀴티네이트, 아밀로이드 특이염 티오플라빈 S로 염색되고, Ser12911,,12에서α-synuclein hyperphosphorylated를 함유한다. 중요한 것은, 이들 포함은 α-시뉴클레인 녹아웃동물(11)에서형성되지 않으며, 내인성 α-synuclein에 대한 형성의 의존성을 나타낸다.
그럼에도 불구하고, 인간 LB와 LN이 매우 이질적인3이기때문에 PD 환자에서 발견되는 PFF 유도 된 포함 및 Lewy 병리학을 직접 비교하기가 어렵습니다. Lewy 병리학의 관찰된 이질성은 형성의 다른 단계, 상이한 해부학적 위치, 또는 잘못된 접힌 α-synuclein의 형성의 차이에 의해 집합 프로세스를 개시하기 때문에 발생할 수 있습니다. 동일한 요인이 PFF 유도 pS129-αsyn 양성 포함에 영향을 미칠 수 있습니다. 실제로, 최근에는 1차 신경배양에서 PFF 유도 pS129-αsyn 양성 포함이 장기간 잠복기12,13후에LB를 밀접하게 닮은 구조로 성숙할 수 있는 병리학의 초기 단계를나타낸다는것이 입증되었다.
Lewy 병리학 확산이 초기 단계 질병 마커 중 하나로 간주되기 때문에 PFF를 가진 잘못 접힌 α-synuclein의 조기 확산 및 축적을 모델링하는 것은 약물 개발에 유용합니다. 따라서, 집계 예방 치료는 매우 초기 단계에서 PD의 진행을 중단하거나 늦추기 위해 유망할 수 있다. α-시뉴클레인 축적을 늦추거나 중지하기 위한 여러 임상 시험이 진행 중14회진행 중이다. 후기 환자의 경우, 도파민 뉴런 전구의 이식은 더 나은 치료 대안이 될 수 있다15. 그러나, Lewy 병리학은 PD 참을성 있는 두뇌의 사후 분석 도중 이식된 배아 뉴런에서 문서화되었다16,,17,또한 α-synuclein 축적에 대하여 보호를 위한 필요를 나타내는.
시험관에서, α-synuclein PFFs는 설치류 1차 해마 또는 피질 뉴런에서 불멸의 세포주에서 응집을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 어느 것도 도파민 뉴런을 다시 수상에 가깝지 않습니다10. 이러한 뉴런을 배양하려면 시험관 내 특정 수의 뉴런도금이 필요하다18. 제한된 물질(예: 1차 도파민 뉴런)으로 높은 도금 밀도를 달성하기 위해 마이크로 섬 배양 방법이 일반적으로 활용된다. 마이크로 섬 배양에서, 세포는 처음에 큰 우물18의중간에 표면 장력에 의해 함께 유지 된 매체 (일반적으로 몇 마이크로 리터)의 작은 방울에서 도금된다. 뉴런이 부착된 후, 세포가 작은 도금 영역에서 고밀도로 갇혀 있는 동안 전체 우물은 배지로 채워져 있습니다. 마이크로 섬은 높은 도금 밀도를 달성하는 것 외에도 세포 밀도와 생존의 변화가 빈번한 우물 가장자리 근처의 도금도 방지합니다. 마이크로 섬은 종종 상대적으로 큰 우물이나 요리에 활용; 그러나, 마이크로 섬에 중간 뇌 신경 배양을 설립 96 잘 플레이트 형식은 중간 - 고처리량 전력을 가진 선의의 도파민 뉴런에서 루이 병리학의 연구를 가능하게. 이러한 뉴런을 가진 체외 실험은 우리가 시험관 내및 생체 내19,,20,,21,22에서 성숙한 도파민 뉴런의 생존을 촉진하고 도파민 뉴런23에서α-synuclein 골체의 형성을 방지하는 신경교 세포 주 유래 신경 영양자 (GDNF)를 발견할 수 있었습니다., 인간 환자 유도 만능 줄기 세포 유래 도파민 뉴런은 인체 기원과 시험관내 의 생존 시간 이상으로 인해 더 정확한 모델을 구성합니다. 그러나, 인간 뉴런에서 α-synuclein 병리학의 유도는 마우스 배아 뉴런에서 1주일, 및/또는 다중 스트레스요인(예를 들어, α-synuclein 과발현 및 PFFs의 조합)에 비해 여러 달 후에 관찰된다24,,25. 또한, 인간의 도파민 뉴런의 유지 보수는 1 차적인 배아 뉴런에 비해 더 비싸고 힘들며, 본질적으로 고처리량 응용 프로그램에서 사용을 제한합니다.
또한, 1차 도파민 뉴런 배양은 유전자 변형(예를 들어, CRISPR/Cas9) 및/또는약리학제제(23)로치료될 수 있다. 그(것)들은 분자 통로 해부 및 약 도서관 검열 같이 응용을 위한 빠르고 재현가능한 플랫폼을 구성합니다. 이러한 배양에서 제한된 물질을 얻을 수 있지만, 여전히 작은 크기의 유전체학 / 프로테오믹스 분석을 수행 할 수 있습니다. 96 개의 잘 포맷에서 1 차적인 뉴런을 배양하는 것은 면역 세포 화학 및 형광 현미경 기술, 고함량 표현형 분석에 선행됩니다. 96개의 웰 플레이트의 자동화된 이미징에서 유래된 다중 스펙트럼 형광 이미지는 정량적 결과(예를 들어, 웰당 LB 함유 뉴런의 수)로 변환될 수 있다. 이러한 분석은 CellProfiler26,,27과같은 무료 소프트웨어로 수행 할 수 있습니다. 전반적으로, 96 개의 웰 플레이트에서 도금 된 1 차 배아 중뇌 배양은 높은 처리량 표현형 스크리닝의 기회와 함께 도파민 뉴런과 α-synuclein 응집을 연구하는 강력하고 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan Blue stain</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>15 ml CELLSTAR 폴리프로필렌 튜브</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>5 M HCl</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>미디어 키친, 헬싱키 대학교 생명 공학 연구소</td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki</td></tr><tr><td>96-well ViewPlate (Black)</td><td>PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>6005182</td><td></td></tr><tr><td>99.5% 에탄올(EtOH)</td><td>Altia Oyj, Rajam&auml; ki, Finland</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AquaSil</td><td>Siliconizing Fluid Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>TS-42799</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 1.5 ml 마이크로 원심분리기</td><td>튜브 해당</td><td>없음</td><td>미디어 주방, 생명공학 연구소, 헬싱키</td></tr><tr><td>대학교 바이오 럽터 초음파 처리 