Name: 배트 메이저 조직적합성 복합클래스 1등급 의 안정성 및구조 β 2-마이크로글로불린 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 배우세요 박쥐 MHC 클래스 I을 이용한 이종 β2-마이크로글로불린 치환을 통한 하이브리드 MHC 복합체 안정성 평가 방법. 이 기술은 감염병 및 종양 면역치료 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 제약 생명 공학의 국가 핵심 실험실의 오픈 펀드에 의해 지원되었다, 난징 대학, 중국 (그랜트 번호. KF-GN-201905), 중국 국립 자연과학 재단 (보조금 81971501). 윌리엄 J. 리우NSFC (81822040)와 베이징 신스타 과학 기술 계획 (Z18100006218080)의 우수 젊은 과학자 프로그램에 의해 지원됩니다.

1. 식 구문 준비
<ol><li>NCBI 데이터베이스에서 박쥐에서 MHC 클래스 I 유전자(예측 유전자 포함)의 서열을 검색합니다.</li>
	<li>면역 다형성 데이터베이스(ipD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) 및 UniProt 데이터베이스(www.uniprot.org)로부터 더 높은 포유류 MHC I 헤비 체인 서열을 검색합니다.</li>
	<li>수용성 MHC 복합체를 얻으려면 서열을 돌연변이하여 세포및 막 횡단 영역을 제거합니다.</li>
	<li>박쥐 Ptal-N*01:01의 자궁 도메인을 코딩하는 유전자를 복제합니다(GenBank No. KT987929 19)(잔여물 1~277개) 및 방망이 β2m(젠뱅크No. XP_006920478.1) (잔여물 1-98)를 pET-28a 벡터(노바겐, 베이징, 중국)로 각각</li>
	<li>최적화된(대장균용)서열을 수정된 pET-28a 벡터의 NcoI 및 EcoR1 부위 사이에 삽입하였다.</li>
	<li>이전에설명된바와 같이 인간 β2m발현 플라스미드를 구성한다.</li>
</ol>2. 펩타이드 합성
<ol><li>펩타이드 예측<ol>
<li>앞서 설명된 바와 같이10,Ptal-N*01:01에 결합할 수 있는 펩티드를 선별하고, 박쥐 관련 바이러스 헨드라 바이러스(HeV)의 단백질 바디를 사용하여 후보 펩티드를 예측한다. 온라인 서버로부터 구조 모델에 기초하여 높은 친화성 펩티드를 얻기 위해 NetMHCpan 4.0 서버(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/) 및 로제타플렉스펩독(22)은 선택한 펩티드 분획에서 잠재적 인 결합을 예측하였다. 또한 BIMAS를 포함한 기타 소프트웨어 및 데이터베이스, 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB), NetCTL 1.2 및 SYFPEITHI는 펩타이드-MHC 급 I 결합 친화성, 항원 처리(TAP) 수송 효율, 프테아소말 C 단자 분열 및 펩타이드-HLA 등급의 전파의 반시간 의 예측을 통합하여 사용할 수 있다.</li>
		<li>고결합 펩티드를 예측하려면 NetMHCpan 과 로제타 플렉스펩독 서버를 모두 사용하십시오. 참고: 불행히도, 생성된 예측도 실험 데이터와 일치하지 않습니다. 이는 현재 MHC 결합 펩티드 예측이 박쥐와 같은 비인간 및 비마우스 포유동물에 적합하지 않았으며, 이는 펩타이드 결합의 다른 방식을 가질 수 있음을 나타낼 수 있다. 따라서, 우리는 높은 친화성 펩티드를 얻기 위해 포괄적 인 분석을위한 다양한 예측 소프트웨어와 실험 결과를 결합해야합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>펩타이드 제제 및 보존<ol>
<li>사용자 지정 펩티드를 생성하는 대신 전문 서비스 공급자를 사용합니다. 더 높은 결합 점수를 가진 펩티드 예측 도구에 따라 상업적으로 모든 펩티드를 구입하십시오. 펩티드 순도는 HPLC 및 질량 분석법에 의해 >95%로 결정되었다.</li>
		<li>구입한 모든 펩티드를 -80°C에서 동결 건조 분말로 저장하고 사용하기 전에 디메틸 설산화물(DMSO)에 용해하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 포함 기관의 정화
<ol><li>대장균의 변신
	<ol>
<li>박쥐 MHC I Ptal-N*01:01 H 체인을 함유한 플라스미드의 10ng 또는 인간 β2m또는 박쥐 β 2m~ BL21(DE3) 대장균의 100 μL로2m를 변환한다. 30 분 동안 얼음에 목욕.</li>
		<li>90s42°C에서 열 충격, 2분 동안 얼음으로 목욕.</li>
		<li>리소제니 국물 800 μL을 추가 (LB: 효모 추출물, 트립폰 및 NaCl; 재료의 테이블을참조) 단계 3.1.2 단계와 20 분 동안 37 °C에서 흔들 플랫폼에 분당 200 회전 (rpm)에서 흔들어.</li>
		<li>100 μL의 세균현탁액을 해당 항생제 내성(ampicillin: 100 ng/mL)을 함유하는 플레이트에 적용하여 이전 구조와 동일합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>접종 문화<ol>
<li>최근 변형된 단일 세균클을 항생제 배지(ampicillin: 100 ng/mL)로 LB3mL로 선택하고 37°C에서 배양하고, 흔들리는 플랫폼에서 200rpm에서 흔들어 박테리아를 활성화시킨다. 문화는 늦은 밤에 접종 할 수 있습니다, 다음 아침에 유도에 대한 준비가 될 수 있습니다.</li>
