Name: 드로소필라 세포의 인핵 하이-C (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 학습하세요 드로소필라 세포의 인핵 하이-C 프로토콜을 통해 염색질 상호작용을 고해상도로 프로파일링하는 방법을. CRISPR/Cas9 유전자 편집과 결합하여 TAD 경계의 구조적 기능을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 UNAM 기술 혁신 및 연구 지원 프로그램 (PAPIIT) 교부금 번호 IN207319 및 과학기술 국가 위원회 (CONACyT-FORDECyT) 교부금 번호 303068 의해 지원되었다. A.E.L. 과학 기술 국가 위원회 (CONACyT) CVU 번호 968128 의해 지원 석사 학생입니다.

1. 고정
<ol><li>1,000만 개의 슈나이더 라인 2 플러스(S2R+) 세포로 시작하여 실온(RT)에서 10%의 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 슈나이더 배지에서 세포 현탁액 17.5mL를 준비합니다.</li>
	<li>메탄올이 없는 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도를 2%로 얻습니다. RT에서 10분 동안 혼합하고 인큐베이션을 사용하여 매 분마다 섞어 주시합니다. 참고: 포름알데히드는 유해 화학물질입니다. 적절한 건강 및 안전 규정을 따르고 연기 후드에서 작업하십시오.</li>
	<li>글리신을 첨가하여 반응을 담결하여 0.125 M의 최종 농도를 달성하고 혼합한다. RT에서 5분 동안 배양하고 얼음에 15분이 면됩니다.</li>
	<li>400 × G의 원심분리기는 RT에서 5분 동안, 그리고 4°C에서 10분 동안; 상부체를 폐기합니다. 차가운 1x 인산염 완충식식염 의 25 mL에서 조심스럽게 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 400 × g의 원심분리기는 상수부를 폐기합니다. 참고: 프로토콜을 계속 계속하면 용해의 경우 2.1단계로 이동하십시오. 그렇지 않으면, 액체 N2에 펠릿을 플래시 동결하고 -80 °C에 펠릿을 저장합니다.</li>
</ol>2. 리시스
<ol><li>얼음-차가운 용해 완충제(10m Tris-HCl, pH 8; 비이온 계면활성제의 0.2%)로 세포를 재연하고,10mMM NaCl; 1x 프로테아제 억제제 참조), 얼음 냉기 용해 완충제로 10mL로 체적을 조절한다. 1 × 106 셀/mL의 농도를 얻기 위해 부피를 조정합니다. 30분 동안 얼음에 배양하여 튜브를 반전시켜 2분간격으로 섞습니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 300 × g에서 핵을 원심분리한 다음 주체를 조심스럽게 폐기합니다. 차가운 리시스 버퍼 1mL로 펠릿 1x를 씻고 마이크로 센트심분리기 튜브로 옮춥니까. 1mL의 차가운 1.25x 제한 버퍼로 펠릿 1x를 세척하고 각 셀 펠릿을 1.25x 제한 버퍼의 360 μL로 재보설한다.</li>
	<li>튜브 당 10% 나트륨 도데딜 황산염(SDS)의 11μL을 넣고 튜브(0.3% 최종 농도)로 조심스럽게 섞고, 37°C에서 45분 동안 배양하고 700-950 rpm에서 흔들어 주세요. 배양 중에 몇 번 덩어리를 방해하기 위해 위아래로 파이프.</li>
	<li>비이온 계면활성제의 75 μL(10% 용액, 재료표참조)을 튜브당 (1.6% 최종 농도)를 추가하고, 37°C에서 45분 동안 배양하여 950rpm에서 흔들어 SDS를 담급니다. 인큐베이션 중에 덩어리를 방해하기 위해 몇 번 위아래로 파이프. 참고: 덩어리가 크고 방해가 어려운 경우 SDS 및 계면 활성제 치료 중 회전 속도를 400rpm으로 줄입니다. 덩어리가 파이펫팅으로 분해되기 어려운 경우 샘플을 두 개로 분할합니다. 제한 버퍼, SDS 및 계면 활성제의 볼륨을 조정합니다. 투과성화를 진행한다. 다음으로, 최소 속도(200 × g)로핵을 회전시키고, 주체를 조심스럽게 버리고, 1X 제한 버퍼로 샘플을 함께 풀링하고, 소화를 진행한다. 소화되지 않은 샘플(UD)으로 10 μL 알리쿼트를 가져 가라.</li>
</ol>3. 효소 소화
<ol><li>크롬토닌을 튜브당 Mbo I의 200대(U)를 추가하여 소화하고, 회전시 4시간에서 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다(950rpm).</li>
	<li>다음 날에는 튜브당 50U의 Mbo I를 추가하고 회전하는 동안 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오 (950 rpm).</li>
	<li>20 분 동안 60 °C에서 튜브를 배양하여 효소를 비활성화합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 참고: 소화된 샘플(D)으로 10 μL 알리쿼트를 섭취하십시오.</li>
</ol>4. DNA 끝의 생물학적
<ol><li>제한 조각 오버행을 채우고 DNA 끝을 비오틴으로 표시하려면 각각 10mM dCTP의 1.5 μL을 추가하십시오. dGTP, dTTP, 0.4mm 비오틴 dATP의 20 μL, 트리스 저-EDTA(TLE) 버퍼의 17.5 μL [10m MM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0], 클렘의 5 U/μL(DNA) 37°C에서 75분 동안 조심스럽게 섞어서 배양합니다. 30 s에 대 한 10 s 마다 700 rpm에서 흔들어. 결찰 믹스를 준비하는 동안 모든 튜브를 얼음 위에 놓습니다.</li>
</ol>5. 결찰
<ol><li>각 소화된 크로마틴 혼합물을 결찰 혼합으로 별도의 1mL 튜브로 옮기십시오(10x 결찰 버퍼의 100 μL, 10 mg/mL 소 세럼 살부 알부민의 10 μL, T4 DNA 리게아제 의 U 15, 이중 증류수 425 μL[ddH2O]). 부드러운 파이펫팅으로 철저히 섞고 16°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
</ol>6. 크로스 링크 반전 및 DNA 정화
<ol><li>튜브 당 10 mg / mL Proteinase K의 50 μL을 첨가하여 단백질을 저하시키고 2 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오. 온도를 65°C로 높이고 하룻밤 동안 배양하여 크로스링크를 역방향으로 연결합니다.</li>
	<li>RNA를 10 mg/mL RNase A의 20 μL을 첨가하여 RNA를 저하시키고, 1h에 대해 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>페놀:클로로폼 추출을 수행한 다음 에탄올 강수량을 수행합니다.<ol>
