Name: 동맥류 고지혈증 마우스 모델에서 오일 레드 O-염색된 전체 대동맥 병변의 이미징 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 배우세요 고지혈증 마우스 모델에서 오일 레드 O 염색을 이용한 전체 대동맥 죽상경화 병변의 정성적·정량적 분석 방법. 이 프로토콜은 유전적 요인과 새로운 치료법 평가에 필수적입니다.

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이 연구는 NIH 보조금 P30AR070253 (P.-Y.C.) 및 HL135582 (M.S.)에 따라 제공되는 공동 생물학 컨소시엄 마이크로 그랜트에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 우리는이 연구에 사용 된 마우스를 유지 한 R. Webber와 L. Coon에게 감사드립니다.

mT/mG(재고 번호 007676) 및 Apoe-/-(재고 번호 002052) 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입했습니다. Myh11-CreERT2 마우스는 Stefan Offermanns의 선물이었습니다 (Jackson Laboratory에서 재고 번호 019079로 제공됨). Tgfbr2fl/fl 마우스는 해롤드 L. 모세(밴더빌트 대학교)로부터 수득하였다. 모든 동물 절차는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다.
1. 생쥐
<ol><li>생산 MYH11-CreERT2, mT / mGf / f; Apoe-/- 및 MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; 앞서 기술한 바와 같은 Apoe-/- 마우스7. C57BL/6J 배경에 돌연변이 균주를 10세대 이상 번식시킨다. 참고 : Myh11-CreERT2 Cre 마우스 라인은 혈관 항상성 및 혈관 병리학에서 평활근 세포의 역할을 연구하기위한 강력한 도구를 제공합니다. Cre 대립유전자가 Y 염색체 내로 삽입되고; 따라서 암컷 마우스는이 구조를 표현하지 않습니다.</li>
</ol>2. 마우스 유전자형, 타목시펜 유도, 고콜레스테롤 고지방 다이어트 먹이기
<ol><li>마우스 귀 DNA 및 PCR 분석을 사용하여 마우스 지노타이핑을 수행합니다. 마우스 귀 DNA는 제조업체의 지침에 따라 혈액 및 조직 DNA 분리 키트 (재료 표)를 사용하여 분리해야합니다. PCR 프라이머는 표 1에 열거되어 있다.</li>
	<li>6주령 MYH11-CreERT2;mT/mGf/f에서 5일 동안 1mg/일 i.p.에서 타목시펜 주사에 의한 크레록스 재조합을 유도; Apoe-/- 및 MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; 아포 - / - 수컷 마우스.</li>
	<li>8주령의 수컷 마우스(타목시펜 처리 후 2주)를 HCHF 식이(40% kcal 지방, 1.25% 콜레스테롤, 0% 콜산)에 16주 동안 올려 놓음으로써 죽상동맥경화증을 유도하였다.</li>
</ol>3. 시약 및 해부 도구 준비
<ol><li>스톡 오일 레드 O 용액 제제: 1 g의 오일 레드 O를 이소프로필 알코올 100 mL에 용해시킨다.</li>
	<li>작업 오일 레드 O 용액 준비 : 24 mL의 원시 오일 레드 O 용액과 16 mL의 dH2O를 섞으십시오. 희석 된 Oil Red O를 0.45 μm 멸균 주사기 필터로 여과하십시오 (용액은 1-2 시간에만 좋습니다).</li>
	<li>60% 이소프로필 알코올 준비: 이소프로필 알코올 60mL와 dH2O 40mL를 섞는다.</li>
	<li>1x DPBS 제제에서 4% 포름알데히드: 1x DPBS의 30 mL에 16% 포름알데히드 10 mL를 희석한다.</li>
	<li>모든 해부 도구를 70% 에탄올로 청소합니다(그림 1).</li>
</ol>4. 안락사 (그림 2A)
<ol><li>안락사 전에 마우스의 체중을 측정하십시오.</li>
	<li>케타민과 자일라진의 복강 내 주사로 마우스를 안락사시킵니다 (각 밀리리터에는 10mg / mL 케타민과 2mg / mL 자일라진이 포함되어 있음).</li>
	<li>마우스를 수핀 위치(배꼽 쪽을 향하게 뒤집어)에 놓습니다.</li>
</ol>5. 가슴과 복강 및 심장 관류의 개방 (그림 2B)
<ol><li>1x DPBS 10 mL가 있는 10 mL 주사기를 제조하였다. 25G 바늘로 뚜껑을 덮으십시오. 주사기는 심장을 플러시하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>핀셋 (스타일 5)으로 피부를 잡고 복부 바닥에서 목 꼭대기까지 미세한 가위로 자릅니다.</li>
	<li>흉곽 아래의 복벽을 엽니 다.</li>
	<li>족집게로 흉골을 들어 올리고 (스타일 5) 횡격막을 자른 다음 흉곽을 잘라 흉강을 노출시킵니다.</li>
	<li>심장의 오른쪽 심방에 작은 절개를하십시오.</li>
	<li>정점 좌심실 천자를 통해 관류시켜 1x DPBS 10mL를 천천히 주입한다. 일단 완전히 관류되면 간과 신장은 밝은 갈색이됩니다.</li>
	<li>재료를 흡수하기 위해 부직포 스폰지를 사용하여 외래 혈액과 액체의 흉강을 청소하십시오.</li>
</ol>6. 대동맥과 가지의 분리 (그림 2C)