		<li>1박 전에, 활성세균육의 500 μL을 항생제 배지(암피실린: 100 ng/mL)로 LB50mL로 옮기고, 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 200rpm에서 흔들어 보세요. 다음 접종을 준비할 때 편의를 위해, 나머지 활성세균육을 1mL 알리쿼트(글리세롤 500μL의 500μL)에서 -80°C에서 동결하여 다음 준비가 필요할 때까지 동결한다.</li>
		<li>다량의 재조합 단백질을 생성하기 위해 세균 제제를 항생제 배지(암피실린: 100 ng/mL)를 1:100의 비율로 LB 2L로 옮기고, 200 rpm에서 흔들면서 37°C에서 배양한다. 600 nm에서 0.6의 흡수성이 달성 될 때까지 배양. 단백질 발현의 유도를 위해 mM isopropyl-1-티오-β-D-갈라크토피라노사이드(IPTG)를 추가합니다(주로 0.1 mMM-1 mM 사이) 다른 MhC에 대한 IPTG의 농도를 변화시다.</li>
	</ol></li>
	<li>수확 박테리아<ol>
<li>박테리아를 원심분리기 병및 원심분리기로 5000 x g에서 4°C에서 20분 동안 옮긴다. 지금부터 모든 단계는 4 °C에서 수행되어야한다.</li>
		<li>인산염 완충식염(PBS)의 60mL에서 박테리아를 재중단시키고 초음파 세포 파괴기에 의해 발현된 재조합 단백질을 해방한다. 참고 : 일반적으로,이 기계에 설정 한 프로그램은 초음파 6S, 간격 12S, 300 W, 99 번입니다.)</li>
	</ol></li>
	<li>포함 기관의 정화<ol>
<li>30 분 동안 12,000 x g에서 초음파 세균 현탁액원심을 제거합니다. 상체를 버리고 적절한 세척 버퍼 (0.5 % Triton-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10mM DTT)의 적절한 볼륨으로 펠릿을 재연하십시오. 이 프로세스를 다시 한 번 반복합니다.</li>
		<li>10-20 분 동안 12,000 x g의 원심 분리기. 상체를 폐기하고 재서스펜션 버퍼(50m Tris pH 8.0, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM DTT)에서 포함 된 바디를 다시 중단하십시오. SDS-PAGE에 대한 20 μL 샘플(재서스펜션 버퍼에 포함된 바디)을 제거하여 포함 바디의 순도를 테스트합니다.</li>
		<li>10-20 분 동안 12,000 x g에서 나머지 준비원심분리기. 상부체를 폐기합니다. 포함 된 몸을 포함하는 펠릿의 무게를 측정하고 용해 버퍼 (6 M 과-HCl, 10 % 글리세린, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10mM EDTA)를 30 mg /mL의 최종 농도로 추가합니다. 4°C에서 자기 교반기로 천천히 저어서 포함 된 몸이 용해 버퍼에 용해 될 때까지 저어줍니다.</li>
		<li>원심분리기 12,000 x g10-20분 동안 침전을 버리십시오. 포함 바디를 -20°C 또는 -80°C에 저장합니다. 참고: 포함 기관의 정화를 진행하기 전에 재조합 단백질의 유도 및 발현이 성공적이었음을 확인하십시오. 단백질 젤에 각 배양(IPTG 유도 전후 촬영)에서 샘플을 실행; 15% SDS-PAGE (SDS-PAGE 농축 껌: H2O, 30% 아크릴아미드, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS 및 TEMED; SDS-PAGE 분리 젤: H2O, 30% 아크릴아미드, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 10% SDS, 10% APS 및 TEMED; H 체인의 β2m,10% SDS-PAGE의 경우 재료 표)를 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>4. MHC 단지의 재접이식
참고: 재접힌 포함 신체의 효율은 얻은 단백질의 수율에 영향을 미칩니다. 접는 중합과 경쟁하므로 일반적으로 낮은 단백질 농도에서 재접이는 것이 가장 성공적인 방법이라는 것이 허용됩니다. 이 논문에서 포함 체 농도는 30 mg/mL입니다.
<ol><li>다시 접는 버퍼를 준비합니다.<ol>
<li>단백질에 따라 재접이식 버퍼의 조성물을 다릅니다. 예를 들어, pH, 이온 강도, 레독스 조건 및 리간드의 존재는 재접기 결과에 영향을 미칩니다. 가장 일반적인 50-500 mMMM의 NaCl 농도와 중성 pH에서 Tris 또는 HEPES 기반 버퍼를 사용 하 여, 하지만 이것은 또한 대상 단백질에 따라 달라 집니다. 다음은 이 문서에서 사용되는 재폴딩 버퍼 수식입니다.</li>
		<li>100m Tris-HCl pH 8.0, 400mM L-아르기닌, 2mM EDTA-2Na로 접이식 버퍼를 준비한다.</li>
		<li>버퍼를 250-300 mL 플라스크에서 4°C로 냉각한 다음 5mM 감소글루타티온(GSH) 및 0.5mM 산화 글루타티온(GSSG)을 추가합니다. 포함 된 몸과 펩티드를 추가하기 전에 추가 10-20 분 동안 4 °C에서 자기 교반기를 사용하여 천천히 저어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MHC H 체인 및 β2m의주입 및 희석 참고: 재접이 수행되는 온도는 일반적으로 집계를 최소화하기 위해 4°C가 가장 좋습니다. 우리는 희석을 사용하여 단백질을 다시 접습니다.<ol>
