Name: 탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 배우세요 LC-MS/MS를 이용한 Saccharomyces cerevisiae 정량적 대사체학 프로토콜입니다. 수정된 퀜칭 기법으로 세포 손상과 대사체 유출을 최소화하여 370개 이상의 수용성 대사체를 정확하게 분석할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 토론에 대한 티토렌코 연구소의 현재와 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분광학의 생물학 응용 센터를 인정합니다, 구조 및 기능 유전체학센터, 및 미해결 서비스를 위한 현미경 및 세포 화상 진찰 센터 (콩코르디아 대학에 모두). 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482 CRDPJ 515900 - 17). K.M. 콩코르디아 대학 아르만드 C. 아캄볼트 펠로우십과 콩코르디아 대학 예술 과학 우수 학장의 지원을 받았습니다.

1. 효모 성장을 위한 배지 만들기 및 살균
<ol><li>180mL의 완전한 효모 추출물을 박테리아펩톤(YP) 배지로 만듭니다. 완전한 YP 배지에는 효모 추출물 1%(w/v) 및 2%(w/v) 바토펩톤이 포함되어 있습니다.</li>
	<li>YP 배지 180mL를 250mL 에렌마이어 플라스크 4개에 동등하게 분배한다. 이러한 플라스크 각각에는 YP 배지의 45mL가 포함되어 있습니다.</li>
	<li>15 psi/121°C에서 45분 동안 자동화하여 YP 배지로 플라스크를 살균합니다.</li>
</ol>2. 야생 형 효모 균주
<ol><li>BY4742(MATαhis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)스트레인을 사용한다.</li>
</ol>3. 2%의 포도당을 함유하는 YP 배지에서 효모 증가
<ol><li>포도당의 20% (w/v) 스톡 용액을 15 psi/121°C에서 45분 동안 자동화하여 살균합니다.</li>
	<li>멸균 된 YP 배지의 45 mL로 두 Erlenmeyer 플라스크 각각에 포도당의 20 % (w /v) 스톡 용액의 5 mL을 추가합니다. YP 배지의 최종 농도 포도당은 2%(w/v)이다.</li>
	<li>2% 포도당을 포함하는 YP 배지를 가진 2개의 Erlenmeyer 플라스크의 각각으로 효모 세포를 접종하는 미생물 루프를 사용합니다.</li>
	<li>효모 세포를 200 rpm에 설정된 회전 셰이커에서 30°C에서 하룻밤 동안 성장시다.</li>
	<li>효모 문화의 알리쿼트를 가져 가라. 배양mL당 효모 세포의 총 수를 결정합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산합니다.</li>
</ol>4. 세포 전달 및 세포는 2% 포도당으로 YP 배지에서 성장합니다
<ol><li>멸균된 20% (w/v) 스톡 용액의 5mL를 나머지 2개의 Erlenmeyer 플라스크에 오토클레이브 YP 배지로 추가합니다. 포도당의 최종 농도는 2% (w/v)입니다.</li>
	<li>YP 배지에서 야간 효모 배양의 부피를 2%의 포도당을 포함하는 YP 배지로 각각 5.0 x 107 세포의 총 수를 포함하는 2%의 포도당을 전송한다. 세포 전달을 위해 멸균 파이펫을 사용합니다.</li>
	<li>200 rpm에서 설정된 회전 셰이커에서 30°C에서 적어도 24h(또는 실험이 요구하는 경우) 효모 세포를 성장시한다.</li>
</ol>5. 시약 만들기, 실험실 준비, 세포 담금질 장비 설정