<ol><li>장기 (즉, 폐, 간, 비장, 위장 및 생식 기관)를 제거하고 핀셋 (스타일 5)과 미세한 가위를 사용하여 쇄골을 자르고 심장, 신장 및 대동맥을 그대로 두십시오. 참고 : 심장이나 주요 혈관을 끈으로 묶지 않도록하십시오.</li>
	<li>마우스를 입체 현미경 아래에 놓습니다.</li>
	<li>족집게(스타일 4)와 봄 가위를 사용하여 상완 동맥, 경동맥, 쇄골 하부 동맥, 신장 동맥, 일반적인 장골 동맥 및 대퇴 동맥을 포함한 대동맥과 대동맥을 해부합니다. 참고 : 대동맥 가지를 해부하는 동안 탈수를 피하기 위해 젖은 부직포 스폰지로 대동맥을 덮으십시오.</li>
	<li>핀셋 (스타일 4)과 스프링 가위를 사용하여 대동맥과 대동맥 가지 주변의 모험 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 해부하고 제거하십시오. 참고 : 염증은 동맥류 고지혈증 마우스에서 두드러지기 때문에 재관을 제거하기가 어렵습니다. 대동맥과 대동맥 가지를 찢거나 닉하지 않도록주의하십시오. 이 단계는 연습과 인내가 필요합니다.</li>
</ol>7. 심장과 대동맥의 고정 (그림 2D, E)
<ol><li>DPBS의 1x 중의 4% 포름알데히드 10 mL와 함께 10 mL 주사기를 제조하였다. 25G 바늘로 뚜껑을 덮으십시오. 주의: 포름알데히드는 위험합니다. 이 화학 물질로 작업하기 전에 MSDS를 읽으십시오. 장갑과 안전 안경을 착용하고 흄 후드 안에 희석액을 생산하십시오. 참고: 4% 포름알데히드 용액은 시간이 지남에 따라 분해됩니다. 고정을 위해 갓 만든 4 % 포름 알데히드를 사용하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>4% 포름알데히드 10mL를 천천히 주입하여 정점 좌심실 구멍을 통해 혈관 트리를 고정시킵니다. 참고: 포름알데히드 고정은 세포 배양, FACS 분석 및 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석과 같은 여러 다운스트림 적용을 방해합니다. 대동맥이 이러한 응용 프로그램에 사용될 경우 이 단계를 건너뜁니다.</li>
	<li>재료를 흡수하기 위해 부직포 스폰지로 외래 유체의 흉강을 청소하십시오.</li>
	<li>핀셋 (스타일 4)으로 심장을 잡고 마이크로 해부 스프링 가위를 사용하여 대동맥에서 심장을 분리하십시오. 참고: 이 단계 후에 엔페이스 오일 레드 O 염색을 수행하려면, 대동맥을 생체외 대신 계내에서 개방하여 절단하고 섹션 8로 진행하는 것이 좋습니다. 이렇게하면 얼굴 대동맥이 평평하게 놓이기 쉽습니다.</li>
	<li>핀셋 (스타일 4)과 스프링 가위를 사용하여 대동맥 위 1mm에서 대퇴 동맥 끝까지 대동맥과 그 전공을 분리하고 소비하십시오.</li>
	<li>용기를 왁스 페트리 접시 또는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 대동맥을 덮을 때까지 1x DPBS로 채 웁니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>8. Oil Red O 염색 및 개봉되지 않은 전체 대동맥의 이미징 (그림 3)
<ol><li>미누티엔 핀을 사용하여 왁스 페트리 접시에 용기를 고정시킵니다(그림 3A).</li>
	<li>1x DPBS로 혈관을 한 번 헹구십시오.</li>
	<li>신선한 Oil Red O 용액 25mL를 페트리 접시에 붓습니다(그림 3B). 참고 : (1) 이소프로판올은 위험하고 가연성 액체입니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오. (2) Oil Red O 용액은 쉽게 침전 될 수 있습니다. 침전된 입자는 후속 염색을 방해할 수 있다. 사용 전에 Oil Red O 용액을 0.45 μm 필터를 통해 여과하여 침전물을 제거하는 것이 중요합니다. (3) 신선한 Oil Red O 용액을 준비하고 사용하지 않은 용액을 버리는 것이 가장 좋습니다. (4) Oil Red O 외에도 수단 IV는 지질, 트리글리세리드 및 지단백질의 염색에 사용되는 또 다른 화학 화합물입니다. 그러나 Oil Red O는 Oil Red O에 의해 생성 된 적색이 더 강렬하여 지방을 훨씬 쉽게 볼 수 있기 때문에 수단 IV를 점차 대체했습니다.</li>
	<li>대동맥을 실온에서 60 분 동안 얼룩 지게하십시오 (RT). Oil Red O는 지질이 풍부한 플라크를 빨간색으로 염색하여 다른 비 플라크를 포함하는 영역을 옅은 색으로 남깁니다.</li>
	<li>RT에서 60% 이소프로판올로 20분 동안 한 번 씻으십시오. 참고 : 과도한 헹굼은 플라크를 얼룩지게 할 수 있습니다.</li>
	<li>대동맥을 5분 동안 dH2O로 3x 헹구어 이소프로판올을 제거하였다.</li>
	<li>입체 현미경으로 핀셋(스타일 4)과 스프링 가위(그림 3C,D)를 사용하여 대동맥 주변의 모든 혈관 주위 지방 조직을 부드럽게 청소합니다. 참고 : Oil Red O로 염색 된 혈관 주위 지방 조직은 잘못된 배경을 생성하고 플라크 형태 측정 및 플라크 면적 정량화를 방해 할 수 있기 때문에 염색 후 대동맥 주변의 모든 혈관 주위 지방 조직을 청소하는 것이 중요합니다. 대동맥 벽의 일부를 제거하지 않도록하십시오. 세척하는 동안 얼룩진 대동맥을 덮을 때까지 왁스 접시를 dH2O로 채 웁스 접시를 채 웁스 접시를 채 웁니다. 이 단계는 연습과 인내가 필요합니다.</li>
	<li>용기를 깨끗한 유리 현미경 슬라이드로 옮깁니다.</li>
