Name: הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: למד הנדסת גנום בCRISPR/Cas9 בתאי B אנושיים ראשוניים לחקר פונקציות גנים ופיתוח תרפיות. השיטה מאפשרת מחיקה והכנסת גנים ביעילות גבוהה לחקר ביולוגיה של תאי B.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי הקרן לחקר הסרטן לילדים (CCRF) ו NIH R01 AI146009 כדי B.S.M.

דגימות לויקפירזיס מתורמים בריאים התקבלו מבנק דם מקומי. כל הניסויים המתוארים כאן נקבעו להיות פטורים למחקר על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית (IRB) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית Biosafety (IBC) באוניברסיטת מינסוטה.
הערה: כל הניסויים בוצעו בהתאם לאמצעי הזהירות האוניברסלי לפתוגנים המועברים בדם, עם טכניקות סטריליות/אספטיות וציוד biosafety רמה 2 מתאים.
1. הכנת תוספי תזונה למדיום הרחבת תאי B
<ol><li>לשקם אוליגונוקלאוטידים CpG לריכוז של 1 מ"ג / מ"ל.</li>
	<li>לשקם את CD40 ליגנד (CD40L) לריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל.</li>
	<li>לשקם את האדם רקומביננטי IL-10 (rhIL-10) לריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל.</li>
	<li>לשקם אדם רקומביננטי IL-15 (rhIL-15) לריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל. הערה: שמור כל תוספת aliquots קטן ב -20 °C (70 °F) כדי -80 °C (6 °F) עד 6 חודשים.</li>
</ol>2. הכנת מדיום בסיסי
<ol><li>שלב מדיום בסיסי של תאי B עם תוסף מדיה של 5% (v/v) להרחבת תאי החיסון במבחנה (למשל, CTS Immune Cell SR) ו- 1% (v/v) פניצילין וסטרפטומיצין.</li>
	<li>מסנן-לעקר את המדיום הבסיסי באמצעות מתאם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק מעוקר.</li>
	<li>שמור על מדיום הבסיס ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.</li>
</ol>3. הכן מדיום הרחבה של תאי B
<ol><li>להעביר את הכמות הנדרשת של מדיום הבסיס לתוך מיכל סטרילי לתרבות תאי B ב 5 × 105 תאים / מ"ל.</li>
	<li>להשלים את המדיום הבסיסי עם 1 מיקרוגרם / מ"ל CpG, 100 ננוגרם / מ"ל CD40L, 50 ng/ mL rhIL-10, ו 10 ng/mL rhIL-15.</li>
	<li>סנן את אמצעי ההרחבה של תא B באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>יש להשוות את מדיום ההתפשטות של תאי B באינקובטור תרבית הרקמות ב-37°C, 5% CO2 עם לחות לפחות 30 דקות לפני השימוש. הערה: הכן מדיום הרחבה חדש של תאי B לשימוש ליום אחד. אל תכין את אמצעי ההרחבה של תא B לשימוש במשך מספר ימים. מתכון מדיה זה מעודד התפשטות של תאי זיכרון B ותאי B אנושיים ראשוניים מופעלים.</li>
</ol>4. טיהור והתרחבות תאי B אנושיים
הערה: מוסיפים 99–100% אלכוהול איזופרופיל למיכל הקפאה מבוקר טמפרטורה, בהתאם להוראת היצרן, ומצננים את מיכל ההקפאה ב-4 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים את שלב 4.1.
<ol><li>בידוד מחשבים אישיים מדגם לוקאפורזיס
	<ol>
<li>מעבירים דגימת לוקאפורזיס (כ-8-10 מ"ל) לצינור חרוט סטרילי של 50 מ"ל.</li>
		<li>העלה את עוצמת הקול ל- 35 מ"ל עם מלוחים סטריליים עם אגירת פוספט (PBS) של 1x פוספט.</li>
		<li>שכבה בזהירות מדגם 35 מ"ל leukaphoresis על 15 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 25 דקות ללא בלם, להסיר את שכבת הפלזמה מבלי להפריע מעיל באפי (שכבת PBMC), לאסוף את המחשבים מהממשק, ולהעביר צינור סטרילי חדש 50 מ"ל חרוט.</li>
		<li>העלה את מחשבי ה- PCMCs ל- 50 מ"ל עם PBS אחד.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ללא בלם. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה PBMC, אשר עשוי להיראות אדום.</li>
		<li>מוסיפים 7 מ"ל של מאגר תמוגה אמוניום-כלוריד-אשלגן, פיפטה 3 פעמים כדי לערבב היטב, ואת הדגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות.</li>
		<li>העלה את עוצמת הקול ל- 50 מ"ל עם PBS 1x.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות עם בלם התנגדות נמוכה. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה. גלולה צריך להיראות ורדרד או לבן. הערה: כדי להמשיך לתרבת את תאי B המבודדים זה עתה, הכינו את מדיום ההתפשטות של תאי B לפני שתתחילו בבידוד תאי B (שלב 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד תאי B ממחשבי PC באמצעות ערכת בידוד שלילית ראשונית של תאי B אנושיים
	<ol>
<li>התחדשו במחשבי PCBM במאגר הבידוד לריכוז של 5 × 107 תאים/מ"ל. הערה: אם המספר הכולל של מחשבים אישיים קטן מ- 5 × 107 תאים, הקטן את נפח מאגר הבידוד כדי לשמור על 5 × 107 תאים/מ"ל. נפחים מינימליים ומקסימליים של השעיית תאים הם 0.25 מ"ל ו- 8 מ"ל, בהתאמה.</li>