장치</td><td>Diagenode, Liege, Belgium</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+, Mg2+ 프리 행크' s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 및 CellAnalyst 소프트웨어 패키지</td><td>해당 없음</td><td></td><td>무료 오픈 소스 소프트웨어</td></tr><tr><td>Centrifuge 5702</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td>5702000019</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>계수 챔버</td><td>BioRad Inc., Hercules, California, USA</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision 초고해상도 현미경(에어 테이블 및 캐비닛 포함</td>) <td>GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA</td><td>29254706</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease-I (Dnase I)</td><td>Roche, Basel, Switzerland</td><td>22098700</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri,</td><td>USA G8769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>21331&ndash; 020</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 AlexaFluor 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 AlexaFluor 647</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 양 AlexaFluor 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's buffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, 월섬, 매사추세츠, 미국</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar</td><td>fisher scientific, Thermo Scientific, 월섬, 매사추세츠, 미국</td><td>11507582</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Nano Automated Imaging System</td><td>Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 산호세</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>25030&ndash; 032</td><td></td></tr><tr><td>마우스 단클론 항티로신 하이드록실라제</td><td>Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, 독일</td><td>MAB318</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>17502&ndash; 048</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum</td><td>Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 분말, 95%</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>pH-Fix, 색상 고정 표시기 스트립</td><td>Macherey-Nagel, D&uuml; ren, Germany</td><td>92110</td><td></td></tr><tr><td>Phospohate Buffer Saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki</td></tr><tr><td>poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, San Diego, California, USA</td><td>Ant-pm-1, ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>토끼 단클론 항 알파-시누클레인 필라멘트</td><td>Abcam, 케임브리지, 영국</td><td>ab209538</td><td></td></tr><tr><td>rabbit monoclonal anti-phospho-serine129-alpha-synuclein</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer</td><td>IKA&reg;-Werke GmbH, Staufen, Germany</td><td>3810000</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF)</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 또는 Prospec, Ness-Ziona, Israel</td><td>450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 알파 시누클레인 사전 성형 원섬유(PFF)</td><td>해당</td><td>없음/A</td><td>공동 연구자, Kelvin C Luk</td></tr><tr><td>교수 연구 실체현미경 시스템</td><td>Olympus Corporation, 도쿄, 일본</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>양 다클론 항티로신 하이드록실라제</td><td>Millipore, Merck KGaA, 다름슈타트, 독일</td><td>ab1542</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 자동화 Cell Counter</td><td>BioRad Inc., Hercules, California, USA</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China</td><td>2199700</td><td></td></tr></tbody></table>