<li>1 mL 주사기에서 바늘을 사용하여, 각각 2개의 재접이식 완충제(1리터)에 hβ2m 개조 체 또는 bβ2m 포함 바디의 1 mL를 주입합니다. 빠르게 회전하는 교반 막대 근처에 주입하여 빠르고 효율적인 희석을 얻습니다. β2m는비교적 쉽게 재접을 가지며 H 체인이 없는 경우에도 안정적으로 유지됩니다.</li>
		<li>β2m가재접이식용액에 용해된 후, DMSO에 펩티드(5 mg/mL)를 용해하고 200 μL을 재폴딩 용액에 신속하게 주입한다. H 체인을 추가하기 전에 10-20 분 동안 천천히 저어줍니다.</li>
		<li>β2m에대해 위에서 설명한 것과 동일한 절차로 H 체인을 주입합니다. H 체인은 매우 불안정합니다. 따라서, 주사의 순서는 매우 중요 하다. H사슬 포함 체체 3m를 각각 hβ2m또는 bβ2m로2개의 상이한 재폴딩 버퍼(각 1리터)에 주입한다. 단백질의 전체 양의 단일 적용 대신 작은 알리쿼트의 연속 주사는 다시 접힌 MHC의 수율을 증가시킨다. 8-10 h에 대해 4°C에서 다시 접을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>재접힌 단백질의 농도<ol>
<li>재접이식 단백질의 농도를 위해 10 kDa MMCO 멤브레인이 있는 가압 챔버에서 울트라 여과를 사용하십시오. 이 방법은 편리하며 버퍼 교환과 결합 할 수 있습니다. 챔버에 교환 버퍼(20m Tris-HCl, 50m NaCl pH 8.0)를 추가하고 30~50mL의 최종 부피에 농축한다.</li>
		<li>재접이식 용액을 원심분리기 튜브로 옮기고, 침전을 제거하기 위해 4°C에서 15분 동안 12,000 x g에서 회전한다.</li>
		<li>상체를 조심스럽게 옮기고 ~ 1mL의 최종 부피로 더 집중한다.</li>
		<li>10-20 분 동안 12,000 xg의 원심 분리기. 상체를 멸균 튜브로 옮기고 10/300 GL 크기 배제 컬럼을 사용하여 단백질을 정화합니다.</li>
		<li>피크에서 샘플을 수집하고 SDS-PAGE (15 % 폴리 아크릴 라미드 젤)를 사용하여 분석합니다.</li>
		<li>MHC 복합 피크를 수집하고 15 mg / mL의 최종 농도에 집중.</li>
		<li>복합체를 7.5 mg/mL및 15 mg/mL로 희석하여 결정화를 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 결정화, 데이터 수집 및 처리
<ol><li>착석 증기 확산 기술을 사용하여 복잡한 MHC 및 펩티드의 결정화를 수행합니다.</li>
	<li>상업용 크리스탈 키트(예: 크리스탈 스크린 키트 I/II, 인덱스 스크린 키트, 페기온 키트 I/II, PEGRx 키트) 및 PEGRx 키트로 Ptal-N*01:01/펩타이드 복합체를 스크린합니다.</li>
	<li>결과 용액을 밀봉하고 4 또는 18 °C에서 100 μL의 저수지 용액에 대해 평형하십시오.</li>
	<li>3일, 1주, 2주, 1개월, 3개월 및 6개월 동안 문화의 결정적 성장을 관찰한다. 현미경을 사용하여 결정 판의 각 낙하에 결정이 있는지 확인합니다. 참고: Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m)결정은 0.2M NaCl, 0.1 M 비스-트리스(pH 5.5), 폴리에틸렌 글리콜 3,350농도로 7.5 mg/mL 농도로 관찰되었다. Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m)결정은 0.1 M HEPES, pH 7.0, 2%w/v 폴리에틸렌 글리콜 3,350 농도7.5 mg/mL로 관찰되었다.</li>
	<li>극저온 보호의 경우, 20% 글리세롤을 함유한 저장 용액으로 결정을 옮은 다음 100K 기체 질소 스트림에서 빠르게 냉각시합니다.</li>
	<li>상하이 싱크로트론 방사선 시설(상하이, 중국)의 빔라인 BL19U에서 X선 회절 데이터를 수집합니다.</li>
</ol>6. 구조 결정 및 분석
<ol><li>고해상도 구조 데이터를 통해 Denzo 프로그램과 HKL2000 소프트웨어 패키지(https://hkl-xray.com/)를 사용하여 컬렉션의 강도를 처리하고 확장합니다(https://hkl-xray.com/) .</li>
	<li>단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 더 나은 초기 모델을 선택한 후, CCP424(http://www.ccp4.ac.uk/)에서 프로그램 Phaser MR을 사용하여 분자 대체를 사용하여 구조를 결정한다. 사용된 모델은 단백질 데이터 뱅크(PDB) 코드 5F1I와 구조 좌표였다.</li>
	<li>초기 조인트 개선에 세련된 X선 모델을 사용합니다. X선 단독으로 페닉스 정제와 조인트 모드를 사용하여 각각 관절 중성자와 X선 세련미를 사용하십시오.</li>
	<li>정제의 모든 라운드 후, 수동으로 Fo - Fc와 2Fo에 대한 모델을 확인 - 쿠트25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/)에서 Fc 긍정적 인 핵 밀도지도. 이것은 물과 특정 D 원자의 적절한 배치를 용이하게합니다. 구조의 모든 수치는 PyMOL (http://www.pymol.org/)에 의해 만들어졌습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 것이 없습니다.