<li>페놀 클로로폼 1부피를 넣고 반전으로 철저히 섞어 균일한 백색 상을 얻습니다. 참고: 페놀은 유해한 화학물질입니다. 적절한 건강 및 안전 규정을 따르십시오. 연기 후드에서 작업.</li>
		<li>15분 × 동안 15,000 g의 원심분리기. 수성 상면을 신선한 2mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기. TLE 버퍼의 100 μL로 하부 층의 백 추출을 수행하고 수성 위상을 동일한 2mL 튜브로 옮춥니까.</li>
		<li>100% 에틸 알코올(EtOH), 3M 나트륨 아세테이트의 0.1부, 20 mg/mL 글리코겐의 2μL을 첨가하여 DNA를 침전시한다. -20°C에서 하룻밤 사이에 2h에 이르는 기간 동안 배양한다.</li>
		<li>4°C에서 30분 동안 15,000 × g에서 회전하고, 얼음차가운 70% EtOH로 펠릿 2x를 세척합니다. RT에서 펠릿을 건조하고 TLE 버퍼의 100 μL에서 다시 중단하십시오. 제조 업체의 지침(재료의 표)에따라 DNA와 불소계에 선택적으로 결합하는 불소 염료를 사용하여 DNA를 정량화한다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 단기 또는 -20 °C에서 장기적으로 4 °C에서 리기션 제품을 저장합니다. 품질 관리를 위해 리게티드 샘플(L)으로 재료의 알리쿼트(100 ng)를 사용한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Hi-C 템플릿 품질 평가
<ol><li>소화 및 결찰 질적 컨트롤<ol>
<li>교차 링크를 반전시켜 UD 및 D 알리쿼트에서 DNA를 정화하고, 위에서 설명한 바와 같이 페놀:클로로폼 추출 및 에탄올 침전을 수행한다.</li>
		<li>1.5% 아가로즈 젤에 UD, D 및 L 샘플의 100 ng를 로드합니다. L 샘플에 대 한 높은 분자 량 대역 대 D 샘플에서 500 bp 를 중심으로 얼룩을 찾습니다 (대표 결과 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화 효율 정량 제어 참고: 소화 효율을 보다 정확하게 평가하기 위해 UD 및 D 샘플을 템플릿으로 사용하여 다음과 같이 설계된 프라이머를 사용하여 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)을 수행합니다.<ol>
<li>7.2.3 단계에서 포뮬러에서 R이라고 불리는 소화(현재 프로토콜에서 Mbo I)를 위해 사용되는 효소에 대한 DNA 제한 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍을 설계한다.</li>
		<li>7.2.3 단계에서 C라고 불리는 소화에 사용되는 효소(Mbo I)에 대한 제한 부위를 포함하지 않는 대조군 DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍을 설계한다.</li>
		<li>아래 표시된 수식에 따라 제한 효율을 계산하기 위해 증폭의 주기 임계값(Ct 값)을 사용합니다. % 제한 = 100 - 100 /2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD} CtR이 조각 R의 Ct 값을 참조하고 CtC는 샘플 D 및 샘플 UD용 조각 C의 Ct 값을 나타냅니다. 참고: 제한 백분율은 제한 DNA 부위를 포함하지 않는 대조군(C) DNA 단편에 비해 제한된(R) DNA 단편을 분비하는 제한 효소의 효율을 반영한다. 80%≥ 제한 효율을 권장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>알려진 상호 작용 감지<ol>
<li>PCR을 수행하여 내부 결찰 제어를 증폭하여 단거리 및/또는 중장거리 상호 작용을 검사합니다(대표 결과 참조).</li>
		<li>또는 프라이머가 인접한 제한 조각에서 전방 또는 역방향 방향에 있는 계각 생성물을 증폭하도록 설계 할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>채우기 및 비오틴 라벨링 제어<ol>
<li>위에서 설명한 바와 같이 게놈내의 인접 제한 단편 간의 알려진 상호 작용 또는 결찰 생성물의 증폭 및 소화에 의한 Hi-C 마킹 및 결찰 효율을 검증한다. 참고: Mbo I 사이트(GATC)의 성공적인 채우기 및 결찰은 결찰 접합부에서 제한 효소 Cla I(ATCGAT)에 대한 새로운 부위를 생성하고 Mbo I 사이트를 재생합니다.</li>
		<li>Mbo I, Cla I 또는 둘 다로 PCR 제품을 소화합니다. 1.5-2% 젤에서 샘플을 실행한 후, 컷 및 절단 해제밴드(26)의강도를 정량화하여 3C 및 Hi-C 계합 접합의 상대적 수를 추정한다. 참고: 70%> 효율이 필요합니다(대표 결과 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 초음파 처리
<ol><li>200-500 bp DNA 단편을 얻기 위해 샘플을 초음파 처리합니다. 이 프로토콜에 사용되는 계측기의 경우(재료표참조), 튜브당 ddH2O의 130 μL에서 샘플을 희석하고 400 bp로 초음파 처리하도록 계측기를 설정: 채우기 레벨: 10; 관세 요인: 10%; 피크 인시던트 전원(w): 140; 버스트당 사이클: 200; 시간(들): 80.</li>
</ol>9. 비오틴 제거/엔드 수리
참고: 아래 표시된 단계는 Hi-C DNA 의 5 μg에 대해 조정됩니다.
<ol><li>비오틴 제거를 수행하기 위해 시료(130 μL)를 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 10x 결찰 버퍼 16μL, 10mM dATP 2μL, T4 DNA 폴리머라제 5μL(15U), ddH2O(총 부피 160μL)를 추가합니다. 20 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>10mM dNTPs5 μL, 10배 결찰 버퍼 4μL, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5μL(10 U/μL), 클레나우 1μL, ddH2O(총부피 200μL)를 추가합니다. 20 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
</ol>10. 크기 선택
<ol><li>주로 250-550 bp 크기 범위에서 조각을 선택하려면 순차적 고체 위상 가역 고정(SPRI) 크기 선택을 0.6배로 먼저 수행하고 제조업체의 지침에 따라 0.90배, TLE100 μL을 사용하여 DNA를 엘ute한다.</li>
</ol>11. 비오틴 풀다운/A-테일링/어댑터 리칭