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

이 프로토콜의 목표는 1 차도 파민 뉴런에서 α-synuclein 축적의 견고하고 재현 가능한 모델을 확립하는 것입니다. 면역 염색 및 편견없는 자동화 된 이미지 분석과 결합된 이 모델은 뉴런 배양에서 α-synuclein aggregation에 대한 약물 및 유전 적 조작의 영향을 분석 할 수 있습니다. 1 차적인 중뇌 배양은 선의의 배아 도파민 뉴런의 신뢰할 수있는 소스를 제공합니다. 본 프로토콜에서, 파킨슨병의 특징적 조직병리학, 루이 바디(LB)는, 신경 배양 매체에 직접 α-synuclein 사전 형성된 섬유브릴(PfFs)의 첨가에 의해 모방된다. 도파민 뉴런의 소마에 내인성 인산화 α-synuclein의 축적은 PFF 추가 후 7 일에서 이미 면역 염색에 의해 검출된다. 체외 세포 배양 조건은 또한 작은 분자 약물 및 신경 영양인과 같은 α-synuclein 축적을 방지하는 치료법의 적용 및 평가뿐만 아니라 유전자 조작을 위한 렌즈바이러스 벡터(예: CRISPR/Cas9 포함)에 적합합니다. 96 웰 플레이트에서 뉴런을 배양하여 실험 용 설정의 견고성과 힘을 증가시킵니다. 실험의 끝에서, 세포는 면역 세포 화학 및 형광 현미경 영상에 대한 파라 포름알데히드로 고정된다. 다중 스펙트럼 형광 심은 96 웰 플레이트의 자동화 된 현미경 검사를 통해 얻어진다. 이러한 데이터는 편견없는 고함량 표현형 분석을 위한 플랫폼을 제공하는 무료 소프트웨어를 사용하여 (예를 들어, 인계 α-synuclein 함유 도파민 뉴런의 수를 잘 계산)을 정량화한다. 1차 도파민 뉴런에서 인포이성 α-synuclein 축적의 PFF 유도 모델링은 고처리량 약물 스크리닝 및 세포 표현형 분석을 위한 기회와 함께 α-synuclein 포함의 형성 및 제거를 중재하는 기본 메커니즘을 연구하는 신뢰할 수 있는 도구를 제공한다.