	<li>광학 현미경에 연결된 카메라를 사용하여 디지털 현미경을 획득합니다. 고해상도 이미지를 태그가 지정된 이미지 파일 형식(TIFF)으로 저장하는 것이 좋습니다(그림 3E). 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 대동맥이 건조되는 것을 방지하려면 용기를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 대동맥을 덮을 때까지 1x DPBS로 채 웁니다. 4°C에서 보관한다.</li>
</ol>9. En 얼굴 대동맥 장착 (그림 4, 그림 5)
<ol><li>용기를 왁스 페트리 접시로 옮기고 대동맥을 덮을 때까지 1x DPBS로 채 웁니다.</li>
	<li>분기 후 복부 대동맥의 대동맥과 장골 동맥의 경동맥, 쇄골 하부 동맥을 1-2mm 절단하십시오. 신장 동맥을 절단하십시오. (그림 4A)</li>
	<li>세로 절단하여 미세 해부 스프링 가위로 내부 곡률 (그림 4B1) 및 단독으로 장골 동맥 (그림 4B2)을 따라 대동맥 제제를 엽니 다.</li>
	<li>미세 해부 스프링 가위로 내부 곡률 (x-mark) (그림 4B3-B8)의 기본 레벨까지 더 큰 곡률을 따라 대동맥 아치의 세 가지 (즉, 무명, 왼쪽 일반적인 경동맥, 왼쪽 쇄골 하부 동맥)를 엽니 다.</li>
	<li>대동맥 플랫(루멘 사이드 페이스업)을 미뉴티엔 핀이 있는 왁스 접시에 고정하고 대동맥을 덮을 때까지 DPBS를 1x 발라서 건조되지 않도록 합니다(그림 4C). 참고 : (1) 롤업 대동맥을 평평하게 만들고 스트레칭하지 않고 얼굴에 고정하는 것이 중요합니다. 이 단계는 죽상 동맥 경화증의 중증도에 따라 며칠이 걸릴 것입니다. (2) Apoe-/- 또는 Ldlr-/- 동물의 대동맥의 경우 대동맥을 24시간 동안 고정하는 것이 좋습니다. (3) 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>유리 현미경 슬라이드를 70% 에탄올과 섬세한 작업 와이퍼로 청소합니다(그림 5A).</li>
	<li>대동맥을 깨끗한 유리 현미경 슬라이드로 옮기고 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물 15 방울을 다른 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 넣습니다 (그림 5B).</li>
	<li>OCT 화합물이 있는 유리 현미경 슬라이드를 대동맥 위에 조심스럽게 놓고 슬라이드에 기포가 끼워지지 않도록 합니다(그림 5C).</li>
	<li>슬라이드에 샘플 이름으로 레이블을 지정합니다(그림 5D). 참고: 장착된 en face 대동맥 슬라이드는 수개월 동안 4°C의 수분 챔버에 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>10. 얼굴 대동맥의 영상 및 병변 정량화(그림 6)
<ol><li>광학 현미경에 연결된 카메라를 사용하여 디지털 현미경을 획득합니다. 고해상도 이미지를 태그가 지정된 이미지 파일 형식(TIFF)으로 저장하는 것이 좋습니다(그림 6A).</li>
	<li>얼굴 전체에 얼룩진 대동맥의 이미지를 ImageJ 소프트웨어가 장착 된 컴퓨터로 전송하십시오.</li>
	<li>ImageJ에서 "자유형 선택"도구를 선택하고 "Alt"키 (Windows PC의 경우) 또는 "Shift"키 (Mac의 경우)를 누르면서 모든 Oil Red O 염색 플라크를 수동으로 동그라미로 돌립니다 (강렬한 빨간색 반점). 그런 다음 "분석" 메뉴에서 "측정"을 클릭하여 결과 창에 병변 영역을 표시합니다(그림 6B 왼쪽). 참고 : 죽상 경화성 병변의 정량화에는 몇 가지 함정이 있습니다 : (1) 8.7 단계에서 대동맥에 부착 된 염색 된 모험 지방의 작은 조각은 잘못된 배경을 생성하고 플라크 정량화를 방해 할 수 있습니다. (2) 단계 6.4 및 8.7로부터 대동맥벽의 일부를 제거하거나 대동맥을 손상시켜 플라크 정량화를 방해할 수 있고; (3) 장착 후(단계 9.8) 대동맥에 형성된 기포 및 주름이 플라크 정량을 방해할 수 있고; (4) 죽상 경화성 플라크는 3D 현상이며, 2D 평면에서 수행 된 측정은 플라크의 실제 정도를 반영하지 않을 수 있습니다. en face aorta plaque area의 분석 외에도, 대동맥 뿌리, 상완 동맥, 오름차순 대동맥 및 복부 대동맥의 플라크 크기를 별도로 분석하는 것이 좋습니다8.</li>
	<li>대동맥의 외부 경계선을 원으로 돌리고 "분석" 메뉴에서 "측정"을 클릭하여 결과 창에 대동맥 영역을 표시합니다(그림 6B 오른쪽).</li>
	<li>모든 측정값을 Excel 파일로 내보냅니다.</li>
	<li>전체 대동맥 면적에서 플라크 면적의 비율을 계산하고 값을 총 Oil Red O 표면적의 백분율로 정규화하십시오.</li>
	<li>8-10 Apoe-/- 및 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스의 플라크 면적 비율을 계산합니다. 데이터를 SEM에 대한 평균 ± 제시합니다(도 6C).</li>
	<li>다른 마우스 그룹과 비교한 플라크 면적 데이터의 비율에 대한 통계적 분석을 위해 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 수행합니다. 평균값의 차이를 p < 0.05에서 유의한 것으로 간주하십시오.</li>
</ol>

