Name: 건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 학습하세요 정제된 CLARITY 조직 투명화 기법으로 마우스 심장의 3차원 섬유아세포 조직을 관찰하는 방법. 이 프로토콜은 배경 자가형광을 최소화하면서 심장 손상 반응을 연구하는 데 효과적입니다.

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저자는 이 모형의 발달에 있는 그들의 원조 그리고 지도에 대한 CCHMC Confocal 화상 진찰 코어를 인정하고 싶습니다, 뿐 아니라 모든 3D 인쇄된 부분의 디자인을 위한 임상 공학에서 매트 바티. Demetria Fischesser는 건강의 국가 학회에서 교육 교부금에 의해 지원되었다, (NHLBI, T32 HL125204) 그리고 제프리 D. 몰켄틴하워드 휴즈 의료 연구소에 의해 지원되었다.

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이 문서는 생체 내에서 심장 섬유아세포의 시각화를 허용하는 조직 정리를 위한 정제된 방법을 제시합니다, 기준선과 다음 상해둘 다, 마우스 심혼에 있는 섬유아세포를 특성화하고 더 잘 이해하기 위하여. 이러한 향상된 프로토콜은 성인 또는 신생아 심장12,13,14,16,17,20에서특정 세포 유형을 식별하려고 시도한 기존 조직 청산프로토콜의 한계를다룹니다. 마우스 심혼을 지우려는 초기 시도에서, 수동 적인 CLARITY 기술이 사용되었고, 여기서 심장은조직(15,18)에걸쳐 버퍼...

심근 세포는 심혼에 있는 가장 큰 부피 분획을 포함하더라도, 심장 섬유아세포는 더 풍부하고 이 기관의 기준선 구조 및 배상 특징을 통제에 비판적으로 관련시게 관련시게 관련시다. 심장 섬유아세포는 이동성이 뛰어나고 기계적으로 반응하며, 활성화 정도에 따라 전형적으로 다양합니다. 심장 섬유아세포는 세포외 매트릭스(ECM)의 정상 수준을 유지하는 데 필요하며, 이들 세포에 의한 ECM 생산량이 너무 적거나 너무 많으며 질병1,2,3로이어질 수 있다. 질병에 그들의 중요성을 감안할 때,심장 섬유세포는 특히 과도한 섬유증4,5,6,7을제한하는 시도에서 새로운 치료 전략을 식별하는 쪽으로 조사의 점점 더 중요한 주제가되고 있습니다. 부상 시 섬유아세포는 증식및 풍부한 ECM을 분비할 수 있을 뿐만 아니라 심실을 리모델링하는 데 도움이 되는 수축 활성을 갖는 근섬유세포로 알려진 합성 세포 유형으로 활성화되고 분화합니다.
심장 섬유아세포는 2-D 배양6,8,9,10에서그들의 성질을 광범위하게 평가되었지만, 기준선이나 질병 자극으로 3-D 살아있는 심장의 특성과 역학을 훨씬 적게 이해한다. 여기서, Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer 유전 기자 시스템으로 표지된 섬유아세포의 형광을 유지하면서 성인 마우스 심장을 지우는 조직에 정제된 방법이 기재되어 있다. 심장 내에서, Tcf21은 정지 섬유아세포4의비교적 구체적인 마커이다. 타목시펜이 유도성 MerCreMer 단백질을 활성화하도록 주어진 후, 본질적으로 모든 정지 섬유아세포는 Rosa26 메뚜기에서 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 영구적으로 발현하여 생체 내에서 추적할 수 있게 합니다.
수많은 잘 확립 된 조직 청산 프로토콜이 존재하며, 그 중 일부는 심장11,12,13,14,15,16,17에적용되었습니다. 그러나, 상이한 조직 청산 프로토콜에 사용되는 시약의 대부분은 내인성 형광신호(18)를담금질하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 성인 심장은자가형광(19)을생성하는 풍부한 헴 그룹 함유 단백질로 인해 클리어하기 어렵다. 따라서, 본 프로토콜의 목표는 생체내12,13,14,16,17,20에서최적의 3D 시각화를 위해 부상당한 성인 심장에서 헤메 자동 형광의 동시억제와함께 섬유아세포 마커 형광을 보존하는 것이었다.
생체 내에서 심장 섬유아세포를 검사하려고 시도하는 이전 연구는 이러한 연구가 항체 침투 및 심장 혈관구조14,16,17,20에의해 제한되었지만 이러한 세포를 라벨에 부착 된 항체를 사용하였다. 살라몬 외는 신생아 심장에서 국소 뉴러넥스 형광의 유지보수로 조직 개폐를 보였지만, Nehrhoff 등은 골수성 세포를 표시하는 형광의 유지, 전체 심실 벽을 통한 내인성 형광의 유지가 아직 입증되지 않았으며, 이는 기준선 또는13의성인 심장 섬유아세포의 시각화를 포함하였습니다. 이 조직 청산 프로토콜은 CLARITY 방법(명확한 지질 교환 아크릴아미드-혼성 경질 영상/면역스테인링/시상 혼성화 호환 조직 하이드로겔) 및 PEGASOS(폴리에틸렌 글리콜(PEG)-관련 용매 시스템)에 기초하여 이전 프로토콜의 혼합물을 정제한다. 이 정제 된 프로토콜은 기준선에서 마우스 심장에 심장 섬유 아세포의 보다 강력한 검사와 그들이 부상의 다른 유형에 반응하는 방법의 더 강력한 검사를 허용했다. 프로토콜은 간단하고 재현 가능하며 생체 내에서 심장 섬유아세포의 행동을 특성화하는 데 도움이됩니다.