도금 후 며칠 후 (DIV1-DIV3), 밝은 필드 현미경 검사법은 개별 우물에서 이러한 조건의 건강과 균질 확산을 평가하기 위해 수행되었다(그림 3). 배양 된 중뇌 세포는 도금 전에 생성 된 마이크로 섬 내에서 균질하게 퍼졌다(도3A,B). 1차 뉴런은 코팅된 땅에 균질하게 정착하고 확립된 뉴런 프로젝션(도3B)을확립하였다. 작은 덩어리의 세포(직경150 μm보다 작은 직경)가 우물에서 관찰되고 예를들어(도 3C)으로나타났다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61118/61118fig03.jpg"> 그림 3: 도금 후 며칠 후 (예를 들어, DIV3), 1 차적인 중뇌 배양의 상태는 밝은 필드 현미경으로 관찰되었습니다. (A)배양된 세포는 PO 코팅 된 마이크로 섬 내에서 우물의 중간에 걸쳐 퍼져 있으며 약 1mm 의 우물 둘레에서 PO를 긁적으로써 생성 된 4.4 mm (흰색 화살표로 표시됨). (B)배양 된 1 차신경은 지역 내에서 균질하게 퍼지고 뉴런 프로젝션 (빨간 화살촉으로 표시)이 관찰되었다. (C)직경이 150μm보다 작은 세포 덩어리는 파란색 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61118/61118fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1차 마우스 중뇌 배양은 항체 및 항-pS129-αsyn 항체로 면역염색되었고 15일 후에 자동 현미경으로 생체외에서 심상화되었다. 코팅 된 마이크로 섬은 우물의 중간에 세포의 부착을위한 제한된 영역을 제공(도 4A,B). TH 마커로 표기된 도파민 뉴런은 덩어리없이 서로 분리된 단층으로 마이크로 섬 주위에 퍼졌다(도4A'및 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg bigfig" src="/files/ftp_upload/61118/61118fig4v2.jpg"> 그림 4: DIV15에서, 800-1,000 도파민 세포는 PFF 처리의 유무에 관계없이 각 마이크로 섬에서 정량화되었다. 항TH 및 항-pS129-αsyn 항체로 접종된 배아 중뇌 배양의 대표적인 이미지. (A, A', A') PFF 처리 없이 세포를 제어합니다. (B, B', B') pS129-αsyn 내재를 가진 PFF 처리된 세포. (C)50 ng/mL GDNF를 가진 차량(control), PFF 또는 PFF로 처리된 우물에서 TH 양성 셀 수의 정량화. (D)50 ng/mL GDNF를 가진 차량(control), PFF 또는 PFF로 처리된 TH 양성 세포에서 pS129-αsyn 골재의 정량화. 통계적 유의성은 무작위 블록 설계 ANOVA로 계산되었다. **p &amp; 0.01, n = 4 개의 개별 플레이트 (생물학적 복제), 치료 그룹 당 3-6 우물 (기술적 반복). 스케일 바 = A, B용300 μm; A용50 μm, B'; A', B'에대한 B’’25 μm . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61118/61118fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
PFF 처리가 없는 배양물에는 pS129-αsyn 신호(도4A'및 4A')가없었지만, α-synuclein PfFs로 처리된 배양은 pS129-αsynsyn 양성 포함(도Figure 4A4B') 및’ 4B')를개발하였다.Figure 4B 시험관 내 PFF 치료는 7일 동안 다른 실험군(도4C)에비해 TH 양성 뉴런의 수에 현저한 감소를 일으키지 않았다. PFF 처리 배양은 pS129-αsyn 양성 TH 양성 도파민 뉴런의 ~40%의 인구를 가졌다. 양성 대조군, GDNF를 통한 치료는 pS129-αsyn 양성 포함을 가진 TH 양성 도파민 뉴런의 비율을 감소시켰습니다(도4D, 보충 파일내의원시 데이터 및 예제 이미지 참조).
보충 파일: CellProfiler 및 CellAnalyst 소프트웨어 패키지, 예제 이미지 및 그림 4E, F용원시 데이터를 사용하여 고함량 이미지 분석을 위한 예제 파이프라인을 예로 들 수 있습니다. (1~9)Example_Images. ImageJ 또는 CellProfiler로 이러한 이미지를 엽니다. (10)Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs. (11)TH_LB_V1.cpipe (단계 6.2-6.8),(12)TH_LB_V2.cpipe (단계 6.11-6.18) <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61118/Supplementary_Files.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

