Name: 쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 배우세요 쥐와 마우스에서 경동맥을 통한 신경 줄기 세포 동맥 내 납품 방법을. 이 기술은 뇌졸중 후 허혈성 손상 회복을 위한 세포 치료 가능성을 제시합니다.

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이 연구는 다음과 같은 에 의해 지원되었다: AHA 상 14SDG20480186 LC에 대한, BZ에 대한 산시 대학의 주제 혁신 팀 2019-QN07, 켄터키 척수 및 머리 부상 연구 신뢰 부여 14-12A KES와 LC에 대한.

동물 과목에 대한 모든 절차는 켄터키 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 수술과 관련된 스트레스 나 통증을 최소화하기 위해 적절한 주의를 기울여 복용했습니다.
1. 주사 카테터 및 수술 후크 준비
<ol><li>사출 카테터(도1)를구성한다. MRE010, MRE025 및 MRE050 튜브, 20G, 26 G 및 27 G 주입바늘(그림 2A),600 그루릿 사포, 슈퍼글루 및 2성분 5분 에폭시(5분 에폭시)를 포함한 필수 재료를 수집합니다.<ol>
<li>바늘 허브로부터 1cm에서 20 G 및 26 G 바늘을 자르고 사포에 끝을 연마(도 2B). 바늘을 청소하기 위해 이중 증류수 10mL로 바늘을 씻어 내보라고 합니다. 참고 : 두 가지 디자인(그림 1)이사용됩니다. 설계 1에는 단일 커넥터가 있으며 솔루션 또는 서스펜션을 주입하는 데 사용됩니다. 설계 2에는 NSC 함유 용액의 전체 부피의 전달을 보장하기 위해 세포(20G 바늘)와 죽은 부피(26G 바늘)의 플러시용 20G 및 26 G 루어 잠금 커넥터가 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>설계 1: 길이 3-4cm MRE010 카테터를 15cm 길이 MRE025 카테터에 삽입하고 슈퍼 접착제로 고정합니다.<ol>
<li>MRE025 튜브의 다른 쪽 끝을 MRE050 카테터 세그먼트에 연결하고 슈퍼 접착제로 고정하십시오. MRE050 카테터의 나머지 끝에 둔한 20 G 바늘을 삽입하고 슈퍼 접착제로고정(도 1).</li>
		<li>에폭시 접착제로 연결 부위를 보강합니다. 이 카테터 설계는 시약(화학 적 또는 약물 용액 또는 사이토카인과 같은 다른 생물학적 제제 와 같은) 시약의 주입에 최적입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>설계 2: 길이 3-4cm MRE010 카테터를 15cm 길이 MRE025 카테터에 삽입하고 슈퍼 접착제로 고정합니다.<ol>
<li>MRE025 튜브의 다른 쪽 끝을 MRE050 카테터 세그먼트에 연결하고 슈퍼 접착제로 고정하십시오. 둔한 20 G 바늘을 MRE050 카테터의 나머지 끝에 삽입하고 슈퍼 접착제로 고정하십시오.</li>
		<li>첫 번째 바늘 의 끝 근처에 MRE050 튜브에 둔한 26 G 바늘을 삽입하고 주입 흐름의 방향에 따라 슈퍼 접착제(도 1 및 도 2C)로고정하십시오. 명확한 에폭시(도 2C)와MRE050 튜브의 바늘과 세그먼트를 모두 강화합니다. 이 설계를 통해 NSC 주입 후 바늘 2(26 G)를 통해 차량 용액을 주입하여 카테터의 죽은 부피를 뇌 순환으로 플러시하여 주사 부피의 보다 정밀한 제어를 달성한다.</li>
		<li>NSC 주입에 20G 바늘을 사용하여 NSC의 손상을 최소화하여 생존 가능성에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시공 후 카테터를 10mL의 이중 증류수로 씻어내고 70% 에탄올을 넣은 다음 하룻밤 사이에 70%의 에탄올에 담급니다.</li>
	<li>수술 전에 카테터를 70% 에탄올에서 제거하고 멸균 PBS 10mL로 세척하고 저장 및 운송을 위한 오토클레이브 수술 도구 상자에 넣습니다.</li>
	<li>외과 후크의 준비<ol>
<li>27 G 바늘에서 1.5- 2cm 길이의 바늘 샤프트를 자르고 사포에서 양 끝을 칙칙할 때까지 닦습니다. 그런 다음 작은 혈전 성 클램프를 사용하여 샤프트를 한쪽 끝에 후크로 구부리고 다른 쪽 끝에는 링 셰이프를 구부립니다.</li>
		<li>10-15cm 길이MRE025 카테터를 링을 통해 삽입하고 명확한 수술 용테이프(도 2D)로고정합니다. 동일한 방법을 사용하여 후크 2개 더 만듭니다.</li>