다른 taxa로부터 이종 대체를 통한 하이브리드 단백질 복합체의 시공은 MHC I 및 리간드와 같이 동종 복합체가 제공되지 않을 때 기능및 구조적 조사를 위한 일반적인 전략이다. 그러나 방법론 및 기술에 대한 요약은 제한적입니다. 본명, 박쥐 MHC I, Ptal-N*01:01의 구조, bβ2m 또는 hβ2m에 의해 안정화된 구조가 분석되었다. Ptal-N*01:01에 결합하는 β2m의주요 아미노산은 박쥐와 인간 사이에 보존되는 것으로 나타났습니다. 추가 분석시, MHC의 H 사슬에 β2m결합에 관여하는 키 잔류물은 포유류에서 보존되었지만 닭, 물고기 및 양서류에서 다형성한 것으로 나타났습니다. 이러한 데이터는 이종 β2m대체가 포유류의 MHC I를 연구하는 실현 가능한 수단임을 나타냅니다. 그러나 포유동물과 조류, 물고기 또는 양서류 간의 대체는 실현 가능하지 않을 수 있습니다.
...

주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 모든 척추 동물에 존재하며 전염성 병원체에 대한 세포 매개 면역을 결정하는 유전자 세트입니다. MHC 클래스 I는 바이러스 감염시 생성된 바이러스 성분과 같은 내인성 펩티드를CD8+ T 세포 표면에 T 세포 수용체(TCR)에 제시하여 세포 면역을 중재하고 면역 조절1에참여한다. 펩티드에 결합하는 MHC I의 구조 연구는 CD8+ T 세포 면역 반응 및 백신 개발의 평가에 중요한 역할을 하는 MHC I 분자에 의한 펩티드 결합 모티프 및 프리젠테이션 기능에 관한 정보를 제공합니다.
BJorkman 외2에의한 MHC I 분자의 첫 번째 결정화 및 구조적 결정 이후, MHC I 분자의 결정 구조 분석은 펩티드가 MHC I 분자에 결합하는 방법에 대한 이해를 크게 촉진하고, 무거운 사슬 및 펩티드와 광사슬의 상호 작용을 이해하는 데 도움이 된다. 일련의 후속 연구는 광 사슬을 코딩하는 유전자가 MHC와 관련이 없지만, 광 사슬은 MHC I 분자3,4의조립을 위한 핵심 단백질임을 나타냈다. 그것은 여러 표면에 MHC 클래스 I 분자의 세 가지 도메인과 상호 작용. 광사슬이 없을 때, MHC 급 I 분자는 항원 제시 세포의 표면에 정확하게 표현될 수 없고 그들의 면역 기능을 발휘하기 위하여 TCR과 상호 작용할 수 없습니다.
MHC I는 중형 체인(H 체인)과 라이트 체인(즉,β 2-마이크로글로불린(β2m)으로구성되며, 적합한 펩타이드5에결합하여 조립된다. H 사슬의 세포외 세그먼트는 α1, α2 및 α3 도메인6로구성됩니다. α1 및 α2 도메인은 펩타이드 결합 홈(PBG)을 형성한다. β2m체인은 MHC I내 조립 단지의 구조적 서브유닛으로서 작용하여 복합체의 변형을 안정화하고, MHC I H 체인 접이식7,8,9에대한 분자 샤페론이다. 일련의 연구에 따르면 MHC I H 체인은 박쥐(Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10,레서스 마카크(영장류) (마무-B*17)11 (마무-A*01)12 (마무-A*02)13,마우스(로드엔티아)13,마우스(로드텐티아) 2K(14-14) 등 다양한 포유류로부터체인을 보였다.5,개 (카니보라) (DLA-88 *50801)16,가축 (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 및 말 (페리소다실라) (Eqca-N * 00602 및 Eqca-N * 00601)18 그는 18 과 결합 할 수있습니다.β...2.1. 이 하이브리드 분자는 종종 구조적 및 기능적 연구에서 사용됩니다. 그러나, 이종성 β2m를가진 하이브리드 MHC I의 기능및 구조 연구를 위한 방법론은 아직 요약되지 않는다. 한편, 서로 다른 택시 사이의 β2m의구조적 기반은 불분명합니다.
본명, MHC I 발현, 재접이식, 결정화, 결정데이터 수집 및 구조 결정에 대한 절차가 요약된다. 또한, 상이한 종으로부터β 2m의잠재적 대체는 동종 및 이종β2m에의해 안정화된 MHC I의 구조적 형성을 비교하여 분석된다. 이러한 방법은 암 및 전염병에서 추가 MHC I 구조 연구 및 CD8+ T 세포 면역 반응 평가에 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>10 kDa MMCO 막</td><td>Merck millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>30% 아크릴아미드</td><td>LABLEAD</td><td>A3291-500ml*5</td><td></td></tr><tr><td>5회; 단백질 SDS 로딩</td><td>Novoprotein</td><td>PM099-01A</td><td></td></tr><tr><td>AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa 컷오프</td><td>Merck millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Inalco</td><td>1758-9314</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) 변형</td><td>TIANGEN</td><td>CB105-02</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP</td><td>219605580</td><td>적절한 장갑과 눈/얼굴 보호구를 착용하십시오. 눈에 들어간 경우 즉시 다량의 물로 씻어내고 의사의 진찰을 받으십시오.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td>장갑과 고글은 환기가 잘 되는 주방에서 착용하고 작동해야 합니다. 눈에 들어간 경우 즉시 다량의 물로 씻어내고 의사의 진찰을 받으십시오.</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>KeyGEN BioTECH</td><td>KGT515500</td><td></td></tr><tr><td>글리세린</td><td>HUSHI</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>GSH</td><td>Amresco</td><td>0399-250G</td><td></td></tr><tr><td>GSSG</td><td>Amresco</td><td>0524-100G</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Amresco</td><td>E424-5KG</td><td></td></tr><tr><td>h&beta; 2m</td><td>우리 연구실</td><td></td><td>Zhang, S. et al. 두 개의 HIV 유래 펩타이드 복합체에 의해 밝혀진 HLA-A*0301 및 HLA-A*1101에 의한 교차 대립유전자 표현의 구조적 기초. 몰 면역. 49 (1-2), 395-401, (2011).</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Inalco</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>L-아르기닌 염산염</td><td>Amresco</td><td>0877-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>단백질 마커</td><td>발효</td><td>26614</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Boao Rui Jing</td><td>A112130</td><td></td></tr><tr><td>Superdex Increase 200 10/300 GL</td><td>GE 헬스케어</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo</td><td>17919</td><td>장갑과 고글은 환기가 잘 되는 주방에서 착용하고 작동해야 합니다.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>Bioruler</td><td>RH30056-100mL</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>옥소이드</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>옥소이드</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