참고: 소용돌이에 의해 자기 구슬을 다시 일시 중지하고, 회전 휠에서 3분 동안 샘플을 회전한 다음, 샘플을 잠시 회전시켜 자기 스탠드에 놓음으로써 세서스를 수행합니다. 구슬이 자석에 달라붙고, 상체를 버리고, 다음 세척 단계를 진행하도록 한다. 회전 휠 대신 회전하여 열 블록에서 55°C에서 세차작업을 수행합니다.
<ol><li>최종 부피를 TLE로 샘플당 300 μL로 구성하여 풀다운합니다. 비드 세척 버퍼 준비: 1x 트위엔 버퍼 (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% 트위엔), 0.5x TB, 1x 노-트웬 버퍼(NTB) (5mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.</li>
	<li>라이브러리당 스트렙타비딘과 연결된 자기 구슬 150μL을 사용하십시오(재료표참조). 1x TB의 400 μL로 구슬 2배 세척합니다. 그런 다음 300 μL 2x NTB로 구슬을 다시 일시 중지합니다.</li>
	<li>구슬을 300 μL Hi-C 재료와 혼합하고 회전 휠에서 30분 동안 RT에서 인큐베이션하여 비오틴이 스트렙타비딘 구슬에 결합할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>구슬을 0.5배 TB400μL로 세척하고 55°C에서 3분 동안 배양하여 750rpm에서 회전합니다. 1x 제한 버퍼의 200 μL에서 구슬을 세척합니다.</li>
	<li>dATP 테일링 믹스의 100 μL (10mM dATP의 5 μL, 10 x 제한 버퍼의 10 μL, Klenow 엑소의 5 μL, ddH2O의 80 μL)의 구슬을 재연합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>상류제를 제거하고, 55°C에서 3분 동안 배양하고 750 rpm에서 회전하여 0.5배 TB의 400 μL로 구슬 2x를 세척한다.</li>
	<li>구슬을 1x NTB의 400 μL로 씻은 다음 1x 결찰 버퍼의 100 μL로 세척합니다.</li>
	<li>1x 계합 버퍼의 50 μL에서 구슬을 다시 중단하고 현탁액을 새 튜브로 옮기습니다. 사전 어댑터(15μM 스톡)와 T4 리개제 2μL(400 U/μL, 즉 800 U/Tube)의 4μL을 추가합니다. 2 시간 동안 RT에서 인큐베이션하십시오. 참고: PE 1.0 및 PE 2.0 어댑터(30μM 스톡)의 동일한 볼륨을 추가하고 RT에서 10분 동안 인큐베이팅하여 어댑터를 미리 작성합니다(재료 표참조).</li>
	<li>슈퍼나탄을 제거하고 400 μL의 TB로 구슬 2x를 세척하여 구슬을 다시 캡처합니다. 1x NTB의 200 μL로 구슬을 씻은 다음 1배 제한 버퍼의 100 μL로 구슬을 세척하고 1배 제한 버퍼의 40μL로 구슬을 재제한합니다.</li>
</ol>12. PCR 증폭
<ol><li>5, 6, 7 및 8 사이클로 25 μL 부피의 PcR을 설정합니다. 각 PCR에 대해 다음을 사용하십시오.<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">반응 레시피</td>
			</tr>
<tr>
<td>하이-C 구슬</td>
				<td>2.5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR 프라이머 1 (재료 의 표)</td>
				<td>0.75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR 프라이머 2 (재료 의 표)</td>
				<td>0.75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10mM dNTP</td>
				<td>0.6 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>5x 반응 버퍼</td>
				<td>5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA 폴리머라제</td>
				<td>0.3 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
				<td>14.65 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>합계</td>
				<td>25 μL</td>
			</tr>
</tbody></table>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>사이클</td>
				<td>온도</td>
				<td>시간</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td rowspan="3">n 주기</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>10 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>65 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>72 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>72 °C</td>
				<td>7분</td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
</ol>13. 최종 PCR 증폭
<ol><li>위에서 설명한 것과 동일한 조건과 선택한 사이클 수를 사용하여 최종 PCR 증폭을 수행합니다. 50 μL 반응에서 5 μL의 Hi-C 구슬을 템플릿으로 사용하여 샘플을 분할합니다.</li>
	<li>모든 PCR 반응을 수집하고 신선한 튜브로 전송합니다. 자석을 사용하여 스트렙타비딘 구슬을 제거하고 상체(PCR 제품)를 복구합니다. 구슬을 신선한 튜브로 옮기고, 11.2.9 단계에서 표시된 대로 구슬을 세척하고, 백업으로서 4°C에서 1x 제한 버퍼에 저장한다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 SPRI 구슬의 부피0.85배를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다. 30μL의 TLE 버퍼를 갖춘 엘루트.</li>
	<li>불소 계측기를 사용하여 Hi-C 라이브러리를 정량화하고 칩 기반 모세관 전기포광에 의한 라이브러리의 품질을 확인합니다.</li>
	<li>마지막 품질 검사점으로서 Hi-C 라이브러리의 1 μL을 템플릿으로 사용하여 12.1 단계에서 설명된 동일한 조건을 사용하여 10사이클을 사용하여 PCR 반응을 수행합니다. PCR 제품을 두 개의 미세원심분리기 튜브로 나눕니다: Cla I로 하나를 소화하고 다른 하나는 대조군으로 소화되지 않은 상태로 둡니다. 1.5~2% 아가로즈 젤로 제품을 실행합니다(대표 결과 참조).</li>
	<li>적절한 시퀀싱 플랫폼에서 50bp 또는 75bp 페어링 엔드 시퀀싱으로 진행합니다.</li>
</ol>