		<li>모든 후크와 카테터 시스템을 70% 에탄올에 담그세요.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 동물 준비 : 배달, 주택, 환경 적응
<ol><li>남성과 여성 C57BL/6 마우스 (10-12 주, n=10/시간 포인트) 및 Wistar 쥐 (10-12 주, n=10) 본 연구에서 사용 되었다.</li>
	<li>환경적으로 통제되는 동물 비바리움에 음식과 물 광고 리비툼을 보관하십시오.</li>
	<li>뇌졸중 수술 1주일 전에 환경에 적응할 수 있습니다. 참고: 마우스 1개와 쥐 1명은 뇌졸중 수술 후 1d로 사망했으며, 중증 마비로 인해 NSC 주사 전에 마우스 1개에서 3d로 안락사되었습니다.</li>
</ol>3. 마우스와 쥐 신경 줄기 세포의 배양 (NSC)
참고: NSC는 설정된프로토콜(20)에따라 격리되고 배양되었습니다.
<ol><li>마우스<ol>
<li>GFP 양성 남성 마우스(B6 ACTb-EGFP)와 결합된 시간 임신 여성 C57BL/6 마우스로부터 E18 배아 피질로부터 야생형(WT) 및 GFP 라벨NSC를 분리한다. GFP (+) 배아를 식별하려면 FITC 채널을 사용하여 형광 현미경으로 수확된 배아를 관찰하십시오. GFP(+) 배아는 녹색 형광 신호를 산출하고 WT 배아는 약한 자동 형광(그림3A)만을 나타내고 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>쥐<ol>
<li>젊은 성인 WT 쥐의 심실 영역 (SVZ)에서 NSC를 분리합니다. 제조업체의 지침21에따라 주입 직전에 DiI로 라벨을 붙입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배양 마우스 또는 쥐 NSC는 신경구로 발전하고, 구체직경이 약 100 μm(그림3B)에도달할 때 이를 통과한다. 3번과 5번 통로 사이에 NSC를 사용하여 주입하십시오.</li>
	<li>배아 줄기 세포 마커패널(도 3C)을사용하여 줄기 세포 특성을 검증한다.</li>
	<li>주사 당일, NSC 구체를 수집하고 세포 분리 용액으로 해리하고, 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS에서 107 세포/mL의 농도로 중단하고, 주입될 때까지 젖은 얼음에 놓습니다.</li>
</ol>4. 외과 적 준비
<ol><li>수술 전, 삽입 길이의 수술 내 참조를 위해 팁에서 9mm (마우스용) 또는 15mm (쥐용)에서 실버 마커 펜으로 상용 MCAO 봉합사에 점을 표시하십시오. 수술 전 수술 도구(가위, 집게) 및 기기를 자동 클랩하고, 가열은 수술 사이에 유리 비드 멸균기에서 소독합니다.</li>
	<li>흡입을 통해 5% 이소플루란을 가진 동물의 마취를 유도하고 1-2%의 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 일반적인 조건 (호흡 패턴, 수염 운동 및 자발적인 신체 보정 자세), 각막 반사 및 발가락 핀치에 대한 반응을 관찰하여 마취의 깊이를 평가합니다.</li>
	<li>동물 용 수핀을 가열 패드에 놓고 베타딘 용액으로 클리핑및 스크러빙을 한 다음 70 % 에탄올을 통해 동물의 수술 부위를 준비합니다. 수술 중 안과 연고(예: 인공 눈물 연고)를 적용하여 동물의 눈을 건조로부터 보호하십시오.</li>
	<li>외과 의사는 박테리아 스크럽으로 손을 철저히 문질러 마스크, 멸균 장갑 및 깨끗한 실험실 코트를 착용하십시오.</li>
</ol>5. 중간 뇌 동맥 폐색 (MCAO) 뇌졸중 수술
참고: 마우스 또는 쥐의 한 반구에서 허혈성 뇌졸중을 유도하는 수술은 봉합사가 내부 경동맥(ICA)에 도입되어 혈류를 가리키는 것과유사하다(도 4)17,,18,,19,,22. 그러나 봉합사 삽입을 위해 선택된 동맥은 후속 줄기 세포 주입에 필요한 사용 가능한 작동 공간에 따라 다릅니다. 쥐는 두 개의 별도 순차적 수술 (뇌졸중 및 NSC 주입)을 허용하는 외부 경동맥 (ECA) 세그먼트에 충분한 공간을 가지고 있지만 마우스는 다른 접근 이 필요합니다. 뇌졸중 유발 대뇌 혈류 변화, 뇌 경색 크기 및 신경 결핍은 저자의 이전 보고서17,,18,,19에서와같이 보고되었다.
<ol><li>허혈성 뇌졸중을 유도하기 위해 자궁 경부 부위에 중간 절개를 하여 마우스 및 쥐 수술을 시작하고 왼쪽 공통 경동맥(CCA), ECA 및ICA(도 4)의분리를 시작한다. CCA 또는 미주 신경을 스트레칭, 변위 또는 짜내지 않도록 주의하십시오. 그 이후에는 동맥 및 외과 적 단계의 선택이 다르기 때문에 마우스와 쥐에 대한 MCAO 수술은 별도로 설명될 것입니다.</li>