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<li>Emini Veseli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li>
<li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71, 343-353 (1992).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258, 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).</li>
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<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).</li>
<li>Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+mechanical+homeostasis+in+arterial+aging+and+associated+cardiovascular+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences.</a> Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).</li>
</ol>

저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Apolipoprotein E (Apoe) 및 저밀도 지단백 수용체 (Ldlr) 결핍 마우스는 죽상 동맥 경화증의 개발 및 치료를 연구하는 데 유용합니다. 조사관은 전체 대동맥9의 Oil Red O 염색을 사용하여 죽상동맥경화증 관련 질환 개시, 진행 및 퇴행에 대한 유전학 및 치료 조작의 영향을 평가할 수 있다. 대동맥 오일 레드 O 염색 및 병변 정량화는 죽상 동맥 경화증 연구를위한 황금 표준 종점입니다. 이 기술은 저렴하며 특수 장비가 필요하지 않습니다10. 그러나, 고품질의 Oil Red O 염색 조직을 얻는 것은 쉽지 않습니다. 이전 경험을 바탕으로이 프로토콜에는 세 가지 중요한 단계가 있으며 전체 절차에는 연습과 인내가 필요합니다. 첫 번째 중요한 단계는 Oil Red O 염색 전후에 대동맥 주변의 모든 혈관 주위 지방 조직과 그 가지를 해부, 제거 및 청소하는 능력입니다 (그림 <strong clas...