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<li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCUP%3A+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310(2015).</li>
<li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li>
<li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biolog%22%5BJournal%5D)">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198(2015).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137(2008).</li>
<li>Ong, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li>
<li>Fresán, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li>
<li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li>
<li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li>
<li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li>
<li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li>
<li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-BERST%3A+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 핵 내 Hi-C 방법은 고해상도로 드로소필라 게놈 토폴로지의 상세한 탐구를 허용하고, 발기인과 증강제 와 같은 조절 요소 간의 크로마틴 루프에서 부터 TAD 및 대형 구획식별(25)에이르기까지 다양한 게놈 비늘에서 게놈 상호 작용의 전망을 제공한다. 동일한 기술은 또한 일부 수정33을가진 포유류 조직에 효율적으로 적용되었습니다. 예를 들어, 단일 세포 현탁액 대신 조직을 처리하는 경우, 조직은 70 μm 필터를 통해 체질되고, 용해 단계는 Dounce 균질화제를 사용하여 물질을 균질화하면서 수행된다. 또한, 포유류 게놈이 Drosophila 게놈보다 25배 더 크므로 1-5 kb 해상도 행렬을 구축하는 데 필요한 유효한 판독 쌍의 수가 더 큽습니다. 상기 핵하이C 방식은 결찰 전 65°C에서 1% SDS로 핵용액을 회피하여 핵 무결성을 보존하고, 7mL23, 24대신 ...