		<li>מעבירים עד 8 מ"ל (5 ×10 7 תאים/מ"ל) לצינור סטרילי, פוליפרופילן, עם כובע.</li>
		<li>הוסף 50 μL / mL של משפר קוקטייל למחשבים.</li>
		<li>הוסיפו 50 μL/mL של קוקטייל בידוד למחשבי PCMCs, כיפה הצינור, והפך 2-3 פעמים לערבב.</li>
		<li>דגירה ב RT במשך 5 דקות; בדקהה-4 של הדגירה, חיידקים מגנטיים מערבולת לפחות 30 שניות.</li>
		<li>העבר 50 μL של microbeads מגנטי לכל 1 מ"ל של PBMCs, כובע הצינור, והפך 2-3 פעמים לערבב.</li>
		<li>יש לשלך עד 10 מ"ל עם מאגר בידוד ופיפט בעדינות למעלה ולמטה 2-3 פעמים.</li>
		<li>מניחים את הצינור בתחנה מגנטית ודגרים ב- RT במשך 3 דקות.</li>
		<li>החזק את המגנט ואת הצינור יחד, ובתנועה אחת, להפוך את המגנט ואת הצינור יחד לשפוך את המתלה התא לתוך הצינור החדש. השלך את הצינור הישן.</li>
		<li>חזור על שלב 4.2.8 (להפחית את זמן הדגירה ל 2 דקות) ויוצקים את ההשעיה B-cell לתוך צינור חרוט נקי.</li>
		<li>תאי B המועשרים מוכנים לשימוש. אם ייעשה שימוש מיידי בתאים, המשך לסעיף 4.3 (הרחבת תאי B אנושיים). בדוק את הטוהר של תאי B המבודדים לפי ציטומטריית זרימה (אופציונלי). אם יש להקפיא תאים לפני השימוש, המשך לשלב 4.2.12.</li>
		<li>כדי להקפיא את תאי B, צנטריפוגה ב 400 × g במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה.</li>
		<li>resuspend התאים במדיום הקפאה ב 107 תאים / מ"ל, ו aliquot 1 מ"ל / cryovial.</li>
		<li>מניחים את ההקפאה במיכל ההקפאה המצונן, ומאחסנים ב -80 מעלות צלזיוס לילה; לאחר מכן, להעביר את cryovial קפוא למיכל חנקן נוזלי; לשמור על תאים קפואים עד שנה אחת. הערה: התשואה הצפויה של תאי B מבודדים היא 2%-8% מסך המחשבים האישיים, עם כדאיות של 95%-99%.</li>
	</ol></li>
	<li>הרחבת תאי B אנושיים הערה: אם אתה משתמש בתאי B מבודדים זה עתה, דלג על שלבים 4.3.1-4.3.5. לספור את התאים ולהעביר את מספר התאים הנדרש לתוך צינור חרוט סטרילי ולהמשיך עם שלב 4.3.6.<ol>
<li>סרום שור עוברי חם מראש (FBS) באמבט מים לפני הפשרת תאי B. הכינו 20 מ"ל של מדיום הרחבת תאי B, העבירו לבקבוק T25, ושווים מראש את המדיום באינקובטור תרבית רקמות (ב-37 °C (37 °C, 5% CO2, עם לחות) לפחות 15 דקות לפני השימוש.</li>
		<li>להפשיר תאי B באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בזמן ההמתנה, להעביר 2 מ"ל של FBS שחומם מראש לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל חרוט.</li>
		<li>לאחר תאי B מופשרים לחלוטין, מיד להוסיף 1 מ"ל של FBS מחומם מראש, טיפה חכם, לתוך המדגם. דגירה ב- RT למשך דקה.</li>
		<li>בעדינות פיפטה כדי resuspend את המדגם ולהעביר את כל נפח, dropwise, לתוך צינור חרוט המכיל 2 מ"ל של FBS מחומם מראש.</li>
		<li>העלה את עוצמת הקול ל- 15 מ"ל עם PBS סטרילי של 1x, כיפה והפך את הצינור בעדינות 2-3 פעמים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות.</li>
		<li>להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה התא, resuspend גלולה התא עם 1 מ"ל של מדיום הרחבה B-cell שווה מראש, ולספור את התאים. מספר התא הכולל צריך להיות כ- 107 תאים.</li>
		<li>העבר את התאים לבקבוק המכיל 20 מ"ל של מדיום הרחבת תאי B המשווונים מראש. הריכוז הסופי של התאים צריך להיות כ 5 x 105 תאים / מ"ל.</li>
		<li>דגירה אנכית של הבקבוק באינקובטור של תרבית רקמות.</li>
		<li>רענן את מדיום ההרחבה לחלוטין כל יומיים על ידי העברת כל נפח תאי B לצינור חרוט סטרילי וחזר על שלבים 4.3.6–4.3.9. הערה: בקבוקון T25 יכול להכיל 10-20 מ"ל של בינוני; בקבוקון T75 יכול להכיל עד 20-60 מ"ל של בינוני.</li>
	</ol></li>
</ol>5. הנדסת תאי B אנושית ראשונית
<ol><li>מהנדס B תאים ב 48 ± 2 שעות לאחר הרחבה / הפעלה לקבלת תוצאות אופטימליות. הכינו את מדיום הרחבת תאי ה-B, aliquot 1 מ"ל של המדיום לצלחת תרבית רקמות של 48 באר, וקדם-שיווי משקל באינקובטור של תרבית רקמות לפחות 15 דקות לפני השימוש. הערה: בעת עיצוב CRISPR/Cas9 sgRNA עבור גן מעניין, בצע את השלבים המפורטים להלן. - עיצוב sgRNAs באמצעות כלי מקוון11. - עיצוב sgRNAs על אקסון המשותף לכל isoforms של החלבון. - להזמין sgRNA שונה כימית מחברות מכובדות. - sgRNA בדרך כלל מגיע בצורה lyophilized; לשקם sgRNA ב DNase / RNase סטרילי ללא טריס-EDTA (TE) מאגר לריכוז של 1 מיקרוגרם / μL.</li>