	<li>마우스에 MCAO 수술(그림 4A)<ol>
<li>CCA(도4A,1단계) 아래에 3개의 브레이드 6-0 나일론 봉합사를 배치하고, 근위현(도4A,2단계)을 사용하여 가능한 한 멀리 양면으로부터 혈관을 폐포하기 위해 팽팽한 수술 매듭을 만든다. 봉합사 끝을 잘라내면 됩니다.</li>
		<li>CCA의 단층 측에서 슬립노트를 만듭니다 (주의 : 6 단계에서 방출 될 때 과도하게 조여지지 마십시오) 두 개의 긴축 매듭 사이에 하나의 느슨한 슬립 노트(그림 4A,단계 2).</li>
		<li>작은 절개(둘레의 1/4 -1/3)를 미세시저(도4A,3)로 CCA의 근접 매듭에 가깝게 자르고 7-0 고체 나일론 봉합사(도4A,단계 4)로 코팅된 상업용 실리콘 고무를 조심스럽게 삽입한다. 중간 끈으로 이 봉합사를 고정하고, 충분히 조여(도4A,5단계)는 ICA의 백플로에 의해 실리콘 고무 코팅 나일론 필라멘트의 절개및 움직임없음을 보장하면서도 핀셋에 의해 부드러운 푸시로 ECA쪽으로 봉합사의 전진을 허용한다.</li>
		<li>상부(distal) 슬립노트(도4A,6단계)를 해제하고 팁이 9mm에 대한 분기를 통과할 때까지 ICA로 나일론 봉합사를 전진시키세요(봉합사에 실버 마커를 참고로 사용). 상두 슬립노트를 조여 봉합사를 확보하고 혈류를 방지합니다.</li>
		<li>필라멘트 1h후(도 4A,7단계)를 철회하고 중간 매듭을 이용하여 CCA를 리게이트하여 출혈을 방지합니다(도4A,단계 5-7역순, 8단계에서 본 최종 결과). 위 매듭을 놓습니다. 4-0 수술 봉합사로 상처를 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MCAO 쥐에 수술(그림 4B)<ol>
<li>ECA(도4B,1단계)에 따라 6-0 나일론 봉합사 2개를 배치하고 가능한 한 단종에 하나의 타이트한 매듭을 만듭니다(도4B,2단계).</li>
		<li>ICA 및 CCA에 혈관 클립을 배치하여 동맥 혈류를 가리켜놓습니다(도4B,단계 3). 슬립노트는 선박 클립의 대체 항목으로 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>마이크로시저(도4B,3-4)로 ECA에 작은 절개를 하고, 6-0 나일론 필라멘트(도4B,5단계)로 코팅된 상업용 실리콘 고무를 삽입하고 ECA의 슬립노트로 적절하게 고정한다.</li>
		<li>ICA에 혈관 클립을 방출하고, 실버 마커(15mm)가분기(도 4B,6)에 도달할 때까지 ICA로 필라멘트를 진군한 다음 ECA(도4B,6단계)에2nd 매듭으로 봉합사를 고정한다.</li>
		<li>허혈의 1 h 후, 출혈을 방지하기 위해이 필라멘트를 철회하고 절개를 리게이트(도 4B,단계 7), CCA에서 혈관 클립을 제거 (8 단계와 최종 결과), 4-0 수술 봉합사와 상처를 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 복구
<ol><li>뇌졸중 수술 후, 동물을 완전히 의식을 회복 할 때까지 가열 패드에 놓습니다.</li>
	<li>피하 주사를 통해 진통을 제공합니다. 물과 음식 광고 리비도에 액세스 할 수있는 자신의 홈 케이지에 동물을 반환합니다.</li>
</ol>7. 동맥 내 주입
<ol><li>카테터 전체를 70% 에탄올로 씻고, 사용할 때까지 밤새 담가 둡니다. 주입 직전에 바늘의 루어 자물쇠를 멸균 주사기로 연결하고 카테터 시스템의 전체 루멘 면을 멸균 PBS 10mL로 세척합니다.</li>
	<li>NSC 주입을 위한 시간 창 및 준비 참고: 다른 연구 팀의 경험과 보고서에 따르면 NSC 주입 시기는 피험자와 외인성 NSC의 생존에 매우 중요합니다. 우리의 파일럿 연구에서, 초기 시점에서 NSC의 주입 (레퍼퓨전 후 처음 6 시간 내에서) 더 높은 사망률을 주도. 따라서, 뇌졸중 후 2d(48h)에서 3d(72h) 사이의 시간 창을 결정하고, NsC의 인트라파렌키말 분포를 달성하는 데 효율적입니다.<ol>
<li>주사기 펌프 분사 율을 마우스의 경우 20 μL/min, 쥐의 경우 50 μL/min으로 설정합니다. 주사의 과도한 속도 또는 지속 기간은 쥐보다 더 취약한 전신 볼륨 과부하를 초래할 수 있습니다.</li>
		<li>간단히 말해서, 뇌졸중 수술 후 3d에서 이소플루란으로 동물을 마취하고 가열 패드에 척추를 놓습니다.</li>