미국에서 사망의 주요 원인 인 관상 동맥 질환은 일반적으로 동맥 벽 내부에 플라크가 쌓이는 과정 인 죽상 동맥 경화증에 의해 유발됩니다1. 고지혈증이 발생하기 쉬운 Apoe- 및 Ldlr-결핍 마우스는 죽상동맥경화증과 그 합병증 및 치료법 개발의 조사의 중심입니다2,3,4,5. en face aorta로부터의 죽상경화성 병변의 정량화는 상이한 세포 유형에서 유전자 조작의 영향을 평가하기 위한 중요한 종점 분석이다. 또한 죽상 경화성 질환 개시, 진행 및 퇴행에 영향을 미치도록 고안된 새로운 치료법을 연구하는 데 도움이됩니다. 죽상 경화성 병변은 대동맥과 그 가지 (즉, 가슴의 상완골, 경동맥 및 쇄골 하부 동맥뿐만 아니라 횡격막 아래의 신장, 일반적인 장골 및 대퇴골 동맥)6의 어느 곳에서나 형성 될 수 있습니다. 죽상 경화증 부담과 적절한 치료에 대한 포괄적 인 평가는 종종 간과되는 도전 과제 인 다른 위치에서의 질병 부담에 대한 평가가 필요합니다.
이 프로토콜은 열리지 않은 전체 대동맥에서 시작하여 단일 마우스에서 얼굴 준비를 진행하는 죽상 경화성 병변에 대한 포괄적 인 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 개봉되지 않은 전체 대동맥 Oil Red O 염색은 전체 대동맥과 그 가지에서 지질이 함유 된 플라크의 신속하고 질적 인 평가를 가능하게하며, 얼굴 준비는 마우스 대동맥의 죽상 경화성 병변 분포에 대한 정량적 평가를 제공합니다.
이 기술은 Apoe-/- 고지혈증 배경 (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; 아포-/-; 이하 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스) 및 littermate Apoe-/- 대조군(MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; 아포-/-; 이하 Apoe-/- 마우스라고 함). 동물들은 연구 자료로서 고콜레스테롤 고지방 식단(HCHFD)에 16주 동안 보관된다7. 연구 종료시, 미개봉 전체 대동맥은 지질이 함유 된 플라크의 질적 평가를 위해 Oil Red O로 염색되고 (모든 주요 가지 포함) 이미지화됩니다. 대동맥은 얼굴 준비를 통해 절단되어 열리고, 모든 죽상 경화성 병변은 이미지화되고 정량화됩니다. 이 프로토콜은 Apoe-/- 또는 Ldlr-/- 고지혈증 마우스 모델에서 죽상경화성 병변 발달을 연구하는데 사용될 수 있고 일반적인 대동맥-관련 혈관 생물학 응용에 확장될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>DENVILLE</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>16% 포름알데히드</td><td>Polysciences</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>VWR</td><td>RC2546.70-5</td><td>해부 도구를 청소하려면</td></tr><tr><td>검은색 해부 왁스</td><td>CR Scientific</td><td>C3541</td><td></td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>Sigma</td><td>C8267</td><td>Tamoxifen</td></tr><tr><td>DNeasy 혈액 및 용 용제 조직 키트</td><td>QIAGEN</td><td>69506</td><td>쥐 귀에서 DNA를 분리하려면</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(1X DPBS), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>마우스 피부를 자르고 흉곽을 열려면</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>고콜레스테롤 고지방 다이어트</td><td>연구 다이어트</td><td>D12108</td><td>죽상동맥경화증을 유발하려면</td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>National Institutes of Health</td><td>Image J</td><td>대동맥 병변 정량화</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td></td><td>VWR JT9079-5</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>유리 현미경 슬라이드를 청소하려면</td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5602</td><td>심장과 대동맥을 분리하고 대동맥과 대동맥 가지를 절단합니다.</td></tr><tr><td>현미경 제어 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>DP 컨트롤러</td><td>대동맥 이미징</td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle-25G</td><td>BD</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>NonWoven Sponge</td><td>McKesson</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td>죽상 동맥 경화증 병변을 염색하기 위해</td></tr><tr><td>Pall Acrodisc 멸균 주사기 슈퍼 멤브레인이 있는 필터</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td>작동 오일 레드 O 용액을 필터링하려면</td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15021-15</td><td>대동맥을 해부하고 청소하려면</td></tr><tr><td>통계 소프트웨어</td><td>GraphPad</td><td>Prism 8</td><td>정적 분석</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td> 대<td>동맥 해부</td></tr><tr><td>실체 현미경 Olympus</td><td></td><td>SZX16</td><td>대동맥 이미징</td></tr><tr><td>용 Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>Cre-loxP 재조합</td></tr><tr><td>유도 Tissue-Tek OCT 화합물, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 스타일 4</td><td>전자 현미경 과학</td><td>0302-4-PO</td><td>마우스 피부를 자르고 흉곽을 열려면</td></tr><tr><td>핀셋 스타일 5</td><td>전자 현미경 과학</td><td>0302-5-PO</td><td>해부 및 청소 대동맥</td></tr></tbody></table>