	<li>הכן CRISPR / Cas9 מצע transfecting על ידי ערבוב 1 μL (1 מיקרוגרם / μL) של sgRNA שונה כימית עם 1.5 μL (1 מיקרוגרם / μL) של נוקם סטרפטוקוקוס שונה כימית Cas 9 (S.p. Cas9) גרעין לכל תגובת transfection. לפקד, השתמש ב- μL אחד של מאגר TE במקום ב- sgRNA. הערה: כאשר CD19 sgRNA משמש לניסוי KO בגן, ראה איור 2 לקבלת תוצאות. כש-AAVS1 sgRNA משמש לניסוי KI בגנים, ראו איור 5 לתוצאות.<ul>
<li>שמור את כל הרכיבים על קרח.</li>
	</ul></li>
	<li>מערבבים בעדינות ומעבירים 2.5 μL של CRISPR / Cas9 מצע חוצה לכל תגובה לתוך צינור של 0.2 מ"ל 8 צינור רצועה; מניחים בצד ב-RT.</li>
	<li>הפעל גרעין (אלקטרופורטור), והכן ריאגנטים transfection כפי שמוצג בטבלה 1. הערה: זהו צעד טוב להפסקה, במידת הצורך, על ידי הצבת כל ריאגנטים על קרח. הסר את כל ריאגנטים מקרח כאשר מוכן לחדש את הניסוי. בעת שימוש בחלבון S.p. Cas9, החוקר חייב מראש מורכב CRISPR / Cas9-sgRNA ריבונוקלאופרוטאין על ידי ערבוב 1 מיקרוגרם sgRNA עם 5 מיקרוגרם של חלבון S.p. Cas9, הימנעות כל בועות, דגירה התערובת ב RT לפחות 20 דקות לפני השימוש לקבלת תוצאות אופטימליות.</li>
	<li>לספור ולהעביר 106 תאי B לכל תגובת transfection לתוך צינור חרוט סטרילי.</li>
	<li>העלה את עוצמת הקול ל-15 מ"ל עם PBS סטרילי של 1x, וצנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות. בזמן ההמתנה, הכינו את ריאגנט transfection התא הראשי (טבלה 2) והניחו בצד ב- RT.</li>
	<li>להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה התא.</li>
	<li>Resuspend גלולת התא עם 10 מ"ל של סטרילי 1x PBS וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות.</li>
	<li>להשליך את supernatant לחלוטין מבלי להפריע גלולה התא.</li>
	<li>העבר 0.5 מיקרוגרם של MRNA GFP שונה כימית (ככתב transfection) לכל 106 תאים B לכדור התא (אופציונלי).</li>
	<li>Resuspend גלולת התא עם 20 μL תא ראשי transfection מגיב לכל 106 תאי B; מערבבים בעדינות על ידי pipetting 5-6 פעמים. העבר 20.5 μL לכל תגובת transfection לתוך הצינור 0.2 מ"ל של רצועת 8 צינור המכיל 2.5 μL של מצע TRANSFection CRISPR / Cas9.</li>
	<li>פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת כדי לערבב ולהעביר את כל נפח (23 μL) לתוך cuvette transfection. מכסים ומקשים בעדינות על הקובטה שעל הספסל כדי להבטיח שהנוזל מכסה את תחתית הקובט.</li>
	<li>השתמש בפרוטוקול B-cell ראשי אנושי על הגרעין עבור transfection. הערה: ניתן למקם את הגרעין (אלקטרופורטור) ולהשתמש בו מחוץ למכסה המנוע של תרבות הרקמות. כיפה cuvette כדי להבטיח סטריליות.</li>
	<li>מניחים את התאים האלקטרופוטים בקובט ב- RT למשך 15 דקות.</li>
	<li>העבר 80 μL של מדיום הרחבת תאי B המשווונים מראש מלוח תרבית הרקמה לתגובת transfection ב cuvette. מניחים את הקובטה באינקובטור תרבית הרקמות במשך 30 דקות.</li>
	<li>בעדינות פיפטה כמה פעמים כדי לערבב ולהעביר את כל נפח המדגם מן cuvette לבאר המתאימה של צלחת 48-באר רקמה תרבות המכיל 1 מ"ל של מדיום הרחבת B-cell. הריכוז הסופי של התאים צריך להיות 106 תאים / מ"ל.</li>
	<li>אם מבצעים ניסוי KI גן, להעביר rAAV6 וקטור ב 500,000 ריבוי של זיהום לתוך הבאר המתאימה המכילה תאים electroporated (כ 45 דקות לאחר electroporation). ראו מבנה וקטורי rAAV6 לדוגמה באיור 4A. הערה: לדוגמה: דגימת בקרה תיקרא אלקטרופוטית ללא CRISPR/Cas9 או הווקטור rAAV6. דגימה וקטורית בלבד תטופל ללא CRISPR/Cas9 ולאחר מכן תשתנה עם הווקטור rAAV6. דגימת KI תהיה electroporated עם CRISPR /Cas9 ולאחר מכן להיות transduced עם וקטור rAAV6. rAAV6 חייב להכיל זרועות הומולוגיות במעלה ובמורד הזרם של אתר DSB היעד עבור HDR.</li>
	<li>מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 עם לחות.</li>
	<li>ספור את התאים ואת יכולת הקיום של הרשומה ביום הראשון שלאחר ההנדסה.</li>
	<li>רענן את מדיום ההרחבה של תאי B כל יומיים על-ידי ספירת התאים ולאחר מכן העברת כל נפח התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 × g במשך 5 דקות, ולזרוק את supernatant מבלי להפריע גלולה. לשים מחדש את התאים עם 100 μL של מדיום הרחבת תאי B טריים, ולהעביר לבאר של צלחת תרבית רקמות 24-גם. העלה את הנפח הבינוני כדי להשיג ריכוז תאים סופי ב 5 × 105 תאים / מ"ל. הערה: צלחת 48 באר יכול להחזיק עד 1 מ"ל בינוני / טוב; צלחת 24 באר יכול להחזיק עד 2 מ"ל בינוני / טוב; צלחת 12-באר יכול להחזיק עד 4 מ"ל בינוני / טוב, צלחת 6-באר יכול להחזיק עד 8 מ"ל בינוני / טוב.</li>
	<li>אפשר לתאים המהונדסים להתרחב לפחות 5 ימים לפני ביצוע ניתוחים במורד הזרם, כגון ניתוח ציטומטריית זרימה, ניתוח TIDE ו- PCR של צומת.</li>
</ol>