이 프로토콜은 이 축적을 조절할 수 있는 메커니즘과 치료를 연구하기 위한 1차 도파민 뉴런에 알파 시뉴클레인 축적의 견고하고 재현 가능한 모델을 제공합니다. 사전 형성된 알파-시뉴클레인 피브릴은 자동화된 이미징 및 편견없는 이미지 분석과 결합된 점진적이고 재현가능한 단백질 축적을 유도하며, 이 프로토콜은 알파 시뉴클레인 축적 억제 트럭의 비교적 빠르고 중간에서 높은 처리량 스크리닝을 용이하게 합니다. 진보적인 알파-synuclein 축적 파 킨 슨 병 및 특정 핵 체에서 신경 기능을 손상 하는 요인 중 하나가 될 수 있습니다.그 같은 축적을 막는 새로운 분자는 신경 변성을 위한 새로운 치료가 될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 도파민 뉴런에 있는 알파-synuclein 축적을 조절하는 분자 기계장치를 연구하기 위한 표준적이고 믿을 수 있는 공구를 설치하기 위한 중요한 단계이다는 것을 믿습니다. 절차를 시연하는 것은 줄리아 코노발로바, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다.1차 배아 중뇌 세포 배양을 설정하기 전에, 도파민의 마이크로리터 50마이크로리터, 뉴런 배지, 폴리-L-Ornithine 코팅 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 100 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 매질의 바닥을 순환 방향으로 동시에 긁으면서 각 우물의 바닥을 순환 방향으로 긁어내고 각각의 둘레에서 코팅을 제거합니다. 폴리 L-오르니틴 코팅 섬은 각 우물의 중간에 남아있을 것입니다. 각 코팅 된 섬의 중간에 10 마이크로 리터를 추가하여 마이크로 섬을 만듭니다.마우스 배아의 날 13.5 마우스 배아에서 1 차적인 배아 중뇌 배양을 설정합니다. 수확한 모든 중뇌 바닥을 동일한 1.5 밀리리터 튜브로 풀을 짜고, 세척당 500마이크로리터의 칼슘과 마그네슘 프리 HBSS로 샘플을 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 HBSS를 섭씨 37도에서 30분 동안 0.5%의 트립신으로 대체합니다.인큐베이션의 끝에 는 부분적으로 소화된 조직에 FBS 용액에 새로 준비된 DNase I의 500 마이크로리터를 추가하고 소화된 조직에 불을 닦은 팁이 있는 실리콘 유리 파이펫을 사용하여 조직을 세타게 합니다. 작은 입자만 관찰될 때, 이러한 조직 단편이 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 정착하고 이 상신을 빈 15 밀리리터 원추형 폴리프로필렌 튜브로 옮길 수 있게 한다. FBS에 DNase I를 포함하는 튜브에 HBSS 1 밀리리터를 추가하고 파이펫팅하여 여러 번 혼합합니다.이 용액의 1밀리리터를 나머지 조직 입자에 옮기고 샘플을 다시 세리하게 합니다. 그런 다음 HBSS 퇴적물에서 남은 DNase I 및 FBS로 남은 DNase I 및 FBS로 한 번 더 조직 샘플을 세티프로 팅한 후 남은 조직 단편을 전달하지 않고 상체관으로 소화된 세포 현탁액을 당기고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 흡습한다. 세척 당 따뜻한 도파민 뉴런 배지의 두 밀리리터에 세포를 두 번 세척.그리고 마이크로 원심분리기 튜브에서 신선한 따뜻한, 중간 농도의 6 개의 마이크로 리터 당 3 배 10에서 세포를 다시 중단합니다. 다음으로 이전에 준비된 각 마이크로 섬에서 배지를 제거하고 10 마이크로리터 파이펫을 사용하기 전에 세포를 부드러운 파이펫팅과 혼합하여 각 마이크로 섬에 6 마이크로리터의 셀을 추가합니다. 모든 세포가 첨가되면 150 마이크로리터의 물 또는 PBS로 플레이트 가장자리의 빈 우물을 채우고 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.