		<li>자궁 경부 상처를 다시 열고 ECA, ICA 및 CCA를 다시 노출시합니다(그림 5,1 단계). 뇌졸중 수술에서와 같이, 종에 따라 주사 경로를 결정합니다. 마우스내 NSC 주입을 위한 CCA를 활용하고,쥐(23)에대한 ECA를 활용한다.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스에서 CCA를 통한 동맥 내 주입<ol>
<li>CCA 아래에 6-0 브레이드 나일론 봉합사 2개를 놓습니다. 이전 뇌졸중 수술에서 분기 및 하부 매듭 사이에 각각의 느슨한 슬립 노트를 만듭니다(그림 5,2 단계).</li>
		<li>상부 슬립노트를 조인 다음 하부 매듭 위에 작은 절개를한다(그림 5,3단계). 절개를 통해 MRE010 카테터를삽입(도 5,4) 사출 흐름을 차단하지 않고 중간 매듭으로 고정(도5,5). 상부 매듭을 풀어 놓고 카테터 위치를 조정할 때 카테터에서 혈액의 역류를 볼 수 있어야 합니다.</li>
		<li>ECA에 선박 클립을 배치하고, 주사기 펌프로 5 분 동안 20 μL /min에서이 카테터를 통해 1 x 106 GFP-NC를 주입하고 동일한 속도로 PBS의 50-100 μL로 플러시합니다.</li>
		<li>주사 후, 상부 슬립 매듭으로 절개 위에 CCA를 리게이트하고 MRE010 카테터(도 5,단계 6)를 철회한다. 중간 매듭과 상부 매듭을 조이고 다듬습니다. ECA에서 용기 클립을 제거합니다. 그림 5,7단계의 최종 이미지를 참조하십시오.</li>
		<li>4-0 수술 봉합사로 상처를 닫습니다.</li>
		<li>가열 패드와 피하 진통제 주사에 적절한 복구를 제공 한 후, 자신의 홈 케이지에 동물을 반환합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>쥐에서 ECA를 통해 동맥 내 주입<ol>
<li>선박 클립으로 ECA 및 CCA를 일시적으로 폐색합니다(그림5,2단계).</li>
		<li>ECA의 근부 측에서 작은 절개를합니다(도 5,3단계 3), MRE010 카테터를 삽입하고 매듭으로 고정한다(도5,4).</li>
		<li>두 선박 클립을 제거하고, 5 x 106 NSC를 PBS 100 μL/분50 μL/분에서 2분 동안 주입한 다음, 동일한 속도로 50-100 μL(그림5,5단계)의 플러시를 구동식 주사기 펌프를 사용하여 동일한 속도로 주입합니다.</li>
		<li>주입 후, CCA 및 ECA를 다시 혈관 클립으로 폐색하고 주사 카테터의 철수 후 제2 절개 측에서 ECA를 리칭한다(도5,단계 6).</li>
		<li>두 개의 혈관클립(그림 5,7단계)을 제거하고 4-0 수술 봉합사로 상처를 닫습니다.</li>
		<li>가열 패드와 피하 진통제 주사에 적절한 복구를 제공 한 후, 자신의 홈 케이지에 동물을 반환합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직학적 분석<ol>
<li>허혈성 뇌졸중을 받은 쥐와 쥐로부터 뇌를 수집한 후, 안사암 및 심장 내 관류 후 4%의 파라포름알데히드(1d)(마우스 및 쥐), 7d(마우스) 및 30d(마우스)를 주입한 후 뇌를 수집한다. 이들 4개 그룹은 각각 5개의 NSC와 5대의 차량 주입동물로 구성되었다.</li>
		<li>하룻밤 동안 뇌를 고정하고 3 d에 대한 30 % 자당에 냉동 보존.</li>
		<li>뇌를 OCT에 포함시키고, 40 μm 두께로 슬라이스하고, 신경교 피동성 산성 단백질(GFAP, 성상세포), Tuj1(성숙한 뉴런), 더블코르틴(DCX, 미성숙뉴런)을 포함한 세포 특이적 마커로 면역스테인링 한 후 NSC의 분포를 검사합니다. 참고: GFP를 표현하는 쥐 균주가 없기 때문에, 우리는 상대적으로 단기적인 관찰만 허용하는 쥐 NSC에 대해 일시적인 형광 라벨인 DiI를 활용했습니다. 따라서 NSC 분포는 쥐에 뇌졸중 후 1d에서만 검사되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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신경 질환에 대한 줄기 세포 치료는 여전히 초기 탐사 단계에 있습니다. 한 가지 주요 문제는 뇌에 SC 또는 NSC를 충분히 전달하기위한 확립 된 방법이 없다는 것입니다.
외인성 SC/NSC는 정맥(IV), 복막 내(IP) 또는 인트라파렌실/인트레이스렐 브레브렐 주사에 이어 뇌에서 검출될 수 있지만, 각 전달 접근법은 단점이 있다. 뇌 내의 검출 가능한 인구는 말초 주입 (IV 또는 IP)으로 매우 낮은 것으로 추정되며, 주입되거나 주입 된 세포의 작은 부분만 을 나타냅니다. 인트레이스테렐 주사는 매우 초점 분포를 산출하고,2직접 뇌 손상을 유도할 수 있다2,6,,77,8,,9,,<...