<ol><li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes%3A+how+they+develop+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li>
<li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li>
<li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicines%22%5BJournal%5D)">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li>
<li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li>
<li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li>
<li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li>
<li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144(2018).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
<li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+CRISPR%2FCas9+sgRNA+design+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li>
<li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+editing%3A+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li>
<li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li>
<li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404(2014).</li>
<li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li>
<li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li>
<li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li>
</ol>

הוגש פטנט על שיטות ייצור ושימוש בתאי B ערוכים בגנום עם M.J.J. , K.L., ו B.S.M כממציאים. B.S.M היא יועצת ובעלת מניות Immusoft Inc. Immusoft Inc מימנה מחקר במעבדה של B.S.M.

הנדסת גנום מדויקת בתאי B אנושיים ראשוניים הייתה מאתגרת עד לאחרונה9,10. פרסמנו בעבר פרוטוקולים באמצעות CRISPR/Cas9 כדי להנדס תאי B אנושיים ראשוניים9. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים משופרים עבור בידוד B-cell, הרחבה, והנדסה כדי לאפשר KO יעיל של CD19 או לדפוק ב EGFP.
כאן אנו מראים כי פרוטוקול ההתרחבות שלנו מאפשר התרחבות מהירה של תאי B בתרבות להרחבה של עד פי 44 תוך 7 ימים (איור 1). ...