인큐베이션의 끝에 100 개의 신선한 도파민 뉴런 배지의 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 라미나르 유동 후드의 세포 배양 8일째에는 각 실험에 3.75 마이크로리터의 100 마이크로그램을 첨가하고 각 실험에 PBS의 마이크로리터가 잘 들어있다. PFS와 함께 작업 할 때 원치 않는 단백질 오염에 대해 신중하고 그 후 후드와 1 % SDS 및 70 %에탄올과 모든 PF 관련 기기를 청소하십시오.관심 있는 마커에 대한 염색 후 적절한 실험 적 엔드 포인트에서 96 개의 웰 배양 판을 10 X 목표가 장착 된 고함량 플레이트 스캐너에 로드합니다. 플레이 타입, 제조사, 크기, 우물 간 거리, 배지의 종류 및 부피와 같은 96웰 플레이트의 사양에 따라 설정을 조정한다. 각 마이크로 섬의 모든 세포를 커버하기 위해 우물의 이미징 영역을 선택하고 DAPI 발현에 자동 초점을 조정하기 위해 잘 하나를 사용합니다.대조군 유정에 얼룩의 강도에 기초하여 각 형광 채널에 대한 획득 시간을 보정하고 세포 소마 내의 인포세린 129 알파 시뉴클레인 골재를 수용하는 전형성 된 섬유 처리 제어 우물의 도파민 세포가 명확하게 인뉴클레오 19 및 포이큐어 의 명확한 정량화를 허용하도록 파라미터를 조정한다. 그런 다음 각 웰에 대해 정확히 동일한 매개 변수를 사용하여 모든 채널에서 선택한 모든 우물을 동시에 이미지화합니다. 이미지 분석을 위해 CellProfiler 분석가를 열고 V2_THpos 선택합니다.속성 파일입니다. 분할된 세포를 인포세린(129) 알파 시뉴클레인 양성 및 음수 세포로 분류하려면 먼저 50개의 무작위 세포로 가져오기 세포의 수를 설정하고 가져오기를 클릭하여 분할된 세포의 이미지를 로드합니다. 적어도 30개의 셀을 창 하단의 해당 저장소로 드래그합니다.50 최대 규칙 또는 무작위 포리스트 분류기와 빠른 부드러운 증폭을 사용하여 선택기차. 50개의 양양성 세포로 가져오기를 설정하고 가져오기를 클릭하여 열차 분류기에 따라 득점된 양성 인인 129 알파 시뉴클레인 세포를 획득하거나 50개의 음세포로 가져오기를 설정하고, 열차 분류자에 따른 네거티브 인(129) 알파 시뉴클레인 세포를 획득하기 위해 가져오기를 클릭한다. 결과가 만족스러울 때, 모두 점수를 클릭하여 인포세린 129 알파 시뉴클레인 의 수와 음의 도파민 뉴런을 각 웰에 요약한 결과 표를 생성한다.균일하게 확산 된 문화를 도금 한 후 며칠 은 도금 전에 생성 된 마이크로 섬 내의 빛 현미경 검사법에 의해 관찰 될 수있다. 1 차적인 뉴런은 코팅 된 플레이트 바닥에 균일하게 정착하고 신경 투영을 확립합니다. 이 이미지에서는 직경이 150 마이크로 미터 미만인 작은 덩어리를 관찰할 수 있다.도금 후 15일 후 신경세포 마커를 가진 대조군 치료되지 않은 1차 마우스 중간뇌 배양의 면역 염색은 플레이트 웰의 중간에 있는 마이크로 섬 내의 세포의 제한된 부착을 드러낸다. 티로신 하이드록실라제 마커로 표기된 도파민 뉴런 면역은 덩어리없이 서로 분리된 단층으로 마이크로 섬 주위를 퍼짐합니다. 알파-시뉴클레인 전형성 피브릴 처리 배양에서, pS129 알파 시뉴클레인 양성 포함도 관찰될 수 있다.7 일 동안 체외 사전 형성 된 섬유를 가진 치료는 다른 실험 그룹에 비해 티로신 하이드록실라제 양성 뉴런 수의 현저한 감소를 일으키지 않는다. 신경교 세포주 유래 신경 영양 인자 그러나 치료, pS129 알파-시뉴클레인 양성 포함의 비율을 감소, 항로신 하이드록실라제 양성 도파민 뉴런을 수용. 마이크로 섬을 만들기 전에 폴리 L 오니틴 코팅 우물이 단단히 세척되어 있는지 확인하십시오.또한 새로운 뇌 문화를 도금 할 때 신선한 미디어를 사용해야합니다. 이 방법은 유전자 편집 및 약리학적 억제제와 결합하여 특정 유전자의 효과와 핵 응집에 대한 생각파를 연구할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 알파 synuclein 축적을 억제 하는 새로운 분자에 대 한 검사이 방법을 사용.TDN의 축적 보호 효과를 입증하고 현재 여러 개의 작은 후보 분자를 분석하고 있다.