<ol><li>다음 준비: 1) 담금질 용액 (60% 고급 (>99.9%) 메탄올 155 mM 암모늄 중탄산염 (ABC) 버퍼, pH = 8.0); 2) 얼음 차가운 ABC 솔루션 (pH = 8.0); 3) -20 °C까지 측정 할 수있는 디지털 온도계; 4) 500 mL 큰 원심 분리기 병; 5) 사전 냉각 된 로터와 사전 냉각 된 500 mL 원심 분리기 병이있는 사전 냉각 된 고속 원심 분리기는 -5 °C에서 모두; 6) 대사 산물 추출 튜브 (폴리테트라플루오로에틸렌 안감 캡15 mL 고속 유리 원심분리기 튜브); 및 7) 드라이 아이스.</li>
</ol>6. 세포 담금질
<ol><li>혈류계를 사용하여 YP의 mL 당 효모 세포의 수를 2% 포도당 배양시로 결정합니다.</li>
	<li>YP 배지에서 배양물의 양을 2%의 포도당을 전달하여 총 5.0 x 108 세포의 총 수를 사전 냉각된 500mL 원심분리기 병으로 이송한다.</li>
	<li>-20°C에 저장된 담금질 용액으로 세포를 200mL의 부피까지 포함하는 원심분리기 병을 신속하게 채웁니다.</li>
	<li>-5°C에서 3분 동안 11,325 x g의 고속 원심분리기에서 병을 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리기에서 병을 빠르고 부드럽게 복구합니다. 뚜껑을 부드럽게 풀고 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다.</li>
	<li>10mL의 얼음 차가운 ABC 버퍼로 셀 펠릿을 신속하게 회수하고 현탁액을 대사 산물 추출을 위한 폴리테트라플루오로틸렌 안감 캡이 있는 15mL 고속 유리 원심분리기 튜브로 이송합니다.</li>
	<li>0°C에서 3분 동안 3,000 x g에서 임상 원심분리기에서 원심분리기로 세포를 수집합니다.</li>
	<li>상체를 신속하게 제거하고 튜브를 드라이 아이스에 배치하여 대사산물 추출을 시작하거나 추출할 때까지 -80°C에 튜브를 저장합니다.</li>
</ol>7. 대사 산물 추출시 시약, 실험실 용품 및 장비 준비
<ol><li>다음 준비: 1) LC-MS 등급 클로로폼; 2) LC-MS 등급 메탄올; 3) LC 등급 나노 순수 한 물; 4) LC-MS 등급 (ACN); 5) 유리 구슬 (산 세척, 425-600 μm); 6) 리테이너가있는 폼 튜브 홀더 키트가있는 소용돌이; 7) 폴리테트라플루오로틸렌 안감 캡이 있는 15mL 고속 유리 원심분리기 튜브; 8) MS 바이알; 9) 드라이 아이스; 및 10) 1.5 mL 튜브는 에탄올로 한 번 세척, ACN과 한 번 나노 순수 한 물로. 참고: 유기 용매에 강한 폴리프로필렌으로 만든 마이크로피펫 팁과 튜브만 사용하십시오.</li>
</ol>8. 대사 산물 추출
<ol><li>건조 얼음에 보관하거나 6.7단계에서 -80°C 튜브에 저장된 대사산물에, 다음을 추가하였다: 1) 2mL의 클로로포형은 -20°C에 저장된다; 2) -20 °C에 저장된 메탄올 1 mL; 3) 얼음 차가운 나노 순수 한 물의 1 mL; 및 4) 425-600 μm산 세척 유리 구슬의 200 μL.</li>
	<li>알루미늄 호일로 튜브의 입을 덮고 닫습니다. 튜브를 리테이너와 함께 폼 튜브 홀더 키트에 놓고 중간 속도(즉, 6에서 설정된 속도) 4°C에서 30분 동안 튜브를 소용돌이로 처리하여 대사산물 추출을 용이하게 합니다.</li>