동맥류 고지혈증 마우스 모델에서 오일 레드 o-염색된 전체 대동맥 병변의 이미징 및 분석

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- 또는 저밀도 지단백 수용체 (Ldlr)-결핍 고지혈증 마우스는 죽상동맥경화증 연구에 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 모델이다. 그들은 죽상 경화성 병변 형성에 대한 다양한 유전 적 요인과 다양한 세포 유형의 영향을 연구하고 새로운 치료법의 개발을 테스트하는 데 사용됩니다. 단리, 전체 대동맥의 절제, 및 Oil Red O 염색된 죽상경화성 병변의 정량화는 죽상경화성 부담을 평가하기 위해 사용되는 기본적인 형태학적 방법 이다. 이 프로토콜의 목표는 Oil Red O로 마우스 대동맥에서 죽상 경화성 병변을 해부, 퍼퓨즈 고정, 분리, 염색, 이미지 및 분석하기 위해 최적화 된 단계별 수술 방법을 설명하는 것입니다. 무신동맥경화성 병변은 대동맥 전체 트리의 어느 곳에서나 형성될 수 있기 때문에, 이러한 전체 대동맥 오일 레드 O 염색 방법은 단일 마우스의 전체 대동맥 및 모든 가지에서 지질이 함유된 플라크를 평가할 수 있는 장점이 있다. Oil Red O 염색 이외에, 신선한 분리된 전체 대동맥은 다양한 시험관내 및 생체내 실험 및 세포 분리에 사용될 수 있다.