<table><tbody><tr><td>4-0 꼰 실크</td><td>Ethicon</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>8-0 프롤렌</td><td>Ethicon</td><td>8730H</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드 용액</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>Angiotensin II</td><td>Sigma</td><td>A9525-50G</td><td></td></tr><tr><td>인공 눈물 연고</td><td>Covetrus</td><td>048272</td><td></td></tr><tr><td>DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D27802-25G</td><td></td></tr><tr><td>GLUture 국소 티슈 접착제</td><td>World Precision Instruments</td><td>503763</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Start Analysis Software</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A Micro-osmotic</td><td></td></tr><tr><td>pumps</td><td>Alzet</td><td>Model 1002</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements Analysis Software</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>니콘 A1R HD 정립 현미경</td><td>니콘</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>일반 오토클레이브 차우</td><td>Labdiet</td><td>5010</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz, 5-(N-2, 3-디하이드록시프로필아세타미도)-2, 4, 6-트리-요오도-N, N'-bis(2, 3 디하이드록시프로필) 이소프탈아미드</td><td>CosmoBio</td><td>AXS-1002424</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>페닐에프린 염산염</td><td>시그마</td><td>P6126-10G</td><td></td></tr><tr><td>광개시</td>제 <td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td></td></tr><tr><td>Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Jax 재고 번호:012429</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 솔루션</td><td>Hospira, Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>타목시펜</td><td>시그마 알드리치</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>타목시펜 식품</td><td>Envigo</td><td>TD.130860</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol, N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine, 탈색제</td><td>Millipore Sigma</td><td>122262-1L</td><td></td></tr><tr><td>X-Clarity 전기영동 투명화 챔버</td><td>Logos Biosystems</td><td>C30001</td><td></td></tr><tr><td>X-Clarity 전기영동 투명화 솔루션</td><td>Logos Biosystems</td><td>C13001</td><td></td></tr><tr><td>X-Clarity 전기영동 조직 바구니</td><td>Logos Biosystems</td><td>C12001</td><td></td></tr><tr><td>X-Clarity 전기영동 조직 바구니 홀더</td><td>Logos Biosystems</td><td>C12002</td><td></td></tr></tbody></table>