	<li>튜브를 얼음에 15분 동안 배양하여 단백질 강수량과 하부 유기상으로부터 수성의 분리를 촉진합니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 3,000 x g의 임상 원심분리기에서 튜브를 원심분리합니다. 이 원심 분리 단계는 중간 층 (세포 파편과 단백질을 포함하는) 및 낮은 유기 상 (주로 지질을 포함하는)에서 상부 수성 단계 (수용성 대사 산물을 포함하는)를 분리 할 수 있습니다.</li>
	<li>마이크로피펫을 사용하여 상부 수성 상(400 μL)을 -20°C에 저장된 ACN의 800μL을 포함하는 세척 및 표지된 1.5mL 튜브로 전송한다. 참고: ACN에 상부 수성 위상을 추가한 후 백색 구름 침전이 있을 것입니다.-20°C.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 13,400 x g의 탁상 원심분리기에서 샘플로 튜브를 원심분리합니다. 참고: 원심 분리 후 흰색 구름 침전이 사라집니다.</li>
	<li>튜브내 액체의 상부에서 800 μL을 표지된 MS 바이알로 옮기다. LC-MS/MS에 의해 분석될 때까지 샘플을 0°C로 저장합니다.</li>
</ol>9. LC용 시약, 실험실 및 장비 준비
<ol><li>다음 준비: 1) 소용돌이; 2) 초음파 초음파 처리기; 3) MS 유리 유리 바이알; 4) 이진 펌프, 드가저 및 자동 샘플러가 장착 된 LC 시스템; 5) 재료표에명명된 zwitterionic 상 크로마토그래피 컬럼(5μm 폴리머, 150 x 2.1 mm); 6) 컬럼 히터; 및 7) 20mM암모늄 아세테이트, pH = 8.0 및 위상 B(100% ACN)를 포함하는 상 A(5:95 ACN:water(v/v)를 포함하는 이동상.</li>
</ol>10. LC에 의해 추출된 대사산물의 분리
<ol><li>MS 바이알의 함량을 초음파 초음파로 15 분 동안 피사체.</li>
	<li>실온(RT)에서 10초 동안 MS 바이알 3x를 소용돌이시다.</li>
	<li>MS 바이알을 웰 플레이트에 넣습니다.</li>
	<li>크로마토그래프 동안, 기둥을 45°C및 0.250mL/min의 유량으로 유지한다. 샘플을 웰 플레이트에 0°C로 유지합니다. 크로마토그래피 중에 사용해야 하는 LC 그라데이션의 표 1을 참조하십시오. 참고: 야생형 균주 BY4742의 세포로부터 추출된 수용성 대사산물의 대표적인 총 이온 크로마토그램이 도 1에도시된다. LC에 의해 분리된 대사산물은 11단계에 대해 설명된 바와 같이 양성 이온화[ESI(+)] 모드에서 수행된 질량 분광 분석에 의해 확인및 정량화되었다.</li>
</ol>11. LC에 의해 분리된 대사 산물의 질량 분광 분석
<ol><li>LC에 의해 분리된 수용성 대사산물의 식별 및 수량을 위해 가열된 전기분무(HESI)가 장착된 질량 분광계를 사용합니다. MS1 이온에 대한 질량 분광계의 분석기와 MS2 이온에 대한 질량 분광계의 검출기를 사용합니다. 각각 MS1 및 MS2 이온의 데이터 종속 수집에 대해 표 2 및 표 3에 제공된 설정을 사용합니다.</li>
	<li>ESI(+) 및 ESI(-) 모드에서 모두 주입에 10 μL의 샘플 부피를 사용합니다.</li>
</ol>12. LC-MS/MS의 원시 데이터 처리에 의한 다른 대사 산물의 식별 및 수량
<ol><li>재료의 표에 명명 된 소프트웨어를 사용하여 원시 LC-MS / MS 파일에서 다른 수용성 대사 산물의 식별 및 수량을 수행합니다. 이 소프트웨어는 대사 산물 수량에 대한 MS1을 사용하고 대사 산물 식별을 위해 MS2를 사용합니다. 이 소프트웨어는 MS 스펙트럼을 일치시켜 LC-MS/MS 원시 데이터를 사용하여 대사 산물에 주석을 지정하기 위해 가장 광범위하게 선별된 질량 스펙트럼 조각 라이브러리를 활용합니다. 이 소프트웨어는 또한 MS1및 동위원소 패턴의 정확한 질량을 온라인 데이터베이스를 사용하여 대사 산물에 대한 부토에 일치합니다. 자세한 내용은 그림 2를 참조하십시오.</li>
