무작위 마이크로시드 매트릭스 스크리닝을 사용하여 I3C로 단백질 결정의 파생
2021년 1월 16일
이 문서는 희소성 매트릭스 스크린에서 새로운 결정화 조건을 생성하기 위하여 마이크로 시드를 사용하여 I3C (5-아미노-2,4,6-트리오도이소프탈산)로 파생된 단백질 결정을 생성하는 방법을 제시합니다. 트레이는 액체 디스펜싱 로봇을 사용하거나 손으로 설정할 수 있습니다.
이는 단백질 결정의 성장을 최적화하는 동시에 선 결정학에 의한 단백질구조를 결정하기 위해 적시 분자로 단백질을 유도하도록 설계된 결정화 프로토콜이다. 완전히 새로운 단백질의 X선 결정 구조를 결정하기 위해 결정화 조건은 고품질의 결정을 생성하도록 최적화됩니다. 완전히 새로운 단백질의 경우, 무거운 원자는 생성 된 결정을 생성하기 위해 결정으로 도입 될 필요가있다.
X선 회절 데이터는 파생된 결정으로부터 수집되며 X선 결정 구조를 생성하기 위해 계산적으로 해결해야 합니다. 결정화 및 파생은 모두 힘든 과정입니다. 이러한 병목 현상을 해결하기 위해 이러한 두 가지 목표를 동시에 달성하는 최적화된 선별 절차를 고안했습니다.
이 프로토콜은 무작위 마이크로시드 매트릭스 스크리닝으로 알려진 이전에 개발된 기술을 사용합니다. 결정 또는 결정 침전은 완전히 독립적인 조건에서 결정 성장을 시작하는 데 사용할 수있는 마이크로 시드로 분쇄됩니다. 동시에, 우리는 결정화 조건에 I3C에게 불린 해면 분자를 소개합니다.
이 분자는 단일 파장 비정상적인 토론 단계에서 구조를 해결할 수 있게 하는 큰 비정상적인 신호를 제공합니다. 결정 구조의 실험적 크기 조정에 익숙하지 않은 사용자를 위해 I3C의 비정상적인 신호를 사용하기 위해 조정하는 구조 솔루션을 부분적으로 자동화하는 사용자 친화적인 소프트웨어 파이프라인을 제공합니다. 첫 번째 단계는 I3C 주식을 만드는 것입니다.
마이크로 센심 분리기 튜브에 I3C의 120 밀리그램을 측정합니다. 마이크로센심분리기 튜브에 2개의 어금니 리튬 수산화제 200마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 40~60도로 가열하고 용해를 장려하는 데 사용할 수 있습니다.
리튬 I3C 용액의 하나의 어금니 스톡은 갈색이어야 합니다. 단백질 육수에 I3C를 도입하는 두 가지 방법을 사용할 수 있다. 리튬 I3C는 단백질 육수에 직접 첨가할 수 있다.
I3C의 30 마이크로리터에 3.75 마이크로리터를 첨가할 수 있는 150마이크로리터의 단백질은 5~14밀리머사이의 농도를 제공합니다. 일부 단백질은 I3C의 고농도와 접촉하면 침전될 수 있습니다. 이러한 경우, 리튬 I3C는 10-80 밀리머 사이의 최종 농도로 샘플 단백질과 일치하는 완충제 단백질 희석 완충제에 첨가될 수 있다.
단백질 희석 완충제 150마이크로리터를 단백질 샘플 150마이크로리터에 추가합니다. 크리스탈을 분쇄하는 유리 프로브는 유리 파스퇴르 파이펫으로 만들어집니다. 파란 불꽃에 분센 버너를 장착하고 파스퇴르 파이펫을 가운데쪽으로 가열합니다.
핀셋 을 사용하여 파스퇴르 파이펫의 끝을 0.3 밀리미터 미만의 얇은 직경으로 당깁니다. 이 시점에서 파이펫을 분리하기 위해 화염에 그 세그먼트를 잡고 유리 프로브를 완료하기 위해 파이펫의 끝을 둥글게 합니다. 이것은 유리 파이펫이 어떻게 보이는지의 예입니다.
크리스탈 분쇄는 또한 단백질 결정 또는 결정 침전을 분쇄하여 생성되는 자신의 A 마이크로 시드 주식을 만들기위한 대안으로 타사 공급 업체에서 주문 할 수 있습니다. 얼음 위에 5 개의 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브를 놓습니다. 가벼운 현미경에서, 희생될 수 있는 제일 형태 결정 또는 결정 침전을 선택하십시오.