건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 clarity 기지를 둔 조직 정리

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

심혈 관 질환은 전 세계적으로 사망률의 가장 널리 퍼진 원인이며 종종 변경 된 심장 기능으로 심실 강성 증가로 이어질 수있는 고조 된 심장 섬유증에 의해 표시됩니다. 심장 심실 섬유증의 이러한 증가는 상주 섬유아세포의 활성화에 기인하지만, 이러한 세포가 기준선 또는 활성화 후 3차원(3-D) 심장 내에서 어떻게 작동하는지 잘 이해되지 는 않는다. 섬유아세포가 심장 질환과 3D 심장의 역학에 어떻게 기여하는지 조사하기 위해, 전체 마우스 심장 내에서 형광으로 표지된 심장 섬유아세포를 보여주는 세련된 CLARITY 기반 조직 클리어링 및 이미징 방법이 개발되었습니다. 조직 거주자 섬유아세포는 Rosa26-loxP-eGFP 플로레스센트 리포터 마우스를 사용하여 Tcf21-MerCreMer 노크 라인을 표현하는 심장 섬유아세포와 교차하여 유전적으로 표지되었습니다. 이 기술은 건강한 마우스와 심장 질환의 섬유성 마우스 모델에서 전체 성인 왼쪽 심실전체에 걸쳐 섬유아세포 국소화 역학을 관찰하는 데 사용되었다. 흥미롭게도, 하나의 부상 모델에서, 심장 섬유아세포의 독특한 패턴은 수축 방향으로 포장 된 섬유의 밴드를 따라 부상당한 마우스 심장에서 관찰되었다. 허혈성 상해 모형에서, 섬유아세포 죽음이 생겼고, 광원 국경 지역에서 재인구에 선행되었습니다. 종합적으로, 이 정제된 심장 조직 명확히 기술과 디지털화된 화상 진찰 시스템은 조직 처리로 인해 손실된 형광을 둘러싼 항체 침투 실패 또는 이전 문제점의 제한 없이 심장에 있는 심장 섬유아세포의 3-D 시각화를 허용합니다.

심장 섬유아세포는 심장의 기준선 기능뿐만 아니라 심장 손상에 대한 반응에 필수적입니다. 이러한 세포의 배열 과 형태를 이해 하기 위해 이전 시도 2-D 설정에서 크게 실시 되었습니다. 그러나, 정제된 심장 조직 클리어링(도2)및 3-D 이미징 기술이 발표되어 심장 섬유아세포의 고급적이고 상세한 시각화를 가능하게 한다. 이 이미징 기술로, 섬유 아세포는 조밀하게 포장되고 부상되지 않은 심혼에 있는 가시적인 형태가 있는 것을 발견되었습니다(그림 3, 보충 동영상 S1-4).
왼쪽 심실 조직 클리어링은 부상되지 않은 심장에서 달성 된 후, 프로토콜은 부상 심장 조직을 연구 할 때이 클리어링 프로토콜이 수행하는 방법을 조사하기 위해 여러 부상 모델에 적용되었다. 마우스는 좌측 관상동맥(LCA)의 임시 폐쇄에 의해 I/R 손상을 입었으며, 그 다음으로 ...

조직 제거의 세련된 방법이 개발되어 성인 마우스 심장에 적용되었습니다. 이 방법은 유전 기자 전략에 기인하는 표시된 섬유아세포 형광을 유지하면서 조밀한, 자동 형광 심장 조직을 취소하도록 설계되었습니다.