	<li>온라인(https://www.mzcloud.org)에서 자유롭게 사용할 수 있는 데이터베이스 및 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 원시 데이터의 MS2 스펙트럼을 검색합니다.</li>
</ol>13. 프로피듐 이오드 (PI) 염색 및 형광 현미경 검사에 의한 멤브레인 무결성 분석
<ol><li>6단계에 대해 설명된 바와 같이 수행된 세포 담금질 후, 담금질 용액을 제거하기 위해 15mL의 ABC 버퍼로 담금질 세포를 철저히 세척한다. 0°C에서 5분 동안 3,000 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.</li>
	<li>ABC 버퍼의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 PI 용액의 0.5 mL을 추가합니다(0.5 mg/mL).</li>
	<li>10s에 대한 샘플 3x와 튜브를 소용돌이와 어둠과 얼음에 10 분 동안 배양.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 13,400 x g의 탁상 원심분리기에서 샘플로 튜브를 원심분리합니다.</li>
	<li>상체를 제거하고 ABC 버퍼의 1 mL에서 펠릿을 다시 분리합니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 13,400 x g의 튜브원심분리기를 제거하고 상류체를 제거합니다. 이 단계를 2회 더 반복하여 셀 표면에 바인딩된 PI를 제거합니다.</li>
	<li>ABC 버퍼의 300 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 현미경 슬라이드의 표면에 서스펜션의 10 μL을 놓습니다.</li>
	<li>형광 현미경으로 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 및 형광 현미경 이미지를 캡처합니다. 593nm 및 636nm(각각)의 여기 및 방출 파장에 설정된 필터를 사용합니다.</li>
	<li>소프트웨어를 사용하여 총 세포 수(DIC 모드에서)와 형광 염색 된 세포의 수를 계산합니다. 또한 이 소프트웨어를 사용하여 개별 셀에 대한 염색 강도를 결정합니다.</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 사용하려면 아래에 설명된 예방 조치를 따르십시오. 클로로폼과 메탄올은 실험실 플라스틱 제품에서 다양한 물질을 추출합니다. 따라서 신중하게 처리하십시오. 이 두 유기 용매와 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 마십시오. 이러한 단계에 는 보로실리케이트 유리 파이펫을 사용합니다. 사용하기 전에 클로로폼과 메탄올로 이 파이펫을 상승시보세요. 유기 용매에 강한 폴리 프로필렌으로 만든 마이크로 피펫 팁과 튜브만 사용하십시오. LC-MS/MS에 대한 샘플 준비 중에 유리 바이알의 모든 기포를 제거한 후 웰플레이트에 삽입합니다.
여기에 사용되는 zwitterionic 위상 열은 RT 시프트를 최소화하기 위해 각 실행 후 광범위한 재조정이 필요합니다. 열 재조정의 경우 컬럼의 약 20볼륨인 재조정 솔루션의 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 0.4mL/min의 증가된 유량으로 15분 동안 초기 이동 단계로 열을 다시 조절해야 합니다. 재조정 중에 컬럼의 손상을...