줄기세포(SC) 치료는 뇌졸중, 두부 외상 및 치매1,,,2,23, 4,4,55,6을포함한 신경질환 치료제로서 엄청난 잠재력을 지니고 있다. 그러나, 병이 있는 뇌에 외인성 SC를 전달하는 효율적인 방법은 문제가있는 2,,6,,7,,8,,9,,10,,11,,12,,13으로남아 있다. 정맥 내(IV) 또는 관면(IP) 주사를 포함한 주변 전달 경로를 통해 전달되는 SC는 미세 순환, 특히 폐, 간, 비장 및 근육8,,9,,13,,14에서미세 순환에서 첫 번째 통과 필터링의 대상이 되며, 비표적 영역에서 세포의 축적 가능성을 증가시킵니다. 침습적 인트레이스레브렐 주사 방법은 국소화된 뇌 조직 손상 및 주사 부위,,2,6,8,14,,15,16근처의 SC의 매우 제한된분포를초래한다., 최근에는 카테터 기반 동맥 내 주입 방법을 수립하여 외인성 신경 SC(NSC)를 전달하며, 여기서 설명되는 이 방법은 초점 허혈성 뇌졸중의 설치류 모델에 적용되고 있다. 마우스,또는 쥐(17, 18,19)에서좌중뇌동맥(MCA)을 폐백시키기 위해 실리콘 고무 코팅 필라멘트를 이용하여17,한 반구에서 과도(1h) 허혈-재퍼퓨전 손상을 유도한다.18 본 모델에서 우리는 레이저 도플러 또는 레이저 반점 이미징17,19,일관된 신경 적자17,18,19를가진 ipsilateral 반구에서 대뇌 혈류(CBF)의 약 75-85%의 우울증을 재현적으로 관찰하였다.17,,
시간 절약을 위해, 비디오는 정상 속도의 두 배로 재생하도록 설정되어 있으며, 봉합사를 사용한 피부 제제 및 상처 폐쇄와 같은 일상적인 외과 적 수술과 전동 주사기 펌프의 사용 및 설정은 제시되지 않습니다. NSC의 동맥 내 전달 방법은 설치류에서 실험적인 뇌졸중의 중간 뇌동맥 폐색(MCAO) 모델의 맥락에서 입증된다. 따라서, 우리는 나중에 두 번째 수술, 동맥 내 주사가 동일한 동물에 이전 수술 부위를 사용하여 수행되는 방법을 보여주기 위해 일시적인 허혈성 뇌졸중 절차를 포함한다. 설치류 스트로크 모델에서 동맥 내 NSC 전달의 타당성은 외인성 NSC의 분포와 생존을 평가함으로써 입증된다. 뇌 병리학 및 신경 기능 장애를 감쇠하는 NSC 치료의 효능은 별도로 보고될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>20 G 바늘</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305175</td><td>주사 카테터</td></tr><tr><td>26G 바늘</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305111</td><td>주사 카테터</td></tr><tr><td>27G 바늘</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305136</td> 주<td>사 카테터</td></tr><tr><td>4-0 NFS-2 봉합사 바늘</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56905</td><td>수술</td></tr><tr><td>6-0 나일론 봉합</td>사 <td>Teleflex/Braintree Scientific</td><td>104-s</td><td>수술</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td><td>세포 박리 솔루션</td></tr><tr><td>블레이드</td><td>Bard-Parker</td><td>10</td><td>수술</td></tr><tr><td>부프레노르핀-SR 연구실</td><td>ZooPharm</td><td>부프레노르핀-SR 연구실&reg;</td><td>진통 (3 일 이상 0.6-1 mg/kg)</td></tr><tr><td>칼슘/마그니섬 프리 PBS VWR</td><td></td><td>02-0119-0500</td><td>NSC 해리</td></tr><tr><td>DCX 항체</td><td>Millipore</td><td>AB2253</td><td>면역염색</td></tr><tr><td>GFAP 항체</td><td>Invitrogen</td><td>180063</td><td>면역염색</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50562-1</td><td>수술</td></tr><tr><td>MCAO 필라멘트 마우스</td><td>Doccol</td><td>702223PK5Re</td><td>수술</td></tr><tr><td>쥐 용 MCAO 필라멘트</td><td>Doccol</td><td>503334PK5Re</td><td>수술</td></tr><tr><td>MRE010 카테터</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE010</td><td>주사 카테터</td></tr><tr><td>준비 MRE025 카테터</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE025</td><td>주사 카테터 준비</td></tr><tr><td>MRE050 카테터</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE050</td><td>주사 카테터</td></tr><tr><td>준비 Nu-Tears 연고</td><td>NuLife Pharmaceuticals</td><td>Nu-Tears 연고</td><td>수술 중 안과 관리</td></tr><tr><td>S& T 집게 - SuperGrip 팁 JF-5TC 각진</td><td>미세 과학 도구</td><td>00649-11</td><td>수술</td></tr><tr><td>S& T 집게 - SuperGrip 팁 JF-5TC 스트레이트</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>00632-11</td><td>수술</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Pacer Technology</td><td>15187</td><td>주사 준비 카테터</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>수술</td></tr><tr><td>Tuj1 항체</td><td>Millipore</td><td>MAb1637</td><td>면역 염색</td></tr><tr><td>2 성분 5 분 에폭시</td><td>Devcon</td><td>20445</td><td>주사 카테터</td></tr><tr><td>준비 Vannas 봄 가위</td><td>정밀 과학 도구</td><td>15000-08</td><td>수술</td></tr><tr><td>혈관 클램프</td><td>정밀 과학 도구</td><td>00400-03</td><td>수술</td></tr><tr><td>Zeiss 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td>현미경</td></tr></tbody></table>