진핵생물에서, 게놈은1단계도중 핵 공간에 있는 특정 영토를 차지하는 염색체로 분할된다. 염색체를 형성하는 염색체는 두 개의 주요 국가로 나눌 수 있습니다: 전사적으로 허용되는 접근 가능한 크로마틴 의 하나, 그리고 전사적으로 억압되는 소형 크로마틴의 다른. 이 크로마틴 상태는 핵2에두 개의 뚜렷한 구획을 형성하여 핵 공간에서 분리하고 거의 혼합되지 않습니다. 서브 메가베이스 척도에서 경계는 염색체조직3,4,5를표시하는 TAD라는 고주파 크로마틴 상호 작용의 도메인을 분리합니다. 포유류에서 TAD 경계는 응집력 및 CCCTC 결합 계수(CTCF)6,7,8에의해 점령된다. 응집력 복합체는 크롬라틴을 압출하고 유전체 서열에서 수렴 방향으로 배치되는 CTCF 결합 부위에서 정지하여 안정적인 크로마틴 루프9,10,13,14를형성한다. CTCF DNA 결합 부위의 유전적 중단은 CTCF 및 응집력 있는 단백질 풍부의 경계 또는 감소로 조절 원소, TAD 형성의 손실 및 유전자 발현 완화9,10, 11,13,14사이의 비정상적인 상호 작용을 초래한다.
드로소필라에서, TAD사이의 경계는 경계 요소 관련 인자 32 kDa(BEAF-32), 모티프 1 결합 단백질(M1BP), 센트로소말 단백질 190(CP190), 털이 날개(SuHW), 및 CTCF를 포함한 여러 EP에 의해 점유되고, 그의 변형 및18,18,폴리머1에서 풍부하게 된다. 드로소필라에서는13,17,19의전사의 결과로 TAD가 나타나고 경계 형성 및 절연 특성에서 독립적 인 AP의 정확한 역할은 아직 조사 중입니다. 따라서, Drosophila의 도메인이 유사한 전사 상태의 영역 집합의 유일한 결과인지 또는 CTCF를 포함한 AP가 경계 형성에 기여하는지 여부는 완전히 특징지어져야 한다. 차세대 시퀀싱과 결합된 염색체 형태 포획 기술의 개발을 통해 고해상도에서 게놈 접촉의 탐사가 가능해졌습니다. Hi-C 프로토콜은 크로마틴 단편 간의 스퓨리어스 결찰 제품을 피하기 위해 "솔루션"2를 수행한 결찰 단계로 처음 설명되었다. 그러나, 여러 연구는 데이터에서 유용한 신호가 용액20,21에없었던 부분적으로 리세드 핵에서 형성된 결찰 제품으로부터 왔다는 것을깨달았다.
그런 다음 프로토콜은 단일 세포 Hi-C실험(22)의일부로 핵 내부의 결찰을 수행하도록 수정하였다. 핵 내 Hi-C 프로토콜은 이후 세포 인구 Hi-C에 통합되어 전체 범위의 게놈 거리에서 보다 일관된 커버리지를 산출하고 덜 기술적노이즈(23,24)로데이터를 생성한다. 여기서 상세히 기술된 프로토콜은, 핵 내의정서(23,24)를 기반으로 하며 드로소필라(Drosophila)의 노치 유전자 궤적에서 도메인 경계에서 CTCF 및 M1BP에대한 DNA 결합 모티브를 유전적으로 제거하는 결과를 조사하는 데 사용되었다. 결과는 경계에 있는 AP를 위한 DNA 결합 모티프를 바꾸는 것은 노치 도메인 형성, 노치 메큐를 둘러싼 지역에 있는 더 큰 토폴로지 결함 및 유전자 발현 변압에 대한 과감한 결과를 가지고 있다는 것을 보여줍니다. 이것은 도메인 경계에 있는 유전 원소가 Drosophila25에있는 게놈 토폴로지 및 유전자 발현의 유지를 위해 중요하다는 것을 표시합니다.