수용성 대사 산물은 저분자-분자량 중간체및 필수 세포 과정에 기여하는 신진 대사의 제품입니다. 이러한 진화적으로 보존된 과정에는 영양분을 사용 가능한 에너지로 변환하는 것, 거대 분자의 합성, 세포 성장 및 신호, 세포 주기 제어, 유전자 발현 조절, 스트레스 반응, 대사 후 조절, 미토콘드리아 기능 유지, 혈관 세포 인신 매매, 자가 세포 노화 및 규제 된 세포 죽음1,2,3.
수용성 대사산물의 이러한 필수 역할중 상당수는 신진 효모 S. 세레비시아1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21, 22의연구에 의해 발견되었다. 이러한 단세포 진핵생물은 수용성 대사산물이 고급 생화학, 유전적 및 분자 생물학적 분석23,24,25,26에대한 복종성으로 인한 세포 과정에 기여하는 메커니즘을 해부하는 데 유용한 모델 유기체이다. 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 신진 효모3,18,22,27에서수용성 대사산물의 역할을 연구하는 데 사용되었지만, 이러한 유형의 분석은 다재다능성, 견고성, 감도 및 이러한 대사산물의 스테레오릭 형태를 구별하는 능력의 개선이 필요합니다.
최근 몇 년 동안 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법을 생체내 용해성 대사산물 프로파일링에 적용하는 데 상당한 진전이 있습니다. 그러나, 이 방법론을 사용하는 많은 도전은2,28,29,30,31,32,33,34, 35,36남아있다. 이러한 과제에는 다음이 포함됩니다. 첫째, 많은 수용성 대사산물의 세포 내 농도는 현재 사용되는 방법에 대한 감도의 임계값 미만이다. 둘째, 대사 활성 담금질의 효율이 너무 낮고, 세포 내 대사산물의 담금질 관련 세포 누설의 정도는 현재의 방법에 대해 너무 높다; 따라서, 현재 사용되는 방법은 수용성 대사 산물의 세포 내 농도를 과소 평가한다. 셋째, 기존 방법은 구조이소(즉, 동일한 화학 적 분수하지만 다른 원자 연결을 가진 분자) 또는 스테레오이머스(즉, 동일한 화학 공식 및 원자 연결을 가진 분자,하지만 우주에서 다른 원자 배열)를 특정 대사 산물의 분화할 수 없다; 이것은 현재 사용된 방법에 의하여 특정 대사 산물의 정확한 표시를 방지합니다. 넷째, 모시 이온(MS1) 및 이차 이온(MS2)의 기존 질량 스펙트럼 온라인 데이터베이스는 불완전하다; 이는 현재 방법의 도움으로 생성된 원시 LC-MS/MS 데이터를 사용하여 특정 대사산물의 정확한 식별 및 수량에 영향을 미칩니다. 다섯째, 기존 방법은 단일 유형의 대사산물 추출을 사용하여 수용성 대사산물의 전부 또는 대부분의 클래스를 복구할 수 없습니다. 여섯째, 기존 메서드는 LC 컬럼의 단일 유형을 사용하여 수용성 대사산물의 전부 또는 대부분의 클래스와 분리할 수 없습니다.
여기에서, 우리는 S. cerevisiae 세포 내의 신진 대사 활동의 담금질을 위한 조건을, 추출하기 전에 이 세포 내의 수용성 대사산물의 대부분을 유지하고, 효모 세포에서 수용성 대사산물의 대부분의 클래스를 추출하기 위한 조건을 조정했습니다. 우리는 S. cerevisiae 세포에서 추출한 370개 이상의 수용성 대사산물의 LC-MS/MS 기반 식별 및 정량화를 위한 다재다능하고 견고하며 민감한 방법을 개발했습니다. 비표적 메타볼로믹스의 이 방법은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체의 세포내 농도를 평가할 수 있게 한다. 개발된 LC-MS/MS 방법은 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 가진 다양한 구조 이성질체 및 입체형 형태의 수용성 대사산물의 식별 및 정량화를 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9554</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11450</td><td></td></tr><tr><td>중탄산암모늄</td><td>시그마</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>박토펩톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-2</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>C297-4</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>피셔 사이언티픽</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>L-히스티딘</td><td>시그마</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>L-류신</td><td>시그마</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신</td><td>시그마</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Hardware equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml 원심분리기 병</td><td>Beckman</td><td>355664</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 시리즈 LC 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1312A</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter 원심분리기</td><td>Beckman</td><td>6254249</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter 원심분리기 로터</td><td>Beckman</td><td>JA-10</td><td></td></tr><tr><td>Centra CL2 임상 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>디지털 온도계</td><td>Omega</td><td>HH509</td><td></td></tr><tr><td>폼 튜브 홀더 키트(리테이너</td><td>포함 Thermo) Scientific</td><td>02-215-388</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 왓베리온상 컬럼 (5&마이크로; m 폴리머 150 x 2.1 mm)</td> <td>Sigma Milipore</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Orbitrap Velos MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>ETD-10600</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337416</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX Bonus-RP, 80&Aring;, 2.1 x 150 mm, 5 &micro; m</td><td>Agilent Technologies</td><td>883725-901</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mL 유리 시료 바이알과 테플론 안감 캡</td><td>Fisher Scientific</td><td>60180A-SV9-1P</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬 (산 세척, 425-600 &mu; m)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>15-mL 테프론 라이닝 캡이 있는 고속 유리 원심분리기 튜브</td><td>PYREX</td><td>05-550</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound Discoverer 3.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>V3.1</td><td></td></tr><tr><td>효모 균주</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>효모 균주 BY4742</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1049</td><td></td></tr></tbody></table>