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

신경 줄기 세포 (NSC) 치료는 뇌졸중, 외상성 뇌 손상 및 신경 퇴행성 질환에 대한 새로운 혁신적인 치료법입니다. 두개 내 전달과 비교하여 NSC의 동맥 내 투여는 덜 침습적이며 뇌 완두엽종 내에서 NSC의 확산 분포를 생성합니다. 또한, 동맥 내 전달은 뇌 순환에 있는 첫번째 통과 효력을 허용하고, 말초 주사와 관련되었던 간 및 비장과 같은 말초 기관에 있는 세포의 포획을 위한 잠재력을 감소시킵니다. 여기서, 우리는 일반적인 경동맥(mouse) 또는 외부 경동맥(rat)을 통해 NSC를 허혈성 뇌졸중 후 입시측반구로 전달하는 방법론을 상세히 설명한다. GFP 라벨NSC를 사용하여, 우리는 허혈성 상해 사이트 또는 그 근처에 더 높은 밀도로, 사후 전달 후에 1 d, 1 주 및 4 주에 설치류 ipsilateral 반구를 통해 달성된 광범위한 분포를 보여줍니다. 장기 생존 이외에, 우리는 4 주에 GFP 표지 된 세포의 분화의 증거를 보여줍니다. NSC를 위해 여기에서 기술된 동맥 내 전달 접근은 또한 치료 화합물의 관리에 사용될 수 있고, 따라서 다중 종에 걸쳐 다양한 CNS 상해 및 질병 모형에 광범위한 적용성을 가지고 있습니다.