<table><tbody><tr><td>16%(vol/vol) 파라포름알데히드 용액</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>CA1524-016</td><td></td></tr><tr><td>ClaI 효소</td><td>NEB</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>COVARIS 초음파기</td><td>Covaris</td><td>LE220-M220</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart</td><td>NEB</td><td>B72002S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads, MyOne, 스트렙타비딘, C1</td>, <td>Invitrogen</td><td>, 65002</td><td></td></tr>, <tr><td>소 태아 혈청(FBS), 멸균 여과</td><td>, Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr>, <tr><td>Klenow Dna, PolI, 대형 단편</td>, <td>NEB</td>, <td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>, Klenow 엑소(-)</td><td>NEB</td>, <td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>, 결찰 완충액,</td><td>NEB</td>, <td>B020S</td><td></td></tr><tr><td>MboI 효소</td><td></td><td>NEB R0147M</td><td></td></tr><tr><td>NP40-Igepal</td><td>SIGMA</td><td>CA-420</td><td>용해 완충액 PE 어댑터에 첨가하기위한 비이온 성 계면 활성제</td></tr><tr><td>1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>어댑터 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR 프라이머 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR 프라이머 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Phenol</td><td></td></tr><tr><td>: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>SIGMA</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Primer 1 (알려진 상호 작용, 그림 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer</td><td></td></tr> <tr><td>2 (알려진 상호 작용, 그림 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>SPRI 비즈</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (PNK)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>TaqPhusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>DNA 중합효소</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>SDS 담금질용 비이온 계면활성제</td></tr></tbody></table>

