건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리
2021년 5월 16일
조직 제거의 세련된 방법이 개발되어 성인 마우스 심장에 적용되었습니다. 이 방법은 유전 기자 전략에 기인하는 표시된 섬유아세포 형광을 유지하면서 조밀한, 자동 형광 심장 조직을 취소하도록 설계되었습니다.
이 새로운 조직 청산 프로토콜은 심장의 특정 세포 유형과 부상 조건 하에서의 행동을 보다 정확하게 볼 수 있도록 기존 기술을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 빠르고 매우 간단합니다. 그것은 세포 또는 조직 염색을 요구하지 않고 배경 조직 자동 형광으로부터 최소한의 간섭으로 마르카 형광의 유지를 허용합니다.
실험 마우스의 복부 표면을 청소하기 위해 70 % 에탄올에 젖은 거즈 패드를 사용하여 시작합니다. 외과 가위를 사용하여 3센티미터 횡단 절개를 하고, 심경외 공정 아래 약 3미터를 만들고, 복부에서 심도 혈관 으로 마우스를 변형하여 기본 복벽 조직으로부터 피부를 분리합니다. 피하 복벽 조직에서 2센티미터 횡단 절개를 하고, 시포이드 프로세스 아래 3센티미터를 만들고, 이 절개에서 부터 흉곽을 통해 중간선을 가로지르는 수직 절단을 합니다.
흉곽을 다시 고정하여 심장을 드러내게 합니다. 그리고 우수한 베나 카바와 대오르타에 차가운 PBS를 주입하는 27 게이지 바늘이 장착 된 10 밀리리터 주사기를 사용합니다. 모든 혈액이 심장에서 플러시되었을 때, 우수한 베나 카바와 대르타에 감기 4%PFA의 10 밀리리터를 전달하여 고정 과정을 시작합니다.
모든 고정이 번쩍이면 심장을 절제하고 직선 블레이드 메스를 사용하여 아리아, 오른쪽 심실 및 중격 및 좌심실을 분리합니다. 심장을 차가운 4%PFA의 15밀리리터 원추형 튜브에 넣고 영양사에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양을 합니다. 다음 아침, 0.25%의 사진 시니에이터 용액을 신선하게 준비된 하이드로겔 용액에 추가하고 심장을 하이드로 젤로 옮다.
원류관을 호일로 감싸서 육체적 인 교란없이 섭씨 4도에서 하룻밤 잠복합니다. 다음날 아침, 37도의 비드 욕조에서 튜브를 따뜻하게 한 후 2.5시간 동안 포셉을 사용하여 심혼을 PBS의 15밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮기습니다. PBS에서 3시간 동안 세척당 37도에서 세척을 하고 심장을 활성 전기포고기의 바구니에 옮겨 넣습니다.
뚜껑을 제자리에 고정하고 활성 전기 전광실 저장소를 전기전도 청산 용액으로 채웁니다. 챔버가 가득 차면 바구니를 용액에 담그고 전기 전광 기계의 캡을 제자리에 조입니다. 그런 다음 전기 전도 기계를 1.5 암페어와 섭씨 37도에서 1.5 시간 동안 실행합니다.
전기 전구 후, 불투명 한 조직이 남아 있는지 확인하기 위해 심장의 시각적으로 확인합니다. 클리어드 하트를 15밀리리터 2개로 1시간 동안 신선한 PBS에서 1시간 동안 3회 씻어 내고, 견과류에서 세척당 섭씨 37도에 씻어내면 됩니다. 헴 자동 형광을 줄이기 위해 탈색 제에서 심장을 잠수하기 전에.
48 시간 후에, 입증된 대로 PBS에서 심혼을 세 번 씻고 화상 진찰의 앞에 48 시간 동안 신선하게 준비된 RIMS에서 심혼을 평형합니다. 클리어된 심장의 3D 이미징의 경우 먼저, 3D 인쇄 된 바닥 저장소의 바닥에 진공 그리스의 얇은 층을 배치, 샘플이 이미지되는 것과 동일한 높이. RIMS로 저장소를 채우고 파이펫 팁을 사용하여 거품을 제거합니다.