GFP 라벨NSC는 허혈성 뇌에서 쉽게 검출되었으며, 주로 입실반구에서, 특히 페넘브라와 부상림(그림 6)을따라 검출되었다. 심사관은 이미징 및 분석 중에 단 하나 눈을 멀게했습니다.
예를 들어, 주사 후 1d에서, NSC는 마우스 해마 내에서 검출되었다. NSC의 하위 집합은 이 초기 시점에서조차 축성 자이러스에서 미성숙 뉴런 마커 DCX의 공동 발현을보였다(도 6A).
뇌졸중 후 10d(NSC 주입 후 7d)에서 외인성 GFP-NSC는 스트트리아텀 및 피질(도6B)에서부상(유역 지역)의 림에서 가장 높은 밀도로 관찰되었다. GFP-NSC의 많은 주입 후 7 d에 의해 또한 DCX표현 (블루 원에 의해 표시), 그들의 신경 운명을 나타내는 주목할 만하다. 차량 용액 주입...

신경 줄기 세포를 전달하는 방법, 용액 또는 현탁액을 주입하기 위한 적응성, 일반적인 경동맥을 통해 (마우스) 또는 외부 경동맥 (쥐) 허혈성 뇌졸중 후보고된다. 주입된 세포는 뇌 의 자당종 전체에 광범위하게 분포되며 전달 후 최대 30d까지 검출될 수 있다.

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

뇌졸중은 전 세계적으로 사망률과 장애의 주요 원인입니다. 혈전용및 뇌혈관 폐색의 외과적 제거는 일부 환자에서 수행될 수 있지만, 뇌졸중에 대한 효과적인 치료법이 여전히 절실히 필요하다. 여기서, 우리는 뇌졸중 치료를 위한 잠재적인 처방으로서 허혈성 반구에 줄기 세포의 카테터 기반, 동맥 내 전달을 시연한다.먼저, 주사 카테터와 수술 후크를 준비하는 방법을 소개합니다. 우리는 동맥 내 주입을 위한 주사 카테터의 두 가지 유형을 설계했습니다. 설계 하나는 튜브의 플러싱이 필요하지 않은 용액 또는 서스펜션의 주입에 사용됩니다.디자인 2는 신경 줄기 세포의 주입을 허용하고, 죽은 부피의 플러시다음 전체 볼륨을 전달할 수 있습니다. 사출 카테터 세트를 구축하려면 26 게이지 및 20 게이지 바늘, MRE 25 카테터의 10 ~ 15 센티미터 길이및 MRE 50 및 MRE 10 카테터의 3 센티미터 길이가 필요합니다. 바늘 끝을 잘라 내고 사포에 금속 끝을 연마하여 튜브를 다시 열고 가장자리를 부드럽게 한 다음 증류수로 씻어 내어 구멍을 청소하고 이물질을 씻어냅니다.그림은 바늘 끝을 잘라 낸 후 20 게이지 바늘의 닫힌 끝을 보여 주며 연마 후 부드러운 보어로 다시 열립니다. 현미경으로, MRE 50 튜브의 끝에 20 게이지 바늘을 삽입. 26 게이지 바늘을 구부리고 20 게이지 바늘 끝의 끝 아래에 튜브를 관통합니다.슈퍼 접착제로 26 게이지 바늘을 고정하십시오. 그런 다음 두 개의 바늘 허브와 튜브 및 에폭시를 포함시켜 강도를 향상시키기 위해 견고한 블록을 구축합니다. 또한 수술 부위의 더 나은 노출을 위해 조직을 제자리에 고정시키기 위해 세 가지 수술 후크가 필요합니다.27 게이지 바늘에서 1 센티미터 반에서 2 센티미터 길이의 바늘 샤프트를 자르고 사포에서 양 끝을 칙칙할 때까지 연마합니다. 작은 혈전성 클램프를 사용하여 샤프트를 한쪽 끝에 후크로 구부리고 다른 쪽 끝에는 링 모양이 있습니다. 10~15센티미터 길이의 MRE 25 카테터를 링을 통해 삽입하고 명확한 수술 용 테이프로 고정하십시오.동일한 방법을 사용하여 두 개의 후크를 더 만듭니다. 후크와 카테터 시스템은 멸균을 위해 70%의 에탄올에 밤새 담가야 합니다. 동물 과목과 관련된 모든 절차는 켄터키 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.우리는 GFP, 양성 신경 줄기 세포를 배양하기 위해 ENT 배아 마우스 뇌를 사용합니다. GFP

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 살아있는 쥐 두뇌의 특정 영역에 유전자 구성의 제공이 아닌 바이러스 방법을 설명합니다. 방법은 플라스미드 준비, micropipette 제조, 신생아 쥐 새끼 수술, 구조의 microinjection과로 구성되어...