96 개의 잘 결정화 트레이는 플라스틱 밀봉 테이프를 절단하여 우물을 엽니 다. 드롭 트레이를 걸수 있도록 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거하고 평평한 표면에 반전할 수 있습니다. 70 마이크로리터의 저수지 용액을 마이크로센심분리기 튜브 중 하나에 옮기고 얼음을 식힙니다.
나머지 튜브에 저수지 용액 90 마이크로리터를 옮기고 얼음으로 돌아가 서늘하게 됩니다. 저수지 부피가 부족한 경우 결정화 저장소는 적절한 시약을 혼합하여 제조될 수 있으며 대신 사용할 수 있다. 유리 프로브를 사용하여 결정화 낙하에 있는 결정을 철저히 분쇄합니다.
결정이나 결정 물질이 보이지 않을 때까지 현미경으로 진행상황을 모니터링할 수 있다. 모든 액체를 낙하에서 70 마이크로리터의 저수지 용액을 포함하는 미세 원심분리기 튜브로 이송합니다. 위아래로 파이프를 통해 섞는다.
혼합물의 2~3마이크로리터를 다시 우물로 옮기고 위아래로 배관하여 우물을 헹구는 다. 혼합물을 마이크로원심분리기 튜브로 다시 전달합니다. 이 헹도 단계는 다시 한 번 반복되어야 합니다.
마이크로 원심 분리기 튜브는 마이크로 시드를 녹이지 않도록이 시점부터 차갑게 유지해야합니다. 과열을 방지하기 위해 정기적으로 얼음에 튜브를 냉각 약 3 분 동안 최대 속도로 튜브를 소용돌이. 냉장 저수지 용액 사이에 10 마이크로리터를 순차적으로 전송하여 종자 주식의 10 개의 직렬 희석 중 하나를 만듭니다.
종자 주식 희석 사이에 튜브는 소용돌이해야합니다. 즉시 사용되지 않는 종자 주식은 영하 80도 초냉냉동실에 보관해야 합니다. 96 잘 무작위 마이크로 시드 매트릭스 스크린은 액체 디스펜싱 로봇을 사용하여 설정할 수 있습니다.
종자 육수, I3C로 보충된 단백질 스톡 용액및 결정화 화면을 로봇에 놓습니다. 로봇 을 사용하여 결정화 화면에서 96 웰 트레이로 75 마이크로 리터를 전송합니다. 결정화 강하에 마이크로리터 1개, 저수지에 74마이크로리터를 추가합니다.
I3C로 보충된 단백질의 마이크로리터 1개를 결정화 드롭으로 옮기다. 종자 주식의 0.1 마이크로리터를 결정화 낙하로 옮기. 밀봉 테이프를 사용하여 접시를 밀봉하십시오.
매달려 있는 드롭 스크린은 24개의 잘 매달려 있는 낙하 결정화 트레이에 설치할 수 있습니다. 매달려 있는 낙하 우물의 가장자리를 기름칠합니다. 결정화 용액 500마이크로리터를 저수지로 옮기.
유리 커버 슬라이드의 중앙 근처에 결정화 용액의 마이크로 리터 드롭 을 배치합니다. 이 드롭에, 리튬 I3C와 종자 주식의 0.1 마이크로 리터로 보충 단백질의 마이크로 리터 를 추가합니다. 커버 슬라이드를 반전시키고 커버 슬라이드를 그리스로 밀어 결정화를 잘 밀봉합니다.
매달려 있는 낙하 및 밀봉 낙하 트레이는 일정한 온도에서 배양되어 결정이 형성될 수 있습니다. 그들은 정기적으로 결정 성장을위한 현미경으로 검사해야합니다. 동반 서면 프로토콜에 설명된 대로 회절 데이터를 획득, 통합 및 배율화한 후, 자동 인력거 자동 결정 구조 결정 파이프라인을 사용하여 위상 문제를 해결하고 단백질을 모델링할 수 있다.
자동 인력거 방문 페이지에서 진행 버튼을 클릭합니다. 자동 인력거 웹 양식에서 기관 이메일을 입력하고 자동 인력거 실행 진행을 클릭합니다. 호모로지 모토 템플릿이없는 단백질의 경우 고급 모드에서 자동 인력쇼의 SAD 프로토콜을 실행합니다.
필요한 매개 변수를 입력합니다. 분자 유형으로 단백질을 선택합니다. 앙스트롬의 데이터 수집 파장을 입력합니다.
그래서 요오드 원자가 사용되었음을 나타내는 하위 구조 요소로 나는 좋아한다. I3C가 변조 분자였음을 나타내기 위해 I3C 하위 구조 유형을 선택합니다. sub_direct 하위 구조 결정 방법으로 선택합니다.