이 프로토콜에서, TGFβR2iSMC-Apoe 마우스의 죽상경화성 병변을 HCHF 식이7 상에서 4개월 후에 분석하였다. 광범위한 죽상 동맥 경화증 외에도,이 마우스는 이전에 보도 된 바와 같이 흉부 및 복부 대동맥류를 개발했습니다. Apoe-/- 마우스와 비교했을 때, TGFβR2iSMC-Apoe 마우스 대동맥벽은 심각한 죽상동맥경화증을 나타내어 병변을 해부하기 어렵게 만들었다(그림 2C,D,E). 또한, 동맥류는 특히 suprarenal 대동맥 아래에 광범위하며, 진행된 인간 대동맥류를 연상케합니다.
HCHFD 공급 TGFβR2iSMC-Apoe 마우스로부터의 대표적인 미개봉 대동맥 오일 레드 O 염색 이미지를 도 3E에 ...

이 프로토콜은 마우스에서 죽상경화성 부담을 분석하기 위한 단계별 절차를 제공한다. 연구자는이 프로토콜을 사용하여 다른 동물에서 죽상 경화성 병변의 풍부도, 위치 및 크기를 비교할 수 있습니다.

동맥류 고지혈증 마우스 모델에서 오일 레드 O-염색된 전체 대동맥 병변의 이미징 및 분석

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

apoE 및 다른 유형의 고지혈증 마우스에서 죽상 경화성 병변의 정량화는 다양한 유전 적 요인과 새로운 치료법의 평가의 핵심입니다. 우리의 프로토콜은 단일 마우스에서 질적 및 양적 방식으로 죽상 경화 부담을 분석하기위한 단계별 지침을 제공합니다. 죽상 동맥 경화증을 유발 한 후 16 주 후, 심장을 관류하기 전에 10 밀리리터의 DPBS로 10 밀리리터 주사기를로드하고 25 게이지 바늘을 부착하십시오.핀셋으로 실험 마우스의 복부 피부를 들어 올리고 미세한 가위를 사용하여 복부 바닥에서 목 꼭대기까지 피부를 자릅니다. 흉곽 아래의 복벽을 열고 족집게를 사용하여 흉골을 들어 올려 횡격막에 접근하십시오. 횡격막을 자르고 흉곽을 잘라 흉강을 노출시킵니다.다음으로, 심장의 오른쪽 심방에있는 작은 절개를하고 DPBS의 전체 부피를 정점 좌심실 천자에 천천히 주입하십시오. 간과 신장은 밝은 갈색으로 변합니다. 모든 식염수가 관류되면 부직포 스폰지를 사용하여 외래 혈액과 체액의 흉강을 청소하십시오.흉강을 닦은 후 실험적이지 않은 장기를 제거하고 핀셋과 미세한 가위로 쇄골을 자릅니다. 마우스를 스테레오 현미경 아래에 놓고 핀셋과 스프링 가위를 사용하여 대동맥을 해부하십시오. 대동맥이 분리되면 식염수에 담근 부직포 스폰지로 조직을 덮고 상완골, 경동맥, 아클라비안, 신장, 일반 장골 및 대퇴골 동맥을 포함한 대동맥 가지를 해부합니다.대동맥에서 갈라지는 모든 동맥이 분리되면 핀셋과 스프링 가위를 사용하여 대동맥과 대동맥 가지 주변의 모험 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 해부하고 제거하십시오. 대동맥과 대동맥 가지를 성공적으로 격리하려면 연습과 인내가 필요합니다. 혈관 트리를 고정하려면 먼저 1X DPBS에 4 % 포름 알데히드가있는 10 밀리리터 주사기를로드하고 25 게이지 바늘을 부착하십시오.흄 후드 안에 항상 4 % 포름 알데히드를 준비하는 것을 잊지 마십시오. 바늘을 정점 좌심실 펑크에 넣고 천천히 전체 부피의 고정제를 주입하십시오. 시연 된대로 부직포 스폰지로 외래 유체의 흉강을 청소하고 핀셋과 마이크로 해부 스프링 가위를 사용하여 대동맥에서 심장을 분리하십시오.조직이 분리되면 대동맥과 그 주요 혈관을 경동맥 위의 한 밀리미터에서 대퇴골 동맥 끝까지 분리하고 절제하고 혈관을 DPBS 용기에 넣으십시오. 개봉되지 않은 전체 대동맥의 Oil Red O 염색을 위해서는 Minutien 핀을 사용하여 왁스 페트리 접시에 용기를 고