배트 메이저 조직적합성 복합클래스 1등급 의 안정성 및구조 β 2-마이크로글로불린

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

주요 조직 적합성 복합체(MHC)는 전염병 및 종양 발달에 대한 항원 펩타이드 프리젠테이션 및 T 세포 면역 반응에서 중추적인 역할을 한다. 이종β2-마이크로글로불린(β2m)으로복합된 하이브리드 MHC는 체외에서 안정화될 수 있다. 이것은 동종 β2m를사용할 수 없을 때 포유류의 MHC I를 연구하는 가능한 수단입니다. 한편, 포유류 β2m대체가 펩타이드 프리젠테이션에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 이종성 β 2-마이크로글로불린(β2m)으로복합된 하이브리드 MHC에 대한 방법론 및기술에 관한 요약이 제한되어 있다. 본명, 이종성의 타당성을 평가하는 방법은 MHC에서2m치환β 연구가 제시된다. 이러한 메서드에는 식 구문 준비가 포함됩니다. 포함 체의 정화 및 MHC 복합체의 재접기; 단백질 열안정성의 결정; 크리스탈 스크리닝 및 구조 결정. 본 연구는 MHC I의 기능 및 구조를 이해하기 위한 권장 사항을 제공하며, 또한 전염병 및 종양 면역 요법 중 T 세포 반응 평가를 위해 유의하다.

이전 작품은 HeV 유래 HeV1 (DFANTFLP) 펩티드가 Ptal-N*01:0110,19에의해 제시되었다고 보고했다. 본 명세서에서, 상동성 박쥐β 2m(bβ2m) 및 이종인간 β2m(hβ<font f...

이 프로토콜은 다른 종으로부터 잠재적 인 β2-microglobulin (β2m)대체를 통해 안정적인 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I를 얻는 실험 방법을 설명합니다. 동종 β2m에의해 안정화된 MHC I의 구조적 비교가 조사되었다.