תאי B הם תת-קבוצה של שושלת הלימפוציטים המופקת מתאי גזע hematopoietic. הם מבצעים תפקיד קריטי במערכת החיסון ההומוריסטית האדפטיבית על ידי ייצור כמויות גדולות של נוגדנים בתגובה לאתגרים החיסוניים1. תאי B הם גם סימנים מקדימים של תאי זיכרון B ותאי פלזמה מובחנים, ארוכי טווח, ובכך מספקים חסינות הומוריסטית מתמשכת2. תאי פלזמה, בפרט, הם ייחודיים בקרב תאי החיסון ביכולתם לייצר כמויות גדולות של נוגדן מסוים תוך כדי הישרדות במשך שנים או עשרות שנים3. בנוסף, קלות הבידוד מדם היקפי הופכת את שושלת התאים B למועמד מצוין לטיפולים חדשניים מבוססי תאים4.
בעבר, שיטות אינטגרציה אקראיות, כגון אלה באמצעות וקטורים lentiviral או טרנספוזון היפהפייה הנרדמת, שימשו להנדסת תאי B עבור משלוח transgene וביטוי5,6,7,8. עם זאת, האופי הלא ספציפי של גישות אלה מקשה על חקר הפונקציות הביולוגיות של גן מסוים בתאי B ונושא סיכון אינהרנטי של מוטגנזה הכנסתית וביטוי טרנסג'ין משתנה ו / או השתקה בסביבה הטיפולית.
מערכת CRISPR/Cas9 היא כלי הנדסת גנום רב עוצמה המאפשר לחוקרים לערוך במדויק את הגנום של תאים שונים במינים רבים. לאחרונה, שתי קבוצות, כולל שלנו, פיתחו בהצלחה שיטות להרחבת ex vivo והנדסת גנום ממוקדת של תאי B אנושיים ראשוניים9,10. נתאר את התהליך של טיהור תאי B אנושיים ראשוניים מדגם לוקאפורזיס. לאחר מכן, נתאר את הפרוטוקול המעודכן שלנו להרחבת תאי B ולהפעלה של תאי B מבודדים. לאחר מכן נתאר תהליך להדחת אשכול של בידול 19 (CD19), קולטן B-cell ספציפי וסימן ההיכר של תאי B, על ידי electroporation להציג CRISPR / Cas9 mRNA יחד עם CD19 sgRNA לתוך תאי B פעילים.
Cas9 mRNA מתורגם ונקשר ל- CD19 sgRNA כדי ליצור קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין (RNP) CRISPR/Cas9-sgRNA. לאחר מכן, sgRNA במתחם מוביל Cas9 ליצור שבר גדיל כפול (DSB) ברצף היעד על exon 2 של הגן. התאים יתקנו את ה- DSB על ידי "הצטרפות קצה לא הומולוגית" על ידי החדרה או מחיקה של נוקלאוטידים, מה שיוביל למוטציה של frameshift ויגרום לגן להיות בנוקאאוט. לאחר מכן נמדוד את אובדן CD19 על ידי ציטומטריית זרימה וננתח היווצרות אינדל על ידי מעקב אחר אינדלים על ידי ניתוח פירוק (TIDE).
לאחר מכן נתאר את תהליך השימוש ב- CRISPR/Cas9 יחד עם וקטור AAV6 רקומביננטי (rAAV6, תבנית תורמת לתיקון מונחה הומולוגיה (HDR)) כדי לתווך בהכנסה ספציפית לאתר של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר(EGFP) בגן שילוב וירוסים הקשורים לאדנו 1 (AAVS1). גן AAVS1 הוא מוקד פעיל ללא פונקציות ביולוגיות ידועות ואתר אינטגרציה נגיפי AAV על הגנום האנושי; לכן, הוא נחשב "נמל בטוח" להנדסת גנום. כאן אנו מדווחים כי התרחבות והפעלה של תאי B אפשרו התרחבות של עד פי 44 ב-7 ימי תרבות (איור 1). אלקטרופורציה של תאי B הראתה ירידה קלה בבריאות הכללית של התאים (איור 2A) ב-24 שעות לאחר ההעברה. ניתוח התוויית פיזור של סמן CD19 (איור 2B) הראה ירידה של עד 83% בתאים הערוכים (איור 2C).
ניתוח TIDE של הכרומטוגרפים (איור 3A) גילה כי % indels היה דומה לאחוז אובדן החלבון על ידי ציטומטריית זרימה(איור 3B). ניתוח ציטומטריה זרימה של ניסוי KI הראה כי התאים שקיבלו וקטור AAV (איור 4), יחד עם RNP, הביעו עד 64% תאים חיוביים ל- EGFP (איור 5A) ומאוחר יותר הציגו אינטגרציה מוצלחת על ידי תגובת שרשרת פולימראז צומת (PCR) (איור 5B). ספירת תאים הראתה כי כל הדגימות התאוששו במהירות בתוך 3 ימים לאחר ההנדסה (איור 5C).