studying-pre-formed-fibril-induced-synuclein-accumulation-primary

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

돌연변이된 알파-시누클레인을 과발현하는 도파민성 뉴런을 포함하는 쥐 배아의 일차 중뇌 배양으로 시작합니다.처리 웰의 배지를 테스트 화합물이 포함된 신선한 배지로 교체하고 대조군 웰의 배지를 일반 배지로 교체합니다. 그런 다음 배양하십시오.대조군에서 알파-시누클레인은 도파민성 뉴런에 독성 응집체를 형성하여 신경돌기 수축을 유발하고 신경 세포 사멸을 초래합니다.치료에서 시험 화합물은 알파-시누클레인과 상호 작용하여 응집을 방지하며 신경돌기 구조를 보존하고 신경 보호 기능을 제공합니다.세포를 고정하고 투과시킨 다음 비특이적 결합 부위를 차단합니다.도파민성 뉴런에 대한 추가 라벨링과 함께 모든 뉴런을 표지하기 위해 1차 항체와 함께 배양합니다.세포를 세척하고 1차 항체에 특이적인 형광단 태그가 있는 2차 항체를 추가합니다.도립 형광 현미경을 사용하여 차등적으로 표지된 도파민성 뉴런을 계산한 다음 공초점 현미경으로 전환하여 신경돌기 길이를 측정합니다.대조군에 비해 치료에서 온전한 신경돌기를...

쥐 배아 뉴런에서 알파-시누클레인 독성에 대한 시험 화합물의 신경 보호 효과 평가

이 비디오는 마우스 배아의 중뇌에서 도파민 뉴런을 분리하고 배양하는 과정을 보여줍니다. 고립된 복부 중뇌 바닥은 효소를 사용하여 해리됩니다. 생성된 도파민 뉴런은 수확되어 다중 웰 플레이트 내부의 마이크로 섬으로 전달됩니다. 세포는 마이크로 아일랜드 내부의 고밀도로 세포를 유지하기 위해 도파민 뉴런 배지로 배양됩니다.

1차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런의 분리 및 배양

이 비디오는 알파-시누클레인 미리 형성된 섬유로 전처리된 배아 마우스 도파민 뉴런에서 알파-시누클레인 축적을 정량화하는 과정을 보여줍니다. 면역 형광을 사용하여 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 도파민 뉴런을 고정, 염색 및 정량화하는 단계를 설명합니다.

Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons에서 알파-시누클레인 축적 연구

도파민 뉴런은 뇌에서 중요한 조절 역할을 합니다. 그들의 손실은 파킨슨병과 관련이 있습니다. 이 비디오에서는 배아 마우스 중뇌에서 중심 도파민 뉴런의 1차 배양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 배양은 다양한 스트레스에 대한 이러한 뉴런의 극도의 취약성을 연구하는 데 유용합니다.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

파킨슨병 동안 중뇌 도파민성 뉴런의 퇴화 원인은 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 배양 시스템은 이러한 뉴런의 신경 생리학적 특성을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다. 여기에서는 신경퇴행의 체외 모델링에 활용할 수 있는 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

이 기사의 목표는 단량체 성 알파-sy뉴 클레 인, 후속 품질 관리 및 생체 내에서 미리 형성 된 섬유 소의 사용 으로부터 피 브 릴의 생성에 필요한 단계를 간략하게 설명 하는 것입니다.

모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

여기에서 우리는 시험관 외 Ca에서 측정 하는 프로토콜을 제시2+ 중간 뇌 뉴런에서 플럭스와 1 차 마우스 중간 두뇌 문화를 사용 하 여 caspase-3에 그들의 다운 스트림 효과. 이 모델은 중뇌 뉴런에서 비정상적인 Ca2+ 활동과 관련된 병리학적 변화를 연구하고, 세포세포 항세포 특성에 대한 새로운 치료법을 선별하기 위해 사용될 수 있다.

기본 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 플럭스와 다운스트림 효과를 정량화

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 편리한 중력 공급 관류 방법이 제시된다. 인산화된 α시누클레인의 면역형광 검출은 파킨슨병의 마우스 모델에서 입증된다. 이 연구는 또한 심질 관류, 해부, 조직 동결 / 임베딩 및 냉동 절개 단계를 포괄적으로 설명합니다.

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법

배우세요 1차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성된 α-시뉴클레인 피브릴을 이용한 단백질 축적 연구 방법입니다. 자동화 이미징과 CellProfiler 분석을 통해 중간에서 고처리량 선별이 가능합니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

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