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

이 연구에서는 Bat MHC Class I를 모델로 사용하여 방법론을 요약하고 이종성 베타-2 마이크로글로불린으로 복잡한 하이브리드 MHC 클래스의 타당성을 평가했습니다. 이전 연구는 포유류 B2M 대체펩티드 프리젠 테이션에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 사실, 하이브리드 MHC 클래스 는 본래 분자와 유사한 구조및 기능을 활성화할 수 있다.이러한 기술은 전염병 및 종양 면역 요법 동안 조직 반응 평가를 위해 MHC I의 기능및 구조화 연구를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 대장균 배양 변환을 위해 박쥐 또는 인간 MHC 클래스를 함유하는 플라스미드 10 나노그램을 100 마이크로글로불린 수소 사슬을 100 마이크로리터에 베타하고 30분 동안 얼음에서 현탁액을 목욕시킵니다. 인큐베이션이 끝나면 박테리아를 섭씨 42도에서 90초 동안 열충격을 주어 2분간 얼음 욕조로 문화를 되돌려 보겠습니다.다음으로 800 마이크로리터의 리소제니 국물을 문화에 추가하고, 섭씨 37도에서 20분 동안 흔들 플랫폼에서 서스펜션을 흔들고 분당 200회 회전합니다. 인큐베이션이 끝나면 박테리아의 100 마이크로리터를 적절한 항생제 내성 배양 블레이드에 퍼뜨리게 됩니다. 다음 날 아침, 최근에 변형된 단일 세균 클론을 선택하고 항생제 배지를 가진 LB의 3밀리리터로 클론을 접종합니다.12~16시간 동안 37도의 흔들림 을 위해 흔들 기위에 문화를 놓습니다. 다음 아침, 활성 세균성 스톡 의 500 마이크로리터를 항생제 배지로 LB의 50 밀리리터로 옮기고 박테리아를 하룻밤 동안 흔들 인큐베이터로 돌려보라고 한다. 나머지 활성 세균 성 육수를 500 마이크로 리터 알리쿼트로 나누고 각 알리코트를 섭씨 80도 저장에 대해 40 % 글리세롤의 500 마이크로 리터 볼륨에 추가합니다.다량의 재조합 단백질을 생성하기 위해, 다음날 아침 세균현탁액을 항생제 배지를 1 내지 100 비율로 LB 2리터로 옮기고, 600나노미터에서 0.6의 흡광도가 달성될 때까지 배양을 흔들 인큐베이터로 되돌려 한다. 이어서, 트랜스 유전자의 발현을 유도하기 위해 배양에 1밀리머 IPTG를 첨가한다. 4~6시간의 유도 후, 세균 배양을 원심분리용 병으로 옮기고, 병당 PBS의 60밀리리터에서 세균세포 펠릿을 다시 중단한다.그런 다음 초음파 세포 파괴기99회, 초음파당 300와트에서 12초 간격으로 발현된 재조합 단백질을 99회 해방한다. 포함 된 신체 정화에 대 한 원심 분리에 의해 초음파 박테리아를 수집 하 고 두 개의 추가 원심 분리에 대 한 세척 버퍼의 적절 한 볼륨에서 펠 릿을 다시 중단. 두 번째 세척 후 포함 바디 및 재서스펜션 버퍼를 다시 중단하고, SDS 페이지에 대한 샘플의 20 마이크로리터 알리쿼트를 따로 떼어 내어 포함 체순도를 테스트한다.나머지 샘플을 원심분리하고 펠릿을 포함하는 포함 체의 무게를 측정합니다. 버퍼밀리리터당 30밀리그램의 포함 체에 펠릿에 용해 버퍼를 추가합니다. 그리고 자기 교반기를 사용하여 용액을 섭씨 4도에서 천천히 저어주며, 포함 된 몸이 용해 버퍼에 용해 될 때까지.침전을 버린 후 포함 된 몸을 영하 20도 또는 영하 80도로 저장하십시오. MHC 복합재폴딩의 경우, 글루타티온 5밀리머감소글루타티온과 0.5 밀리머 산화 글루타티온을 250~300밀리리터에 추가하면 섭씨 4도의 재폴딩 버퍼를 넣습니다. 그리고 10~20분 동안 4°C에서 자기 교반기에서 용액을 천천히 저어줍니다.MHC 수소 체인 및 베타 2개의 마이크로글로불린 희석의 경우, 포함 체를 1밀리리터 주사기에 적재하고 포함 체액 의 1리터 부피를 교반 바 근처의 재접이식 버퍼 1리터에 주입하여 빠르고 효율적인 희석을 얻습니다. 다음으로, 디메틸 설프산화물에 펩티드 밀리리터 당 5 밀리그램을 용해하고, 방금 입증된 바와 같이 200마이크로리터의 펩티드를 재빨리 재보딩 용액에 주입한다. 10-20분간의 느린 교반 후, H 체인 포함 바디 3밀리리터를 새로운 1리터 의 재접이식 버퍼에 주입하고 8~10시간 동안 섭씨 4도에서 재폴딩을 진행할 수 있도록 합니다.