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 cerevisiae의 정량적 metabolomics

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomics는 세포 내의 많은 저분자 중량 중간체 및 물질 대사의 제품을 식별 및 정량화하는 데 사용되는 방법론입니다. 메타볼로믹스는 전통적으로 수용성 대사산물에 초점을 맞추고 있습니다. 수용성 메타볼로메는 다양한 게놈, 전형, 전사, 프로테오믹 및 환경 요인을 통합하는 복잡한 세포 네트워크의 최종 제품입니다. 따라서, metabolomic 분석은 각종 유기체 내의 생물학 프로세스의 과다에서 이 모든 요인에 대한 행동의 결과를 직접 평가합니다. 이러한 유기체 중 하나는 완전히 서열게놈을 가진 단세포 진핵생물인 신진 효모 사카로미세스 세레비시아입니다. S. cerevisiae는 포괄적인 분자 분석에 순종하기 때문에, 진핵 세포 내의 많은 생물학적 프로세스의 근본적인 기계장치를 해부하기위한 모델로 사용됩니다. 수용성 메타볼로메의 견고하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법은 이러한 메커니즘을 해부하는 데 필수적인 방법론을 제공할 것입니다. 여기서 우리는 S. 세레비시아 세포로부터 담금질및 수용성 대사산물 추출의 최적화된 조건에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 추출된 수용성 대사산물의 정량적 분석을 위해 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)과 결합된 액체 크로마토그래피의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 이러한 대사 산물의 다른 구조 이성질체 및 스테레오시컬 형태를 포함하여 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성을 갖춘 370개 이상의 수용성 대사산물을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 이 대사 산물은 각종 에너지 운반체 분자, 뉴클레오티드, 아미노산, 단당류, 글리코리시스의 중간체 및 삼환순환 중간체를 포함합니다. 비표적 메타볼로믹스의 LC-MS/MS 방법은 민감하며 0.05 pmol/μL의 농도에서 일부 수용성 대사산물의 식별 및 양을 확인할 수 있습니다. 이 방법은 다른 조건에서 배양된 야생형 및 돌연변이 효모 세포의 수용성 메타볼로메를 평가하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