건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

이 새로운 조직 청산 프로토콜은 심장의 특정 세포 유형과 부상 조건 하에서의 행동을 보다 정확하게 볼 수 있도록 기존 기술을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 빠르고 매우 간단합니다. 그것은 세포 또는 조직 염색을 요구하지 않고 배경 조직 자동 형광으로부터 최소한의 간섭으로 마르카 형광의 유지를 허용합니다.실험 마우스의 복부 표면을 청소하기 위해 70 % 에탄올에 젖은 거즈 패드를 사용하여 시작합니다. 외과 가위를 사용하여 3센티미터 횡단 절개를 하고, 심경외 공정 아래 약 3미터를 만들고, 복부에서 심도 혈관 으로 마우스를 변형하여 기본 복벽 조직으로부터 피부를 분리합니다. 피하 복벽 조직에서 2센티미터 횡단 절개를 하고, 시포이드 프로세스 아래 3센티미터를 만들고, 이 절개에서 부터 흉곽을 통해 중간선을 가로지르는 수직 절단을 합니다.흉곽을 다시 고정하여 심장을 드러내게 합니다. 그리고 우수한 베나 카바와 대오르타에 차가운 PBS를 주입하는 27 게이지 바늘이 장착 된 10 밀리리터 주사기를 사용합니다. 모든 혈액이 심장에서 플러시되었을 때, 우수한 베나 카바와 대르타에 감기 4%PFA의 10 밀리리터를 전달하여 고정 과정을 시작합니다.모든 고정이 번쩍이면 심장을 절제하고 직선 블레이드 메스를 사용하여 아리아, 오른쪽 심실 및 중격 및 좌심실을 분리합니다. 심장을 차가운 4%PFA의 15밀리리터 원추형 튜브에 넣고 영양사에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양을 합니다. 다음 아침, 0.25%의 사진 시니에이터 용액을 신선하게 준비된 하이드로겔 용액에 추가하고 심장을 하이드로 젤로 옮다.원류관을 호일로 감싸서 육체적 인 교란없이 섭씨 4도에서 하룻밤 잠복합니다. 다음날 아침, 37도의 비드 욕조에서 튜브를 따뜻하게 한 후 2.5시간 동안 포셉을 사용하여 심혼을 PBS의 15밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮기습니다. PBS에서 3시간 동안 세척당 37도에서 세척을 하고 심장을 활성 전기포고기의 바구니에 옮겨 넣습니다.뚜껑을 제자리에 고정하고 활성 전기 전광실 저장소를 전기전도 청산 용액으로 채웁니다. 챔버가 가득 차면 바구니를 용액에 담그고 전기 전광 기계의 캡을 제자리에 조입니다. 그런 다음 전기 전도 기계를 1.5 암페어와 섭씨 37도에서 1.5 시간 동안 실행합니다.전기 전구 후, 불투명 한 조직이 남아 있는지 확인하기 위해 심장의 시각적으로 확인합니다. 클리어드 하트를 15밀리리터 2개로 1시간 동안 신선한 PBS에서 1시간 동안 3회 씻어 내고, 견과류에서 세척당 섭씨 37도에 씻어내면 됩니다. 헴 자동 형광을 줄이기 위해 탈색 제에서 심장을 잠수하기 전에.48 시간 후에, 입증된 대로 PBS에서 심혼을 세 번 씻고 화상 진찰의 앞에 48 시간 동안 신선하게 준비된 RIMS에서 심혼을 평형합니다. 클리어된 심장의 3D 이미징의 경우 먼저, 3D 인쇄 된 바닥 저장소의 바닥에 진공 그리스의 얇은 층을 배치, 샘플이 이미지되는 것과 동일한 높이. RIMS로 저장소를 채우고 파이펫 팁을 사용하여 거품을 제거합니다.왼쪽 심실 벽이 위를 향하게 하여 림에 심장을 조심스럽게 배치하여 용액에 거품이 도입되지 않도록 주의하십시오. 진공 그리스를 사용하여 3D 인쇄 된 상단 저수지 조각의 하단 표면에 유리 커버 슬립을 부착하고 상단 저수지 덮개를 바닥 저수지에 내려 놓고 거품을 피하십시오. 그런 다음 상단 저수지를 글리세롤로 채웁니다.공초점 현미경을 사용하여 클리어된 하트를 이미지화합니다. 정제 된 심장 조직 클리어링과 3D 이미징을 결합하면 심장 섬유 아세포의 고급 세부 시각화가 가능합니다. 이 화상 진찰 기술을 사용하여, 섬유 아세포는 조밀하게 포장되고 부상당한 심혼에 있는 스핀들 형태를 가지고 있는 것을 관찰됩니다.허혈 재관류 부상 후, 심장 섬유아세포의 손실은 부상 후 처음 3 일 동안 허혈 성 지역에서 볼 수 있습니다. 7일과 14일까지, 섬유아세포는 부상당한 조직 지역을 다시 채우기 위하여 이주하거나 증식했습니다. 28일째까지 심장의 부상당한 지역을 둘러싼 심장 섬유아세포 개체수가 가장 큰 밀도에 있습니다.심근 경색 부상 후 1 일 반 동안 부상당한 왼쪽 심실 안에 남아있는 섬유 아세포는 거의 없습니다. 그러나 3일째에는 섬유아세포가 확장되어 대부분의 좌심실에 존재합니다. 허혈 수술과는 달리, 몇 주 동안 안지오텐신 2와 페놀프린의 주입은 심장 조직 손실과 벽 숱이 초래하지 않습니다.대신, 섬유아세포는 조직 청산 프로토콜에 정제된 것을 사용할 때 볼 수 있는 오른손잡이 나선 수축 패턴의 축을 따라 정렬한다. 또한, 안지오텐신 2와 페놀프린 치료 후, 섬유아세포는 허혈성 재현 및 심근 경색 손상의 모델에서 관찰된 스핀들 모양과 반대로 작고 둥근 것처럼 보입니다. 전광 제거는 특히 부상 프로토콜을 받은 하트로 작업할 때 신중하게 수행되어야 합니다.이 프로토콜은 심장 섬유아세포가 생체 내 부상에 어떻게 반응하는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 형광 마커는 또한 심장이 세포 수준에서 상해에 어떻게 반응하는지 이해하기 위하여 이용될 수 있습니다.

