Name: 살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 학습하세요 살아있는 췌장 조직 조각법을 통해 아일렛 생리 기능과 면역 세포 상호 작용을 관찰하는 방법을. 이 기법은 제1형 및 제2형 당뇨병 등 췌장 질환의 병리 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH 보조금 R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638, P01 AI042288에 의해 지원되었다. 이 연구는 당뇨병을 가진 췌장 기관 기증자를 위한 네트워크의 지원으로 수행되었습니다 (nPOD; RRID:SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)가 후원하는 공동 타입-1 당뇨병 연구 프로젝트, 레오나 M. & 해리 B. 헬름슬리 자선 신탁 (그랜트 #2018PG-T1D053). 표현된 내용과 견해는 저자의 책임이며 반드시 nPOD에 대한 공식 적인 견해를 반영하지는 않습니다. 연구 자원을 제공하기 위해 nPOD와 협력하는 장기 조달 조직 (OPO)은 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ 나열됩니다. 마우스 조각을 생성하는 데 사용되는 진동을 제공 해 준 플로리다 대학교 케빈 오토 박사에게 감사드립니다.

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜의 목적은 기능및 면역학적 연구에서 슬라이스를 사용하는 데 필요한 췌장 슬라이스 생성과 절차를 구체화하는 것입니다. 라이브 췌장 슬라이스를 사용하는 데는 많은 이점이 있습니다. 그러나, 조직이 기술된 실험 프로토콜 도중 실행 가능하고 유용한 상태를 유지하는 데 필수적인 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 신속하게 작업하는 것이 필수적입니다. 췌장을 주입하고 진동에 조각을 생성하는 사이의 시간의 길이는 조직의 생존력을 유지하기 위해 최소화되어야한다. 실온 ECS가 아닌 슬라이스하기 전에 췌장을 차가운 ECS에 보관함으로써 생존도 향상됩니다. 중요한 것은, 조각은 프로테아제 억제제없이 매체에 없어야합니다. 프로테아제 억제제 없이 슬라이스를 배양하면 생존율이 크게 감소합니다.
염료 로딩 중에 슬라이스가 억제제 없이 잠시 방치되었을 때, 높은 포도당에 대한 응답으로 Ca2+ 플럭스는 더 이상 기저 활성이 여전히 슬라이스에서 볼 수 있음에도 불구하고 기록될 수...

췌장의 참여는 췌장염, T1D 및 T2D1,2,3과 같은 질병에 대한 병증이다. 격리된 섬에서의 기능에 대한 연구는 일반적으로 주변 환경에서 섬을 제거하는 것을 포함한다4. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 그대로 있는 유일학 소환경을 유지하고 스트레스가 많은 아슬렛 격리 절차의 사용을 피하면서 췌장 조직의 연구를 가능하게 하기 위하여 개발되었다5,6,7. 인간 기증자 조직에서 췌장 조직 조각 은 성공적으로 T1D를 연구하는 데 사용되었으며 면역 세포 침투 외에 베타 세포 손실 및 기능 장애의 과정을 입증했습니다8,9,10,11,12,13. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 마우스와 인간 췌장 조직 5,6,8 모두에 적용될 수 있다. 장기 기증자 조직에서 인간 췌장 조직 조각 당뇨병을 가진 췌장 기관 기증자를 위한 네트워크와의 협력을 통해 얻어진다 (nPOD). 마우스 슬라이스는 다양한 마우스 균주로부터 생성될 수 있다.
이 프로토콜은 비 비만 당뇨병 재조합 활성화 유전자-1-null (NOD)에 초점을 맞출 것이다. Rag1/-) 및 T 세포 수용체 형질화(AI4) (NOD. Rag1/-. AI4 α/β) 마우스 균주. 끄덕이다. Rag1/-- 마우스는 재조합 활성화 유전자 1 (Rag1)14에 있는 중단 때문에 T와 B 세포를 개발할 수 없습니다. 끄덕이다. Rag1/-. AI4 α/β 마우스는 인슐린의 에피토프를 표적으로 하는 단일 T 세포 클론을 생성하기 때문에 가속형 1당뇨병을 위한 모델로 사용되며, 그 결과 일관된 축색 침투및 급속한 질병 개발15가 발생한다. 여기에 소개된 프로토콜은 공초점 현미경 접근법의 적용을 통해 살아있는 인간 및 마우스 췌장 조각을 사용하여 기능및 면역학 연구를 위한 절차를 설명합니다. 본 원에 기술된 기술은 생존 가능성 평가, 아슬렛 식별 및 위치, 세포성 Ca2+ 기록뿐만 아니라 면역 세포 집단의 염색 및 식별을 포함한다.