모노머당 예상 하위 구조 수로 세 가지를 선택합니다. 하위 구조 검색의 예약 차단으로 하나를 입력합니다. 이를 통해 자동 인력거는 적절한 해상도 컷오프를 자동으로 결정할 수 있습니다.
매튜스 계수를 기반으로 하는 비대칭 단위의 단일 단량, 데이터 세트의 공간 그룹 및 분자 수에 잔류물의 수를 입력합니다. 필요에 맞는 적절한 보급 수준의 X-ray 데이터를 선택합니다. 비정상적인 데이터를 빈 집합 파일로 입력합니다.
단백질 서열을 SEQ, PIR 또는 TXT 파일로 입력합니다. 기관 이메일 주소를 입력합니다. 결과는 제공된 이메일 주소로 전송된 웹 링크를 통해 귀하에게 전달됩니다.
자동 인력거가 하위 구조를 검증하는 결정된 하위 구조를 사용하여 구조를 해결하지 못하면 구조 해결을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자동 인력거 결과 페이지에서 무거운 원자 사이트 목록을 다운로드합니다. 그것은 무거운 원자 사이트라는 하이퍼 링크입니다.
이렇게 하면 무거운 원자 사이트가 있는 텍스트 파일이 다운로드됩니다. 파일의 파일 확장을 txt에서 pdb로 변경합니다. 쿠트에서 pdb 파일을 엽니다.
대칭을 켜서 인접한 비대칭 단위의 모든 무거운 원자를 확인합니다. 비대칭 단위를 포함하여 무거운 원자 사이의 거리를 측정합니다. I3C는 6개의 협스트롬의 측면 길이를 가진 동등한 삼각형으로 나타납니다.
이러한 치수가 있는 삼각형의 존재는 무거운 원자의 배치가 정확하다는 것을 나타냅니다. 자동 인력거 실행 하위 구조가 잘못된 경우 다른 자동 인력거 설정을 서면 프로토콜에서 설명한 대로 테스트할 수 있습니다. I3C RMMS 방법은 햄프턴 연구에서 HT 스크린과 박테리오파지 P68로부터 Orf11 리신 단백질의 도메인을 사용하여 두 가지 단백질, 암탉 달걀 흰자 리소지메에 대해 테스트하였다.
I3C 나 마이크로 시드없이 제어 화면에 대응하는 각 단백질에 대한 전체 화면이 설정되었으며, 마이크로 시드가 추가된 화면, I3C로 화면, 마지막으로 I3C 및 마이크로 시드로 화면을 설정했습니다. 결정 스크린에 I3C를 추가하면 결정화 안타 수가 증가하지 않는 것으로 나타나지 않습니다. 암탉 달걀 흰자 리소지메로, 조건의 수는 31에서 26로 떨어졌다.
Orf11 도메인을 사용하면 제어 화면에서 단일 히트 조건이 발견되었습니다. 화면에 I3C를 추가하면 동일한 조건에서 단일 히트가 있었습니다. 마이크로시드를 우물에 첨가하면 적중 조건의 수가 크게 증가하여 암탉 알 백설및 Orf11 도메인에 대해 각각 2.1 배 및 6 배 증가가 발생했습니다.
이 결과는 RMMS를 테스트하는 다른 연구 와 일치합니다. 가장 중요한 것은, 화면에 I3C와 마이크로시드를 추가하는 것은 또한 암탉 달걀 흰자 리소지메및 Orf11 도메인에 대해 각각 2.3 및 7 배 증가를 보여주는 제어 스크린에 비해 적중 조건의 수를 증가시다. 이는 I3C RMMS 방법이 도출된 결정을 위한 새로운 조건을 효율적으로 생성할 수 있음을 보여줍니다.
이러한 조건에서 결정은 수확하고 결정 구조를 해결하기 위해 사용될 수있다. 암탉 달걀 흰자 림프 Orf11 도메인의 구조는 I3C RMMS 화면에 의해 성공적인 파생을 보여주는 I3C의 비정상적인 신호를 사용하여 자동 인력거 파이프 라인에서 슬픈 태싱으로 해결할 수 있습니다. 우리는 Phasing 분자 I3C로 파생된 고품질 결정을 생성하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시했습니다.
그것은 스크린과 결정 처리 단계의 수를 최소화하고, 따라서 새로운 단백질을 공부하는 구조 생물학자에 특히 관심. 종자 재고 제조 중에 만들어진 다른 종자 육주 희석을 테스트하여 결정 크기를 최적화하는 것이 좋습니다. 그리고 이 단계는 초기 화면이 완료된 후에 완료됩니다.
I3C는 널리 사용할 수 있으며 구입하는 것이 저렴하므로이 방법은 대부분의 구조 생물학 실험실의 범위 내에 있다고 생각합니다.