refined-clarity-based-tissue-clearing-for-three-dimensional

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

최소한의 침습적 조작으로 마우스의 심근 경색에 대한 재현성이 높은 모델을 설명합니다. 모델을 쉽게 수행할 수 있어 재현성과 생존율이 높습니다. 따라서 설명된 모델은 3R 원칙(Replacement, Refinement and Reduction)에 의해 요청되는 대로 필요한 동물의 수를 줄일 것입니다.

쥐 심근 경색을 유도 최소 침습 수술

이 연구에서는 정점 절제술의 단계별 비디오 프로토콜이 입증되었습니다. 정점 절제술은 포유류 심장 재생 연구에서 최근 주목받고 있는 수술 방식입니다. 이 연구는 심장 재생의 기저에 있는 메커니즘에 대한 연구에서 정점 절제술의 표준 방법론으로 적용을 촉진할 수 있습니다.

치근단 절제술 마우스 모델은 초기 포유류의 심장 재생을 연구하는

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

상해 다음 심근 세포 증식은 비 근세포 세포 집단에서 세포 외 단서의 교향곡을 요구하는 동적 프로세스입니다. 계보 추적, 수동 선명도 및 3차원 전체 마운트 공초점 현미경 기술을 활용하여 다양한 세포 유형이 심장 수리 및 재생에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다.

클리어 심장 3 차원 이미징을 통해 표적 세포 집단의 심장 손상 반응을 캡처

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

이 프로토콜은 간별 세포 형태를 온전한 간 조직에서 시각화하고 모델링하기 위한 포괄적인 영상 파이프라인을 제공합니다. 이 접근법은 마우스 유전학을 이용한 형광 표 지, 현장 간 관류 기반 조직 준비, 그리고 광학 투명성을 달성하기 위한 수정된 iDISCO 조직 클리어링 방법을 결합합니다.

간 섬유증 마우스 모델에서 간 별형 세포 형태 매핑

학습하세요 정제된 CLARITY 조직 투명화 기법으로 마우스 심장의 3차원 섬유아세포 조직을 관찰하는 방법. 이 프로토콜은 배경 자가형광을 최소화하면서 심장 손상 반응을 연구하는 데 효과적입니다.

건강하고 부상당한 마우스 심혼에 있는 3차원 섬유아세포 조직을 위한 정제된 CLARITY 기지를 둔 조직 정리

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