왼쪽 심실 벽이 위를 향하게 하여 림에 심장을 조심스럽게 배치하여 용액에 거품이 도입되지 않도록 주의하십시오. 진공 그리스를 사용하여 3D 인쇄 된 상단 저수지 조각의 하단 표면에 유리 커버 슬립을 부착하고 상단 저수지 덮개를 바닥 저수지에 내려 놓고 거품을 피하십시오. 그런 다음 상단 저수지를 글리세롤로 채웁니다.
공초점 현미경을 사용하여 클리어된 하트를 이미지화합니다. 정제 된 심장 조직 클리어링과 3D 이미징을 결합하면 심장 섬유 아세포의 고급 세부 시각화가 가능합니다. 이 화상 진찰 기술을 사용하여, 섬유 아세포는 조밀하게 포장되고 부상당한 심혼에 있는 스핀들 형태를 가지고 있는 것을 관찰됩니다.
허혈 재관류 부상 후, 심장 섬유아세포의 손실은 부상 후 처음 3 일 동안 허혈 성 지역에서 볼 수 있습니다. 7일과 14일까지, 섬유아세포는 부상당한 조직 지역을 다시 채우기 위하여 이주하거나 증식했습니다. 28일째까지 심장의 부상당한 지역을 둘러싼 심장 섬유아세포 개체수가 가장 큰 밀도에 있습니다.
심근 경색 부상 후 1 일 반 동안 부상당한 왼쪽 심실 안에 남아있는 섬유 아세포는 거의 없습니다. 그러나 3일째에는 섬유아세포가 확장되어 대부분의 좌심실에 존재합니다. 허혈 수술과는 달리, 몇 주 동안 안지오텐신 2와 페놀프린의 주입은 심장 조직 손실과 벽 숱이 초래하지 않습니다.
대신, 섬유아세포는 조직 청산 프로토콜에 정제된 것을 사용할 때 볼 수 있는 오른손잡이 나선 수축 패턴의 축을 따라 정렬한다. 또한, 안지오텐신 2와 페놀프린 치료 후, 섬유아세포는 허혈성 재현 및 심근 경색 손상의 모델에서 관찰된 스핀들 모양과 반대로 작고 둥근 것처럼 보입니다. 전광 제거는 특히 부상 프로토콜을 받은 하트로 작업할 때 신중하게 수행되어야 합니다.
이 프로토콜은 심장 섬유아세포가 생체 내 부상에 어떻게 반응하는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 형광 마커는 또한 심장이 세포 수준에서 상해에 어떻게 반응하는지 이해하기 위하여 이용될 수 있습니다.
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개요
배경 자가형광을 최소화하면서 특정 세포 유형을 시각화할 수 있는 성인 마우스 심장을 위한 개선된 조직 클리어링 방법이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 심장 조직 연구를 위한 기존 기술을 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 심혈관 생물학
- 조직 공학
배경
- 조직 클리어링 기술은 밀도 높은 생물학적 조직을 이미지화하는 데 필수적입니다.
- 자가형광은 이미지 연구에서 특정 세포 신호를 가릴 수 있습니다.
- 표지된 세포의 형광을 유지하는 것이 정확한 분석을 위해 중요합니다.
- 기존 방법은 염색을 필요로 할 수 있어 과정을 복잡하게 만듭니다.
연구 목적
- 빠르고 간단한 조직 클리어링 프로토콜을 개발합니다.
- 심장 조직에서 섬유아세포 형광의 시각화를 개선합니다.
- 자가형광으로 인한 배경 간섭을 줄입니다.
사용된 방법
- 마우스의 배쪽 표면 청소를 위해 70% 에탄올을 사용했습니다.
- 심장에 접근하기 위해 외과적 절개를 수행했습니다.
- 심장 조직에 새로운 클리어링 프로토콜을 적용했습니다.