비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

이 프로토콜에서 설명하는 생쥐에서 했습니다만 출혈의 autologous 혈액 주입 모델은 바늘 트랙까지 혈액 역류, 펌핑 시스템에서 anticoagulants의 위험을 최소화하기 위해 이중 사출 기술을 사용하고, 시스템의 모든 죽은 공간 및 확장 튜브를 제거합니다.

마우스에서 자연 했습니다만 출혈을 모델로 Autologous 혈액 주입

중간 대뇌 동맥 (MCA) 내고 동물 모델에 초점 대뇌 국소 빈혈을 연구하는 기술입니다. 이 방법에서는, 중간 대뇌 동맥 craniotomy에 의해 노출 소작된에 의해 출혈도 잡았. 이 방법은 높은 재현성 경색 볼륨과 사용 가능한 다른 방법에 비해 증가 이후 수술 생존 속도를 제공합니다.

마우스에 영구 중간 대뇌 동맥 내고의 응용

뇌내출혈의 전임상 모델은 임상 질환의 특정 측면을 모방하는 데 사용됩니다. 따라서 부상의 메커니즘과 잠재적인 치료 전략을 탐구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 뇌내 출혈의 두 가지 모델, 자가 혈액의 선조체내(기저핵) 주사 또는 콜라겐분해효소에 대해 설명합니다.

뇌출혈의 쥐과 모델로자가 혈액이나 클로스 트리 디움 콜라게나 제의 줄무늬 체 주입

이 문서에서는 출생 후 하루 1-8 마우스 또는 쥐 새끼에 간헐적 저산소증의 짧은 기간을 관리하는 방법을 설명합니다. 이러한 접근은 효과적 저산소증 노출 30 분 이내에 수확 배양 신경 전구 세포에 대한 강력한 조직 수준 "프라이밍 효과"를 도출한다.

배달<em&gt; 생체</em&gt; 급성 간헐적 저산소증 신생아 설치류에서 국무 뇌실 지역 유래 신경 전구 세포 배양에

병리학적 조건에서 뇌 재구성을 연구하기 위해 우리는 혈액 뇌 장벽을 우회하여 뇌로 단백질을 직접 전달하기 위해 미량삼투압 펌프를 사용했습니다. 그런 다음 단백질의 영향으로 뇌 연결성의 변화를 연구하기 위해 요로 추적자를 주입합니다.

Miniosmotic의 주입 펌프 및 요로의 트레이서의 배달 병태 생리 학적 조건에서 뇌 조직 개편을 연구에

줄기 세포는 내재 된 종양 향성으로 인해 뇌종양 치료제로서 유망한 치료제입니다. 비 침습적 비강 내 줄기 세포 전달은 혈액 뇌 장벽을 우회하여 임상 번역의 가능성을 보여줍니다. 이 기사는 신경 교종 마우스 모델에서 비강 줄기 세포 전달의 기본 원리를 요약합니다.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

여기서, 우리는 척추의 요추 내 공간에 카테터를 이식하여 쥐 중추 신경계에 약물을 전달하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 초점을 맞추고, 이 방법은 뿐만 아니라 다른 치료 양식의 전달에 적합 하지만.

쥐 중추 신경계에서 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 내 전달

줄기 세포는 심근 손상을 가진 개별을 위한 잠재적인 처리로 지속적으로 조사됩니다, 그러나, 부상당한 조직 내의 그들의 감소된 생존및 보존은 그들의 장기 효험에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 허혈 재관전 손상의 뮤린 모델에서 줄기 세포 전달을위한 대체 방법을 설명합니다.

뮤린 모델에서 허혈혈 재관류 부상 후 줄기 세포의 지연 된 자궁 내 납품

주입 후 마우스 모델에서 경동맥 내 동맥을 복구하면 주입된 물질의 분포에 부정적인 영향을 미치지 않고 동맥으로의 혈류가 되돌아갑니다. 주사 부위 복구는 동일한 동맥을 통한 후속 주입을 용이하게 하고 완전한 Circle of Willis가 없는 마우스 균주에서 뇌 허혈을 예방합니다.

새로운 주입 부위 복구 기법을 통한 마우스 모델의 반복 경동맥 내 주입 촉진

배우세요 쥐와 마우스에서 경동맥을 통한 신경 줄기 세포 동맥 내 납품 방법을. 이 기술은 뇌졸중 후 허혈성 손상 회복을 위한 세포 치료 가능성을 제시합니다.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

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