드로소필라 세포의 인핵 하이-c

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

게놈은 도메인 간의 상호 작용을 격리하는 경계에 의해 구분되는 토폴로지적으로 연관된 도메인(TADs)으로 구성됩니다. Drosophila에서 TAD 형성과 경계의 기본 메커니즘은 여전히 조사 중입니다. 여기에 설명된 핵 내 Hi-C 방법의 적용은 노치 유전자를 분리하는 TAD 경계에서 건축 단백질(AP)결합 부위의 기능을 해부하는 데 도움이 되었다. AP의 손실을 일으키는 도메인 경계의 유전자 변형은 TAD 융합, 전사 결함 및 장거리 토폴로지 변경을 초래합니다. 이 결과는 Drosophila에 있는 도메인 경계 형성 및 유전자 발현 통제에 유전 요소의 기여를 보여주는 증거를 제공했습니다. 여기서, 핵 내 Hi-C 방법은 프로토콜과 함께 실험의 품질을 평가하기 위한 중요한 체크포인트를 제공하는 상세하게 기술되었다. 또한 다른 게놈 비늘에서 게놈 상호 작용을 분석하기 위해 시퀀싱 판독 및 유효한 Hi-C 쌍의 필요한 숫자가 도시되어 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집 은 규제 요소의 유전자 편집 및 이 핵 내 Hi-C 프로토콜을 사용하여 게놈 상호 작용의 고해상도 프로파일링은 유전 적 요소의 구조적 기능의 조사를위한 강력한 조합이 될 수 있습니다.

다음은 성공적인 Hi-C 프로토콜의 결과입니다(그림 1A의Hi-C 프로토콜 워크플로우 요약 참조). 핵 하이-C 실험 중에는 여러 가지 품질 관리 검사점이 있습니다. 샘플 알리쿼트는 (UD) 및 후 (D) 크로마틴 제한 단계뿐만 아니라 결찰 후(L)를 수집하였다. 크로스링크는 반전되었고, DNA는 정제되어 아가로즈 젤로 실행되었다. Mbo에 대한 제한이 성공했을 때 200-1000 bp의 얼룩이 관찰되었습니다(도1B). 분자의 예상 크기는 선택의 제한 효소에 따라 달라집니다. 결찰이 성공하면, 높은 분자량 대역이 겔의 상부에서보였다(도 1B). 소화 효율은 또한 프로토콜에 상세히 설명된 바와 같이 qPCR에 의해 확인될 수 있다. 허용 가능한 소화 효율은 80%이상입니다(그림 1C).
<p class="jove...

게놈은 핵 공간에서 염색체 형성 포획 기술을 통해 드러나게 할 수 있는 다른 구조물로 조직됩니다. 핵 내 Hi-C 방법은 드로소필라 세포주에서 크로마티닌 상호작용의 게놈 전체 컬렉션을 제공하며, 이는 제한 단편 수준에서 메가베이스 해상도로 탐색할 수 있는 접촉 맵을 생성합니다.

드로소필라 세포의 인핵 하이-C

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

핵 Hi-C 프로토콜은 게놈을 구성하는 크로마틴 루프, 도메인 및 구획의 특성화를 위한 다른 해상도에서 염색체 확인의 탐구를 허용합니다. 이 프로토콜은 다양한 비늘에서 게놈 상호 작용의 고해상도 프로파일링을 제공하여 전체 범위의 게놈 거리및 데이터 범위에 걸쳐 기술적 소음이 적은 보다 일관된 커버리지를 제공합니다. 이 프로토콜을 유전자 편집과 결합하는 것은 유전 적 요소의 구조적 기능을 테스트하기위한 강력한 전략입니다.그것은 또한 질병으로 이끌어 내는 구조적인 변이의 특성화에 적용될 수 있습니다. 핵 Hi-C 프로토콜은 어떤 진핵 게놈의 게놈 조직을 탐구하기 위하여 적용될 수 있습니다. SDS 및 Triton 처리를 수행하면 응집체가 효소 반응 효율을 방해하고 시퀀싱 전에 적절한 품질 제어 측정을 수행하므로 파이펫팅으로 핵 덩어리가 분해됩니다.7회 슈나이더의 라인 2 Plus 드로소필라 세포에 메탄올 프리 포름알데히드를 10회 10회에 추가하여 슈나이더 배지의 17.5 밀리리터에 10%의 FBS를 보충하여 60초마다 혼합하거나 회전하는 휠에 10분 동안 세포를 배양하고, 글리신을 최종 12.02의 마지막 농도로 혼합하여 10분간 첨가합니다. 실온에서 5분, 얼음에서 15분 후에, 원심분리로 세포를 수집하고 차가운 PBS의 25밀리리터에서 펠릿을 조심스럽게 재보습하고 또 다른 원심분리로 세포를 수집합니다. 원심분리의 끝에서, 계산을 위한 얼음 냉용 리시스 버퍼의 1 밀리리터에서 세포를 재보중단하고 밀리리터 농도당 6개의 세포로 10번으로 세포를 조정한다.30 분 동안 얼음에 세포를 배양하고, 튜브를 2 분마다 반전하여 다른 원심 분리와 세포를 혼합하고 수집합니다. 신선한 얼음 차가운 리시스 버퍼의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다. 원심 분리 후 1.25X 제한 버퍼1밀리리터로 리세이트세척을 세척합니다.다시 원심 분리기는 lysate를 수집합니다. 360 마이크로리터의 신선한 제한 버퍼와 11 마이크로리터의 펠릿을 37°C에서 45분 동안 조심스럽게 배관하고 배양하여 가끔 파이프팅으로 분당 7~950회전을 반복합니다. 인큐베이션의 끝에서, 비 이온 계면활성제의 75 마이크로 리터와 투과화를 중지하고 가끔 파이펫으로 분당 950 회전에서 흔들림과 추가 45 분 동안 인큐베이터에 튜브를 반환합니다.크로마틴 소화의 경우, 200단위의 Mbo1을 튜브에 넣고 회전시 섭씨 37도에서 4~16시간 배양에 넣습니다. 인큐베