<table><tbody><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 חלבון, 500 ug</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>גודל קטן יותר זמין גם</td></tr><tr><td>Amaxa P3 תא ראשוני 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td> <td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) מאגר ליסינג</td><td>איכות ביולוגית</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap שונה כימית Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnology</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 מ"ג</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>גדלים שונים זמינים</td></tr><tr><td>Cryostor CS10, 100 מ"ל</td><td>טכנולוגיית STEMCELL</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS Immune Cell SR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאי B אנושיים EasySep</td><td>טכנולוגיית STEMCELL</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience צבע כדאיות לתיקון eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>מדיה של תאי B Excellerate, מו"פ נטול קסנו</td><td> D Systems</td><td>CCM031</td><td>B-cell בזאלי בינוני</td></tr><tr><td>פלקון 14 מ"ל פוליפרופילן צינור תחתון עגול</td><td>קורנינג</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>R& D Systems</td><td>S11550</td><td>להפשרת תאי B בלבד</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&reg; 8 רצועות 0.2 מ"ל צינורות PCR עם מכסי כיפה מחוברים בודדים</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0.0067M PBS (ללא Ca, ללא Mg) או 1x PBS</td><td>GE lifesciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D יחידת ליבה של נוקלאופקטור</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>לונזה 4D נוקלאופקטור X יחידה</td><td>לונזה</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>מגה CD40 ליגנד</td><td>אנזו מדעי החיים</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>מר פרוסטי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1562-1EA</td><td>להקפאת תאים</td></tr><tr><td>עט / סטרפטוקוק 100X</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP אנטי אנושי CD19 שיבוט HIB19</td><td>biolegend</td><td>302228</td><td>גודל קטן יותר זמין גם</td></tr><tr><td>rAAV6 SA-GFP pakaging (עם מגירת SA-GFP שלנו, ראה איור 4.)</td><td>Vigene Biosciences</td><td>N/A</td><td>אריזה בקנה מידה גדול, 1e13 GC/mL, 500 מ"ל</td></tr><tr><td>חלבון IL-10 אנושי רקומביננטי 250 ug</td><td>מו"פ D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>גדלים שונים זמינים</td></tr><tr><td>חלבון IL-15 אנושי רקומביננטי 25 ug</td><td>מו"פ & D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>גדלים שונים זמינים</td></tr><tr><td>Big Easy EasySep מגנט</td><td>טכנולוגיית STEMCELL</td><td>18001</td><td>גדלים שונים זמינים</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) מאגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

הנדסת גנום של תאי b אנושיים ראשוניים באמצעות crispr/cas9

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

תאי B הם לימפוציטים שמקורם בתאי גזע ההמטוטופיאטיים והם מרכיב מרכזי בזרוע ההומוריסטית של מערכת החיסון האדפטיבית. הם עושים מועמדים אטרקטיביים לטיפולים מבוססי תאים בגלל קלות הבידוד שלהם מדם היקפי, היכולת שלהם להתרחב במבחנה, ואת תוחלת החיים שלהם vivo. בנוסף, ניתן להשתמש בתפקוד הביולוגי התקין שלהם – כדי לייצר כמויות גדולות של נוגדנים – כדי לבטא כמויות גדולות מאוד של חלבון טיפולי, כגון נוגדן רקומביננטי למלחמה בזיהום, או אנזים לטיפול באנזימופתיות. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות לבידוד תאי B אנושיים ראשוניים מתאי מונונוקלור דם היקפיים (PBMCs) והפעלה/הרחבה של תאי B מבודדים במבחנה. לאחר מכן אנו מדגימים את השלבים הכרוכים בשימוש במערכת CRISPR/Cas9 עבור KO ספציפי לאתר של גנים אנדוגניים בתאי B. שיטה זו מאפשרת KO יעיל של גנים שונים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את הפונקציות הביולוגיות של גנים מעניינים. לאחר מכן אנו מדגימים את השלבים לשימוש במערכת CRISPR/Cas9 יחד עם וקטור רקומביננטי, הקשור לאדנו, ויראלי (rAAV) לשילוב יעיל ספציפי לאתר של קלטת ביטוי טרנסג'ין בתאי B. יחד, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה הנדסית צעד אחר צעד שניתן להשתמש בה בתאי B אנושיים ראשוניים כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים, כמו גם לפיתוח טיפולי B-cell.

פרוטוקול ההרחבה וההפעלה המעודכן איפשר התרחבות מהירה של תאי B עד פי 44 ב-7 ימים (איור 1; n =3 תורמים). בניסוי KO, ספירת תאי B באמצעות כתמים כחולים Trypan הראה יותר מ 80% תאים קיימא עם ירידה קלה בשחזור התא הן את הפקד ואת דגימות CD19 KO ב 24 שעות לאחר electroporation (איור 2A;p ≥ 0.05, n = 3 תורמים). תוצאה זו מצביעה על כך שאלקטרופורציה השפיעה מעט על הבריאות הכללית של תאי B. תאי B נאספו ביום 5 שלאחר ההעברה לניתוחי ציטומטריית זרימה ו- TIDE. חלקות פיזור מייצגות של הפק...

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להנדסת גנום מבוסס CRISPR / Cas9 של תאי B אנושיים ראשוניים לנוקאאוט גנים (KO) ו knock-in (KI) כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים בתאי B ופיתוח של טיפולי B-cell.

הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחסל במדויק גן בתאי B כדי לחקור את השפעות אובדן התפקוד של אותו גן או להכניס גן טרנס לביטוי גן טרנס יציב שיכול לשמש למטרות מחקר או טיפול. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שהיא מספקת פלטפורמה אוניברסלית המאפשרת להנדס בקלות ובדייקנות תאי B ביעילות גבוהה. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להנדס תאי B לבטא נוגדנים או אנזימים רקומביננטיים ולאחר מכן להעביר את תאי B אלה לטיפול בזיהומים או באנזימופתיה.כדי להתחיל, יש להפשיר תאי B באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. בזמן ההמתנה, העבירו שני מיליליטר של FBS מחומם מראש לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. לאחר שתאי B מופשרים לחלוטין, הוסף מיד מיליליטר אחד של FBS מחומם מראש, מבחינת טיפה, לדגימה.דוגרים בטמפרטורת החדר למשך דקה. פיפטה בעדינות כדי להשהות מחדש את הדגימה ולהעביר את כל הנפח, מבחינת טיפה, לתוך צינור חרוטי המכיל שני מיליליטר FBS מחומם מראש. הביאו את הנפח ל -15 מיליליטר עם PBS סטרילי, ואז כסו את הצינור והפכו אותו בעדינות פעמיים-שלוש.צנטריפוגה את הדגימה ב-400 פעמים G למשך חמש דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. השעו מחדש את הגלולה עם מיליליטר אחד של מדיום התפשטות תאי B מאוזן מראש וספרו את התאים. מספר התאים הכולל צריך להיות בערך 10 עד התאים השביעיים.העבירו את התאים לבקבוק המכיל 20 מיליליטר של מדיום התפשטות תאי B מאוזן מראש. הריכוז הסופי של התאים, צריך להיות בערך פי חמישה פי 10 עד התאים החמישיים למיליליטר. דגרו את הבקבוק אנכית בחממת תרבית רקמות.הכן את מצע הטרנספקציה CRISPR/Cas9 על ידי ערבוב מיקרוגרם אחד של sgRNA מהונדס כימית עם 1.5 מיקרוגרם של mRNA גרעין Cas9 מהונדס כימית לכל תגובת טרנספקציה. לשליטה, הוסף מיקרוליטר אחד של מאגר TE, במקום sgRNA, לתוך צינור של 0.2 מיליליטר של רצועת שמונה צינורות. הפעל אלקטרופורטור והכן את ריאגנטים לזיהום גרעיני.לספור ולהעביר מיליון תאי B לכל תגובת טרנספקציה, לתוך צינור חרוטי סטרילי. הביאו את הנפח ל -15 מיליליטר עם PBS סטרילי וצנטריפוגה ב -400 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט.השעו מחדש את התאים עם 10 מיליליטר PBS סטרילי וצנטריפוגה ב-400 פעמים G למשך חמש דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט לחלוטין מבלי להפריע לכדור התא. הוסף 0.5 מיקרוגרם של mRNA GFP מהונדס כימית לכל מיליון תאי B לגלולת התא. השעו מחדש את הגלולה עם 20 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ראשוני של תאים לכל מיליון תאי B וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג חמש עד שש פעמים.העבירו 20.5 מיקרוליטר לכל תגובת טרנספקציה לצינורות של 0.2 מיליליטר המכילים מגיב CRISPR/Cas9. פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת כדי לערבב ולהעביר את כל הנפח לקובט טרנספקציה. יש לכסות את הקובטה ולטפוח עליה בעדינות כדי לוודא שהנוזל מכסה את תחתית הקובטה.השתמש בפרוטוקול תאי B ראשוני אנושי באלקטרופורטור לצורך טרנספקציה. הניחו את התאים החשמליים בקובט בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן העבירו 80 מיקרוליטר של מדיום ההתפשטות של תאי B המאוזנים מראש לתגובת הטרנספקציה בקובט.מניחים את הקובט בחממת תרבית הרקמות למשך 30 דקות. צינור בעדינות את ראש הצינור כמה פעמים כדי לערבב ולהעביר את כל נפח הדגימה מהקובטה לבאר מתאימה של צלחת תרבית רקמות בת 48 בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום התפשטות תאי B. הריכוז הסופי של התאים צריך להיות מיליון תאים למיליליטר.ביצוע ניסוי דפיקת גנים, העבר וקטור ויראלי מסוג שש הקשור לאדנו רקומביננטי בריבוי של 500,000 זיהום לבאר המתאימה המכילה תאים אלקטרופורטיים. מניחים את הצלחת בחממת תרבית רקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם לחות. בניסוי הנוק-אאוט, ספירת תאי B הראתה יותר מ-80% תאים ברי קיימא עם ירידה קלה בהתאוששות התאים הן בדגימות הביקורת והן בדגימות הנוקאאוט CD19 24 שעות לאחר האלקטרופורציה.תאי B נאספו ביום החמישי לאחר הטרנספקציה לצורך זרימה ציטומטרית וניתוח גאות. תרשימי פיזור מייצגים של דגימות הבקרה והנוקאאוט הראו 14 ו-95% תאים שליליים CD19 בהתאמה, מה שמדגים ירידה משמעותית בביטוי CD19 בדגימות הנוק-אאוט. כרומטוגרמות של ריצוף גנומי הראו שיאים כפולים בתאי ה-CD19 נוק-אאוט, מה שמצביע על החדרה או מחיקה של נוקלאוטידים לאחר הפסקות דו-גדיליות בתיווך CRISPR/Cas9.ניתוח אינדל של הכרומטוגרפים של דגימות הנוקאאוט הראה אחוז גבוה של היווצרות אינדל בלוקוס CD19, מה שעולה בקנה אחד עם אחוז אובדן חלבון CD19 שזוהה על ידי ציטומטריית זרימה. תאי B מניסוי הדפיקה נאספו ביום ה-12, לאחר ההנדסה. תרשימי פיזור הראו 64% מהתאים החיוביים ל-EGFP בדגימה שקיבלו את הווקטור הנגיפי מסוג שש הקשור לאדנו, יחד עם RNP, בעוד שלא נצפתה חיובית EGFP או מינימלית בדגימות הבקרה והוקטור בלבד בהתאמה.הגברת PCR בצומת, הראתה אמפליקונים של זוג 1.5 קילו-בסיס בדגימת הדפיקה ולא נצפה תוצר PCR בדגימת הבקרה או הווקטור בלבד. ספירת תאים הראתה כי התהליך ההנדסי משפיע על התאוששות התאים בדגימת הדפיקה יותר מאשר דגימות הבקרה או הווקטור בלבד. עם זאת, כל הדגימות התאוששו במהירות תוך שלושה ימים לאחר ההנדסה.ניתן להשתמש בהליך זה גם כדי להציג סוכני עורך בסיס לשינוי זוגות בסיסים בודדים על מנת לגרום או לתקן מוטציות נקודתיות בודדות בגנום של תאי B. זה יכול לשמש גם להכנסת קודוני עצירה מוקדמים או לשינוי אתרי אחוי, מה שמאפשר נוקאאוט של גנים מרובים ללא סיכון לטרנסלוקציות כרומוזומליות. לפני פיתוח טכניקה זו, הנדסת תאי B אנושיים תשאל את השימוש בגישות אחרות של הנדסת גנים מאתגרות יותר.טכניקה זו היא אלטרנטיבה קלה, פחות יקרה ומהירה יותר. זה יכול לשמש גם לסינתזה של מוצרי טיפול תאי לשימוש קליני.