<table><tbody><tr><td># 3 스타일 메스 손잡이</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>HEPES 완충액, 1M 용액</td></tr><tr><td>10cm 처리되지 않은 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok 주사기</td><td>BD</td><td>301029</td><td>BD 주사기 Luer-Lok 팁 27</td></tr><tr><td>G 바늘</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>BD 일반 사용 및 PrecisionGlide 피하 주사 바늘</td></tr><tr><td>35mm 커버 유리 바닥 페트리 접시</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro; -접시 35mm, 높은</td></tr><tr><td>50mL 주사기</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>8-웰 챔버 커버 글라스</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro;-Slide 8 Well</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD8a 항체</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (dihydrate)</td></tr><tr><td>컴팩트 디지털 로커</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88880020</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>핀홀&thinsp;= 1.5-2 통풍이 잘되는 단위; 512&period;에서 10x/0.40 개구수 HC PL APO CS2 건식 및 20x/0.75 개구수 HC PL APO CS2 건식 대물렌즈로 획득; &시간; &얇은sp; 512 픽셀 해상도</td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>시그마</td><td>G7021</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>디티존</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>디메틸 설폭사이드</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Laboratories</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35mm 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Falcon Easy-Grip 조직 배양 접시</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Feather No. 10 수술용 블레이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>세포 투과성 Ca2+ 표시기</td></tr><tr><td>젤 제어 슈퍼 글루</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>경화 파인 사이</td>언스 도구 파인 사이언스 <td>도구</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>Fisherbrand</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson 수의학</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>존스 홉킨스 불독 클램프</td><td>Roboz 수술 상점</td><td>RS-7440</td><td>&nbsp; 곧장; 500-900 그램 압력; 1.5" 길이</td></tr><tr><td></td><td>Kimwipes Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td>Kimtech 과학&무역; 킴와이프스&트레이드; 섬세한 작업용 와이퍼, 2-플라이</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 생존력/세포독성 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>이 키트에는 칼세인-AM 생세포 염료가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>저포도당 DMEM</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마</td><td>M9272</td><td>MgCl2 (hexahydrate)</td></tr><tr><td>황산마그네슘 heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO4 (heptahydrate)</td></tr><tr><td>자기 가열 플랫폼</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-1</td><td>동적 자극을 위한 이미징 챔버용 플랫폼 녹음</td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 주사기 필터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>No.4 Paintbrush</td><td>Michaels</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>Open Diamond Bath 이미징 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td>동적 자극 녹음용 이미징 챔버</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>세포 투과성 Ca2+ 인디케이터</td></tr><tr><td>오버나이트 이미징 챔버</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td>슬라이스 생성을 위한 아가로스를 만들기 위해</td></tr><tr><td>PE 표지 인슐린 테트라머</td><td>Emory Tetramer Research 코어</td><td>서열 YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 Sigma</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Razor</td><td>Blades Electron Microscopy Sciences</td><td>71998</td><td>For Vibratome; 양면 스테인리스강, 코팅되지 않은</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque 저 융점 아가로스</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>슬라이스 생성을 위한 아가로스를 만들기 위해</td></tr><tr><td>Slice 앵커</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>Slice anchor (dynamic imaging)</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Slice anchor for dynamic imaging chamber</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>인산나트륨 일수화물</td><td>시그마</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4 (일수화물)</td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>Glycine max (대두)의 트립신 억제제</td></tr><tr><td>Stage 어댑터</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>현미경 스테이지에서 동적 자극 기록을 위한 이미징 챔버에 맞게</td></tr><tr><td>스테이지 상단 인큐베이터</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>Leica</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>청색 형광 핵산 염색</td></tr><tr><td>Transfer Pipet</td><td>Falcon</td><td>357575</td><td>팔콘&트레이드; 플라스틱 일회용 전송 피펫</td></tr><tr><td>밸브 제어 시스템</td><td>Warner Instruments</td><td>VCS-8</td><td>동적 자극 녹음용 시스템</td></tr><tr><td>Vibratome VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td>Fisherbrand Isotemp 범용 디럭스 수조 GPD 02</td></tr></tbody></table>