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 프로토콜은 해부 Drosophila의 유충에 immunohistochemistry을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

초파리의 조직은 종종 세포 유형의 이종 혼합물을 포함한다. 특정 조직으로부터 특정 세포 유형에서의 유전자 발현을 조사하기 위해, 핵 유전자 태그이어서 궁합 기반 접근 방식을 사용하여 단리 할 수​​있다. 격리 핵은 유전자 발현 분석 및 면역 침전과 같은 염색질 하류 애플리케이션에 사용될 수있다.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

상처 유발 다중계화는 세포가 세포 손실을 보상하기 위해 분할하는 대신 크기로 성장하는 보존된 조직 수리 전략입니다. 여기에 상피 상처 수리에서 ploidy 및 유전 적 조절을 측정하는 모델로 과일 비행을 사용하는 방법에 대한 자세한 프로토콜입니다.

상처로 인한 다중계를 연구하는 드로소필라 모델

이 프로토콜의 목표는 열 응력에 따라 드로소필라 배아및 이미지 내 핵 액틴 로드 어셈블리에 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴을 주입하는 것입니다.

살아있는 열에 있는 화상 진찰 내 핵 액틴 막대는 Drosophila 배아를 강조했습니다

이 프로토콜은 드로소필라 폴리텐 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것을 목표로 한다.

드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

5-에티닐-2'-데옥시리딘(EdU) 및 인산히스톤 H3(pH3) 라벨링을 함유한 세포 주기 분석은 광범위한 최적화를 요구할 수 있는 다단계 절차이다. 여기서는 상이한 세포 주기 단계에서 세포를 구별하기 위해 이미지 분석 및 정량화를 포함한 이 절차에 대한 모든 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다.

Drosophila 신경 줄기 세포에서 세포 주기 진행 분석을 위한 5-에티닐-2'-Deoxyuridine/인성-히스톤 H3 이중 라벨링 프로토콜

Drosophila에서,oocyte 핵은 oogenesis 도중 microtubule 의존적인 이주를 겪습니다. 여기서, 우리는 계란 챔버 전 vivo에라이브 이미징을 수행하여 마이그레이션을 따라 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 우리의 절차는 회전 디스크 공초점 현미경 검사를 사용하여 다중 위치 3D 타임 랩스 영화를 취득하기 위해 12 시간 동안 살아있는 계란 챔버를 유지합니다.

드로소필라 오키테의 핵 이주

이 프로토콜은 초파리 흑개척 유충 시립엽에서 하이브리드화 연쇄 반응 형광 제자리 하이브리다이제이션(HCR-FISH)을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 탐침 설계, 하이브리다이제이션, 증폭, 조직 장착 절차가 상세히 설명되어 발달 중인 시엽의 시각화를 용이하게 합니다.

발달 중인 초파리 시엽에서의 잡종화 연쇄 반응 FISH

학습하세요 드로소필라 세포의 인핵 하이-C 프로토콜을 통해 염색질 상호작용을 고해상도로 프로파일링하는 방법을. CRISPR/Cas9 유전자 편집과 결합하여 TAD 경계의 구조적 기능을 연구할 수 있습니다.

드로소필라 세포의 인핵 하이-C

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