재접힌 단백질 농도를 결정하기 위해 10킬로달톤 다중 구리 산화막으로 가압 챔버에 교환 버퍼를 추가하고 완충액을 30~50밀리리터 부피로 농축한다. 재접이식 용액을 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리에 의한 침전액을 제거한다. 슈퍼네이트를 조심스럽게 챔버로 옮기고 버퍼를 약 1 밀리리터의 최종 부피로 농축합니다.원심분리에 의해 최종 오염 물질을 제거하고 슈퍼네이트를 멸균 튜브로 옮긴다. 10300개의 GL 크기 배제 컬럼을 사용하여 단백질을 정화하고, 피크시 샘플을 수집하고, SDS 페이지를 사용하여 분석합니다. MHC 복합 피크를 수집하고 밀리리터 당 15 밀리그램의 최종 농도로 단백질을 농축합니다.그런 다음 복합체를 밀리리터 농도당 7.5 밀리그램으로 희석합니다. 착석 낙하 증기 확산 기술을 사용하여 복잡한 MHC 및 펩타이드의 결정화를 수행하기 위해, 시료의 0.8 마이크로리터를 상업용 결정보드에 추가하고 보드를 밀봉한다. 4또는 18도에서 100 마이크로리터의 저수지 용액에 대한 샘플 용액을 상화하고 현미경을 사용하여 향후 6개월 동안 의정 성장을 정기적으로 관찰합니다.극저온 보호를 위해, 실험의 끝에서, 100도 켈빈 기체 질소 스트림에서 시료를 빠르게 냉각하기 전에 20% 글리세롤을 포함하는 저장 용액으로 결정을 전송합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 x선 회절 데이터를 수집합니다. 결정 복합체의 구조를 결정하기 위해 HK L 2000 소프트웨어 패키지 내에서 Denzo 프로그램에서 고해상도 구조 X선 회절 데이터를 열고 단백질 데이터 뱅크에서 초기 모델을 선택합니다.단백질의 구조를 결정하기 위해 CCP4의 Phaser MR 프로그램에서 데이터를 열고 초기 관절 정제를 위해 정제된 X-ray 모델을 사용합니다. 그런 다음 X선 단독으로 미세 조정을 위해 피닉스 세련미와 조인트 모드를 사용하며, X선 세련미를 위해 조인트 중성자를 사용합니다. 각 라운드의 개선 후, 수동으로 Fo-Fc에 대한 모델을 확인하고, 쿠트의 2Fo-Fc 긍정적 인 핵 밀도지도.이러한 대표적인 실험에서, 헨드라 바이러스 유래 헨드라 바이러스 1 펩타이드의 결합 능력은 동종 박쥐 베타 2개의 마이크로글로불린 및 이종성 인간 베타 2개의 마이크로글로불린을 가진 MHC 클래스 I 수소 사슬을 박쥐로 펩티드하였다. 두 분석 모두, 고해상도를 가진 결정은 베타 2개의 마이크로글로불린 광사슬을 가진 레나튜레이션을 통해 형성되었다. 베타 2개의 마이크로글로불린이 없는 경우, 이러한 복합체는 형성되지 않는다.MHC 클래스 I 수소 사슬 헨드라 바이러스 1, 인간 베타 2 마이크로글로불린 구조에서, 배트 베타 2마이크로글로불린에 해당하는 인간 베타 2개의 마이크로글로불린의 H31, D53, W60 및 Y63의 보존잔류는 펩타이드 결합 홈의 바닥과 접촉하고 Q8, Y10, R12 및 24잔류를 보존하여 베타 2마이크로글로불에 결합된 3개의 마이크로글로불에 해당한다. 전체 박쥐와 인간 구조물에서, 수소 사슬의 1~184잔류의 평균 루트 평균 제곱유도는 탄소 알파 원자의 모든 중첩하에서 0.248이며, 이는 이 두 복합체 사이에 차이가 없음을 나타낸다. 펩티드 정렬의 구조는 이 두 복합체에서 헨드라 바이러스 하나의 펩티드의 확인이 매우 유사하다는 것을 보여줍니다.서열 정렬은 또한 다른 종에서 베타 2 마이크로 글로불린의 아미노산이 높게 보존된다는 것을 보여줍니다. 높은 보고 효율을 가진 적대단지를 제공하는 것이 중요합니다. 따라서 적합한 베타 2 마이크로 글로불린을 선택하고 고도로 정제된 포함 바디를 사용하는 것이 중요합니다.이 프로토콜은 다른 종에서 잠재적 인 베타 2 마이크로 글로불린 대체를 통해 복잡한 안정적인 MTC I를 획득하는 데 사용할 수 있으며, 존재하기 위해 MTC I 구조 및 기능입니다. 이러한 연구에서 얻은 데이터는 전염병 및 종양 면역 요법 중 T 세포 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