- 염색 없이 marca 형광을 유지했습니다.
주요 결과
- 새로운 프로토콜은 밀도 높은 심장 조직을 효과적으로 클리어했습니다.
- 절차 중에 섬유아세포 형광이 보존되었습니다.
- 배경 자가형광이 현저히 감소되었습니다.
- 이 방법은 심장 세포의 더 나은 생체 내 이미지화를 가능하게 합니다.
결론
- 이 개선된 방법은 심장 조직 연구를 향상시킵니다.
- 심장 손상 반응을 연구하는 연구자들에게 귀중한 도구를 제공합니다.
- 이 프로토콜은 효율적이며 추가 염색의 필요성을 최소화합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding cardiac fibroblast dynamics in three dimensions provides critical insights into fibrosis mechanisms that drive ventricular stiffness and heart failure progression. This refined CLARITY-based tissue clearing approach enables high-fidelity, whole-organ visualization of fibroblast behavior without antibody penetration limitations or fluorescence loss, supporting mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. The method offers predictive value by revealing spatially resolved fibroblast responses to ischemic and non-ischemic injury models, informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast localization and morphology in intact tissue to clarify pathogenic versus reparative roles in cardiac fibrosis.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic fibroblast labeling (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) to spatial phenotypes in healthy and injured hearts.
- Predictive Confidence: Reveals injury-specific fibroblast patterns—such as aligned bands post-angiotensin II/phenylephrine or repopulation from border zones post-ischemia—to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces cleared, fluorescently labeled hearts compatible with confocal imaging for quantitative 3D analysis of fibroblast density, distribution, and morphology.
- Reproducibility: Standardized electrophoresis-based clearing (1.5 amps, 37°C, 1.5 hours) and RIMS equilibration ensure consistent tissue optical properties across experimental groups.
- Scalability: Compatible with multi-sample processing in active electrophoresis chambers, enabling side-by-side comparison of control, ischemic, and hypertensive injury models.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Captures fibroblast responses in models mimicking human ischemic injury (reperfusion) and pressure overload (angiotensin II/phenylephrine), aligning with clinical fibrosis phenotypes.
- Translational Continuity: Tracks fibroblast death, border zone repopulation, and density peaks at day 28 post-ischemia—key temporal windows for antifibrotic intervention testing.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes pro-fibrotic spindle-shaped fibroblasts in ischemia from small, rounded phenotypes in hypertension, informing target-specific pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing spatially resolved phenotypic data that bridges in vitro findings and functional outcomes in preclinical models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of fibroblast activation, migration, and proliferation in 3D tissue context, clarifying pathway-level contributions to fibrosis.
- Screening: Generates quantitative imaging outputs (fibroblast density, alignment, morphology) suitable for high-content analysis in compound screening cascades.
- Analytics: Supports morphometric and spatial statistical analysis of fibroblast networks, enabling comparison across genotypes, injuries, and time points.
- Translational Research: Links fibroblast dynamics to ventricular remodeling timelines, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue clearing and imaging platform applicable to multiple cardiovascular disease models and cell types beyond fibroblasts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in fibroblast function by preserving native tissue architecture and fluorescent signal integrity.
- Operational Value: Eliminates need for sectioning and staining, reducing workflow variability and increasing throughput for 3D phenotyping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by revealing on-target fibroblast responses that predict functional outcomes in heart failure models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antifibrotic targets based on spatially validated target engagement and phenotypic modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery, perfusion fixation, and hydrogel-based tissue clearing techniques.
- Dependent on access to active electrophoresis equipment, confocal microscopy, and RIMS/glycerol mounting solutions.
- Necessitates standardization of clearing duration and temperature to prevent over-clearing or autofluorescence in injured tissue.
- Adaptation to other disease models may require optimization of decolorization time to reduce heme-derived background without quenching GFP signal.
- Practical limitation: Long-term imaging stability depends on proper RIMS equilibration to prevent refractive index mismatch and signal degradation.