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שינוי גנטי ראשי או מורחב האנושי הטבעיים (NK) תאים הרוצח באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). באמצעות פרוטוקול זה, אנו להפיק תאי NK אדם חסר צורה של קולטן גורם גדילה – b 2 (TGFBR2), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

אסטרטגיות חדשניות למודל נאמן של מוטציות סומטיות בתאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) נחוצות כדי לחקור טוב יותר ביולוגיה של תאי גזע המטופויאטיים וממאירויות המטולוגיות. כאן מתואר פרוטוקול למודל מוטציות רווח הטרוזיגוטיות ב-HSPCs על ידי שילוב השימוש ב-CRISPR/Cas9 והתמרה כפולה של תורמי rAAV.

הנדסת מוטציות הטרוזיגוטיות אונקוגניות בתאי גזע המטופויאטיים אנושיים ובתאי אב

פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.

שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA

קו התאים THP-1 נמצא בשימוש נרחב כמודל לחקירת התפקודים של מונוציטים/מקרופאגים אנושיים בתחומי מחקר שונים הקשורים לביולוגיה. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הנדסה יעילה מבוססת CRISPR-Cas9 ובידוד שיבוטים של תא יחיד, המאפשר ייצור של נתונים פנוטיפיים חסונים וניתנים לשחזור.

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

פרוטוקול מפורט מסופק לשימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 כדי להשיג דפיקה ממוקדת יעילה ביותר של מבנים גדולים ומולטי-ציסטרוניים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות מסלול תיקון ה-DNA בתיווך הומולוגיה (HMEJ). תאי T המהונדסים עם פרוטוקול זה הניתן להתאמה ל-cGMP שומרים על התרחבות תאים מצוינת, ציטוטוקסיות וייצור ציטוקינים.

הנדסה לא ויראלית של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות אינטגרציה ממוקדת בתיווך הומולוגיה של תבניות DNA גדולות

למד הנדסת גנום בCRISPR/Cas9 בתאי B אנושיים ראשוניים לחקר פונקציות גנים ופיתוח תרפיות. השיטה מאפשרת מחיקה והכנסת גנים ביעילות גבוהה לחקר ביולוגיה של תאי B.

הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

גלה סרטונים נוספים