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

동맥류 고지혈증 마우스 모델에서 오일 레드 O-염색 전체 대동맥 병변의 이미징 및 분석

심혈관 질환의 동물 모델에서 동맥 병변의 생체 외 분석은 고전적으로 조직학 및 면역 조직 화학 기술에 의존합니다. 이는 3차원 병변에서 2차원 측정을 제공합니다. 이 원고는 광학 투영 단층촬영을 사용하여 3차원의 정량적 분석을 위한 동맥 병변의 발생에 대해 설명합니다.

생성 및 마우스의 동맥 병변의 3 차원 정량 광학 프로젝션 단층 촬영을 사용하여

조직화학적 및 면역조직화학적 분석과 결합된 대동맥동 및 상행 대동맥의 정밀 절단을 사용하여 마우스 모델에서 죽상경화성 병변을 정량화하고 특성화하는 절차를 설명합니다.

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

이 동영상은 쥐의 동맥 내막 플라크 개발의 두 가지 모델을 보여주고 myointimal 증식과 죽상 경화증의 차이를 강조한다.

쥐에서 동맥 경화 수스 Myointimal 증식을 유도 : 두 개의 유효한 모델의 소개

동물 모델은 만성 염증의 발달에 기여하는 호스트와 병원체의 특정 메커니즘을 규정하는 매우 중요한 도구로 입증되었다. 여기서 우리는 로컬 및 전신성 염증 부위에서의 진행을 평가하기 위해 인간 병원체 Porphyromonas 진지 발리 및 세부 방법론 경구 감염 마우스 모델을 설명한다.

로컬 및 전신 사이트에서 병원체에 의한 만성 염증을위한 마우스 모델

우리 세포 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변 포함 하 여 동물 해 부, 조직 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥의 분석의 체계적인 방법을 구성 하는 표준화 된 프로토콜을 제안 atheroprone에서 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스.

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

죽상 동맥 경화증의 뮤린 모형은 분자 수준에 병원성 통로를 조사하기 위하여 유용한 공구입니다, 그러나 병변 발달의 표준화한 정량화가 요구됩니다. 이 프로토콜은 대동맥 근, 대동맥 아치 및 brachiocephalic 동맥을 포함하여 주요 동맥 혈관에 있는 병변 크기를 결정하기 위하여 최적화된 방법을 기술합니다.

마우스에서 동맥 경화증의 정량화

여기에서는 쥐 대동맥을 3차원(3D)으로 이미지화하기 위해 최적화된 조직 제거 프로토콜을 제시합니다. 우리는 면역 염색, 광학 제거 및 이미징에 대한 최첨단 절차를 설명하며, 죽상 경화성 플라크가 있는 말초 신경계의 해부학적 근접성과 죽상 경화증의 외막을 정의하기 위해 설명합니다.

죽상동맥경화증에서 대동맥 조직의 3차원 이미징

이 프로토콜은 죽상경화증의 메커니즘과 진행에 대한 보다 심층적인 연구를 용이하게 하기 위해 죽상경화성 플라크의 정량적 분석을 위한 포괄적인 방법론을 제공합니다.

Isolation and Analysis of Aortic Arch and Root Lesions in an Atherosclerotic Mouse Model(죽상경화성 마우스 모델에서 대동맥궁 및 뿌리 병변의 분리 및 분석)

뼈 전이의 실험 마우스 모델은 루시페라제 내유 종양 세포를 표현 intracardiac 배달 아래 설립되었습니다. 종양 개발 및 osteolytic 병변을 발생은 bioluminescence과 마이크로 중부 표준시 이미징과 길이 방향 감시했다.

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표시 셀 다중 광자 현미경을 통해 혀를 이내 구강 암 종양 침략의 양적 모니터링 마우스 모델을 생성에 관련된 기술의 포괄적인 개요는 제공됩니다. 이 시스템은 침입 방지 화합물의 분자 평가 및 약물 효능을위한 유용한 플랫폼이 될 수 있습니다.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

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동맥류 고지혈증 마우스 모델에서 오일 레드 O-염색된 전체 대동맥 병변의 이미징 및 분석

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