효모 세포 내의 수용성 대사산물의 정량적 평가를 개선하기 위해 대사 산물 검출을 위한 세포 담금질 조건을 최적화했습니다. 이러한 목적을 위해 세포 담금질은세포31,33,37,38내의 모든 효소 반응의 신속한 체포를 포함한다. 이러한 세포대사 활성의 이러한 체포는 생체 내에서 수용성 대사산물의 양을 양화하는 방법의 필수적인 단계로서 세포내 농도31,33,37,38의과소 평가를 방지하기 때문이다. 대사 산...

우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

이 프로토콜은 높은 특이성, 높은 감도, 또한 이소성, 동종, 소수성 및 소수성 분자를 포함하여 대사 산물의 많은 다른 클래스를 프로파일 수 있기 때문에 현재 사용 되는 효모 metabolomics에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 프로토콜에 사용되는 담금질 방법은 모든 효소 반응을 중지하는 동시에 세포에서 대사 산물의 누출을 현저히 줄입니다. 이 프로토콜에 내장된 MS1 라이브러리는 다양한 MS2 실행에서 나온 것입니다.야간 배양 후 섭씨 30도 및 분당 200회전 후, 배양의 밀리리터당 효모 세포의 수를 결정하고 플라스크 당 45밀리리터의 오토클레이브 YP 배지를 함유한 2개의 Erlenmeyer 플라스크각각에 살균된 20% 스톡 용액 5개를 추가합니다. 멸균 전달 파이펫을 사용하여 7번째 효모 세포에 5배 10번을 추가하고 분당 200회전에서 섭씨 30도에서 적어도 24시간 동안 효모 세포를 성장시다. 대사 산물 추출의 경우, 배양 후, 원심분리에 의해 효모 세포를 수집하고 신속하게 상체를 제거합니다.튜브를 드라이 아이스에 놓고 영하 20도 의 밀리리터, 영하 20도의 밀리리터, 얼음 차가운 나노 순수 수의 1 밀리리터, 425 ~600 미크론 산 세척 유리 구슬 200 마이크로리터를 첨가합니다. 구슬이 추가되면 알루미늄 호일로 덮인 튜브를 리테이너가 있는 폼 튜브 홀더 키트에 넣고 4도에서 중간 속도로 30분 동안 샘플을 소용돌이쳐 대사 산물 추출을 용이하게 합니다. 다음으로, 중간 파편과 단백질 및 하부 유기 상으로부터 상부 수성 상의 분리를 허용하기 위해 시료를 원심분리하기 전에 얼음에 15분 동안 튜브를 배양한다.마이크로피펫을 사용하여 상부 수성 상의 약 400마이크로리터를 영하 20도의 800 마이크로리터를 함유한 세척 및 라벨이 부착된 1.5 밀리리터 튜브로 이송합니다. 그런 다음 원심분리하고 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광분석 분석전까지 0도 저장을 위해 표기된 질량 분광법 바이알로 상부의 800 마이크로리터를 전송한다. 추출된 대사 산물을 분리하려면 시료 바이알을 15분 동안 초음파처리한 다음 실온에서 10초 의 3개의 소용돌이가 있습니다.소용돌이 후, 유리병을 액체 크로마토그래퍼의 우물 판에 넣고 분당 0.25 밀리리터의 유량과 웰 플레이트를 섭씨 0도로 섭씨 45도로 설정합니다. 그런 다음 테이블을 사용하여 분석을 위해 액체 크로마토그래피 그라데이션을 설정합니다. 분리 후, 가열된 전기스프레이 이온화가 장착된 질량 분광계에서 전기분무 양성 및 음극모두에서 10개의 마이크로리터 샘플 부피를 사용하여 수용성 대사산물을 식별하고 정량화한다.분석의 끝에서, 적절한 화합물 분석 소프트웨어 프로그램에서 원시 데이터를 열고 질량 스펙트럼 단편화 라이브러리를 사용하여 분석에서 확인된 대사 산물에 주석을 달아 질량 스펙트럼에 일치한다. MS1 및 동위원소 패턴의 정확한 질량은 또한 온라인 데이터베이스를 사용하여 대사 산물의 부조를 허용하도록 식별 될 수있다. 그런 다음 데이터베이스 및 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 원시 데이터의 MS2 스펙트럼을 검색합니다.다음 날, 효모 세포를 담금질 한 후, 철저하게 ABC 버퍼의 15 밀리리터로 세포를 세척하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 신선한 ABC 버퍼의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단하고 세포에 프로피듐 요오드 용액의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 소용돌이 당 10 초 동안 샘플을 세 번 소용돌이와 빛으로부터 보호 얼음에 10 분 동안 세포를 배양.인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 세척 당 신선한 ABC 버퍼의 1 밀리리터로 세포를 세 번 세척. 마지막 세척 후, 신선한 ABC 버퍼의 300 마이크로 리터에 펠릿을 다시 중단하고 현미경 슬라이드에 결과 세포 현탁액의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 형광 현미경을 사용하여 593 나노미터의 발산 파장및 636 나노미터의 방출 파장에 설정된 필터를 사용하여 세포의 차분 간섭 대비 및 형광 현미경 이미지를 캡처합니다.그런 다음 적절한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 밝은 필드 및 형광 이미지에서 세포의 총 세포 수를 계산하고 개별 세포에 대한 염색의 형광 강도를 결정합니다. 상기 변형된 세포 담금질 방법은 영하 40도에서 완충되지 않은 80%메탄올보다 플라즈마 막 및 세포벽에 현저히 낮은 손상을 일으킨다. 실제로, 거의 모든 세포가 수정된 방법을 사용하여 담금질을 실시하여 혈장 막과 세포벽이 손상되지 않는 효모 세포의 특징인 적색 형광 방출을 나타낸다.대조적으로, 거의 모든 세포는 플라즈마 막과 세포벽이 현저히 손상된 효모 세포의 특징인 녹색 형광 방출을 표시한 섭씨 40도에서 비완충제 80%메탄올을 사용하여 담금질을 실시한다. 상기 변형된 세포 담금질 방법은 또한 영하 40도에서 완충되지 않은 80%메탄올보다 효모 세포로부터 의수용 성대사산물의 유의하를 유발한다. 수용성 대사산물 표준의 보존 시간 이동 값은 현저히 낮으며, 역상 열에 비해 zwitterionic 위상 컬럼의 경우 피크 셰이프가 상당히 선명합니다.액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 방법의 또 다른 장점은 zwitterionic 상 열을 사용하여 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성으로 다른 수용성 대사 산물을 효율적으로 분리하는 기능입니다. 어두울에 서 있는 공형요요함을 하고 중간 단계를 방해하지 않으면서 상층을 수집해야 합니다. MS2 스펙트럼 라이브러리의 부족으로 인해 MSP에 주석을 지정할 수 없는 경우 NMR을 사용하여 이 구조를 설명합니다.