개요
이 기사는 단백질 결정의 성장을 최적화하는 동시에 I3C를 사용하여 엑스선 결정학을 위한 유도체화 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 결정화 조건을 향상시키기 위해 무작위 마이크로시드 매트릭스 스크리닝을 사용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 단백질 결정화
- 엑스선 결정학
- 구조 생물학
배경
- 결정화는 단백질 구조를 결정하는 데 필수적입니다.
- 엑스선 결정학에서 위상 결정을 위해 무거운 원자로 유도체화가 필요합니다.
- 기존 방법은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요될 수 있습니다.
- 마이크로시딩 기술은 결정화 결과를 향상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- 단백질 결정화 및 유도체화를 위한 간소화된 프로토콜을 개발합니다.
- 위상 결정을 향상시키기 위해 I3C를 위상 결정 분자로 도입합니다.
- 구조 해법을 위한 사용자 친화적인 소프트웨어 파이프라인을 제공합니다.
사용된 방법
- I3C 주식 용액의 준비.
- 마이크로시드를 만들기 위해 단백질 결정을 분쇄합니다.
- 액체 분배 로봇을 사용하여 결정화 스크린을 설정합니다.
- 결정 성장을 모니터링하고 조건을 최적화합니다.
주요 결과
- 유도체화된 단백질 결정의 성공적인 생성.
- 마이크로시딩을 통한 개선된 결정화 조건.
- 엑스선 결정학에서 위상 결정에 I3C를 효과적으로 사용합니다.
- 구조 해법 프로세스의 일부를 자동화합니다.
결론
- 이 프로토콜은 단백질 결정화의 효율성을 향상시킵니다.
- 마이크로시딩은 얻은 결정의 품질을 크게 향상시킵니다.
- I3C는 구조 결정을 위한 효과적인 위상 결정제로 작용합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in structural biology by combining protein crystallization with heavy-atom derivatization to enable experimental phasing for novel targets. By integrating random microseed matrix screening with I3C derivatization, it reduces the number of discrete steps required to obtain phase information, accelerating early-stage target validation. The approach supports de-risking of structural hypotheses in discovery pipelines where homology models are unavailable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables experimental phasing for novel proteins lacking homology models, supporting target validation through direct structure determination.
- Operational Value: Combines crystallization and derivatization in a single workflow, reducing hands-on time and sample handling.
- Predictive Value: The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows rapid validation of the anomalous substructure, increasing confidence in phased models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates derivatized crystal hits suitable for downstream data collection and phasing, enabling reliable electron density maps.
- Operational Value: Uses liquid dispensing robots to set up 96-well random microseed matrix screens, improving reproducibility and throughput.
- Scalability: Microseed stocks can be serially diluted and stored at -80°C, allowing reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a path from crystallization to automated structure solution via the Auto-Rickshaw pipeline, supporting preclinical target characterization.
- Mechanistic De-risking: Successful SAD phasing using I3C-derived anomalous signal validates the structural model, reducing uncertainty in target mechanism.
- Disease-Relevant System: Demonstrated on hen egg white lysozyme and Orf11 lysin domain, showing applicability to diverse protein classes including antimicrobial targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking crystallization to structure solution for targets requiring experimental phasing, particularly when computational methods fail due to lack of templates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D structure determination of novel proteins, clarifying binding sites and domain architecture.
- Screening: Produces reproducible crystallization conditions through microseeding, increasing hit rates for derivatized crystals as shown by 2.3- to 7-fold improvements over controls.
- Analytics: Outputs anomalous diffraction data suitable for SAD phasing, with substructure validation via I3C’s characteristic six-angstrom equilateral triangle.
- Translational Research: Connects to downstream validation through automated model building in Auto-Rickshaw, enabling progression to preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Microseed stocks and I3C protocols are standardized and storable, supporting platform reuse across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides experimental phase information, reducing reliance on molecular replacement and increasing success rate for novel targets.
- Operational Value: Streamlines workflow by combining two labor-intensive steps (crystallization and derivatization) into one integrated screen.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by enabling rapid structure determination.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target selection through high-quality, phased structures, supporting risk-adjusted advancement.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallization, microseeding, and handling of heavy atom compounds is required.
- Access to liquid dispensing robots, X-ray diffraction equipment, and structure solution software (Auto-Rickshaw, Coot) is necessary.
- Standardization across teams benefits from predefined I3C stock protocols and microseed storage procedures.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of I3C concentration to avoid precipitation, as noted for sensitive targets.
- Practical limitations include the need for initial crystal or precipitate to generate microseeds and the dependence on sufficient anomalous signal for SAD phasing.