stability-structure-bat-major-histocompatibility-complex-class-i-with

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

여기에서는 인간 백혈구 항원에 의해 제시되는 T-세포 수용체와 종양 항원 사이의 상호 작용의 본질이 T-세포 기능을 어떻게 지배하는지 결정하기 위해 실험실에서 일반적으로 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법에는 단백질 생산, X선 결정학, 생물 물리학 및 기능적 T 세포 실험이 포함됩니다.

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

Zika 바이러스 (ZIKV) 감염에 대 한 Ifnar1-/- murine 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 보호의 셀룰러 메커니즘 및 immunopathogenesis ZIKV 백신의 조사에 대 한 중추적인 이며 또한 그들의 효능 평가 위한 귀중 한.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

이 프로토콜 사용을 설명 합니다 단일 체인의 MHC 종류 I 인간 CD8 + T 세포 활성화의 분자 상호 작용을 조사 하기 위해 단지: 조작된 항 단일 체인을 표현 하는 세포의 생성, 인간 CD8 + T 세포 복제의 문화 그리고 T 세포 활성화 실험입니다.

공동-agonism 인간 CD8 + T 세포 활성화에 조사를 단일 체인 MHC 기술의 사용

마이크로톰을 이용한 다목적 저온 분석 BN-MS 프로토콜이 고분해능 복합체 프로파일링을 위해 제시된다.

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

이 프로토콜은 배아 마우스 뇌에서 1 차적인 해마 뉴런을 배양하기위한 방법을 설명합니다. 배양된 뉴런의 세포외 표면에 있는 주요 조직적합성 복합 클래스 I의 발현은 유동 세포 측정 분석에 의해 평가된다.

유동 세포에 의한 주요 조직 적합성 복합 클래스 1의 표현 평가

여기서, 우리는 고품질 면역 펩티도믹스 데이터를 제공하는 마우스 및 인간 세포주로부터 MHC 급 I 및 클래스 II 펩티드 복합체의 정화를 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 시판되는 항체를 사용하여 샘플 준비에 중점을 둡니다.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

여기에서 우리는 특정 미세소관 변형 효소가 부족하거나 포함할 수 있는 포유류 세포에서 내인성 튜불린을 추출하여 특정 변형을 위해 풍부한 미세소관을 얻는 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 추출된 미세소관을 정제된 미세소관 결합 단백질로 장식하여 초저온 전자 현미경을 위한 그리드를 준비하는 방법을 설명합니다.

초저온 전자 현미경으로 미세소관-단백질 복합체를 연구하기 위해 포유류 세포에서 변형된 미세소관 추출

여기에서는 쥐 쇄골 상부 갈색 지방 조직의 조직학적 및 유전자 발현 분석을 해부하고 수행하기 위한 실용적인 절차를 제공합니다.

쥐 쇄골 상갈색 지방 조직의 해부, 조직학적 처리 및 유전자 발현 분석

배우세요 박쥐 MHC 클래스 I을 이용한 이종 β2-마이크로글로불린 치환을 통한 하이브리드 MHC 복합체 안정성 평가 방법. 이 기술은 감염병 및 종양 면역치료 연구에 활용됩니다.

배트 메이저 조직적합성 복합클래스 1등급 의 안정성 및구조 β 2-마이크로글로불린

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