quantitative-metabolomics-saccharomyces-cerevisiae-using-liquid

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

cryolysis, 요소의 solubilziation, HILIC 분류 및 phosphorylated 펩티드의 아이맥 농축을 사용하여 양적 인산화 과정에 대한 설명.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

우리는 조사 스캔 전기 분무 이온화 질량 분광법 (ESI / MS)를 사용하여 효모의 수많은 지질 수종을 식별하기위한 새로운 양적 lipidomics 방법을 설명합니다. 이 방법은 현재 lipids, 감도 및 속도의 다양한 분자 형태를 해결하는 능력 지질 식별 및 부량 사용할 방법을 초과했습니다.

전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

출처: Samuels, D. J. 외 황 색포도상구균의 대사물 분석을 위한 액체 크로마토그래피-질량분석법 기반 탠덤 접근법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 액체 크로마토그래피-질량분석법을 사용하여 S. aureus의 세포 내 대사산물을 식별하고 정량하는 방법을 보여줍니다. 대사물 추출, 펩타이드 정규화, 액체 크로마토그래피, 질량분석에 포함된 단계를 개괄합니다.

S. aureus의 대사산물 분석을 위한 액체 크로마토그래피–질량분석법 기반 접근법

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

밀 곡물 대사 산물 및 지질의 비표적 분석을위한 방법이 제시된다. 이 프로토콜에는 아세토니트릴 대사산물 추출 방법 및 역위상 액체 크로마토그래피 질량 분광법 방법이 포함되며, 양극 및 음전소 이온화 모드로 수집됩니다.

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다.

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

배우세요 LC-MS/MS를 이용한 Saccharomyces cerevisiae 정량적 대사체학 프로토콜입니다. 수정된 퀜칭 기법으로 세포 손상과 대사체 유출을 최소화하여 370개 이상의 수용성 대사체를 정확하게 분석할 수 있습니다.

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

더 많은 동영상 탐색