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

살아있는 췌장 조직 조각은 그대로 있는 작은 액상 미세 환경의 맥락에서 islet 생리학 및 기능의 연구를 허용합니다. 슬라이스는 아가로즈에 내장된 살아있는 인간과 마우스 췌장 조직에서 제조되고 진동기를 사용하여 절단합니다. 이 방법을 사용하면 조직이 타입-1(T1D) 및 타입-2 당뇨병(T2D)과 같은 근본적인 병리를 보존하는 것 외에도 생존력과 기능을 유지할 수 있게 한다. 상기 슬라이스 방법은 췌장의 내분비 및 외신 조직을 포함하는 복잡한 구조및 각종 세포간 상호작용의 유지를 통해 췌장의 연구에서 새로운 방향을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 췌장 생리학의 평가와 함께 췌장 슬라이스 내에서 살아있는 내인성 면역 세포의 염색 및 시간 경과 현미경 검사를 수행하는 방법을 보여줍니다. 또한, 이러한 접근법은 주요 조직적합성 복합-다중머 시약을 사용하여 아슬레 세포 항원을 특이화하여 면역세포 집단을 분별하기 위해 정제될 수 있다.

이 프로토콜은 기능 성 연구 와 면역 세포 기록 모두에 적합한 살아있는 췌장 조직 조각을 산출합니다. 밝은 필드와 반사된 빛의 슬라이스 모양은 그림 1A, B에 표시됩니다. 논의된 바와 같이, 섬은 인슐린 함량(도 1C)으로 인해 발생하는 세분성 으로 인해 반사된 빛을 사용하여 슬라이스에서 발견될 수 있으며, 반사광이 사용될 때 배경 조직에 비해 명확하게 관찰된다. 생존 가능성은 슬라이스 생성 다음 평가되어야 하며, 섬의 20% 이상이 실행 가능하지 않은 경우 섬이 기록되어서는 안 됩니다. 생존가능성이 높은 이점은 도 1D에 표시되는 반면, 제대로 처리되지 않은 슬라이스의 예는 보충 도 1에 표시됩니다. 생존가능성이 낮은 섬은 무거운 SYTOX 블루 염색을 가지며, 조직은 죽은 세포의 스테인드 핵으로 덮여 있을...

이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

우리의 프로토콜은 면역 세포 상호 작용이 islet 기능에 미치는 영향에 대답하는 데 도움이 될 것입니다. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 조직 생리학 및 기능을 연구할 수 있게 해 주며, 근본적인 병리및 기본 미세 환경을 유지한다. 이 방법은 췌장염, 타입-I 당뇨병 및 타입 II 당뇨병과 같은 췌장 병의 질병 프로세스에 대한 통찰력을 제공할 수 있었습니다.먼저, 시편 홀더에 블록을 블레이드 너비를 초과하지 않는 방식으로 정렬하여 진동이 느리게 움직일 때 블레이드가 가능한 최소 거리를 앞으로 이동할 수 있도록 합니다. 시편 홀더에 슈퍼 접착제 라인을 적용하여 접착제 디스펜서의 끝을 사용하여 얇은 층을 만든 다음 조직 블록을 접착제에 뒤집어 조직에 가까운 측면이 위쪽으로 향하도록 합니다. 블록을 부드럽게 밀어 3 분 동안 접착제를 건조하게.다음으로, 나사로 진동에 접시를 부착하고 블레이드가 블록의 길이를 넘어 겨우 그 위에 움직일 수 있도록 이동중인 블레이드 높이와 거리를 조정합니다. 덩어리를 집게로 부드럽게 움직여 접착제가 건조되었는지 확인한 다음, 블레이드가 덮일 때까지 차가운 세포 외 용액으로 진동 트레이를 채웁니다. 진동을 설정하여 120 마이크로미터 두께의 슬라이스를 만들고 시작한 다음 조직 블록에서 나오는 조각을 관찰합니다.페인트브러시나 집게를 아래에 놓고 블록에서 부동할 때 슬라이스를 들어 올리고, 3밀리몰러 D-포도당과 트립신 억제제를 함유한 크렙스 링거 중탄산염 버퍼에 슬라이스를 놓습니다. 슬라이스가 들어 있는 플레이트를 로커에 놓고 실온에서 25RPM에서 1시간 동안 배양합니다. 슬라이스를 더 오래 보관해야 하는 경우 슬라이스를 슬라이스 배양 배지 의 15 밀리리터에 놓고 접시를 인큐베이터에 놓습니다.같은 날 의 연구를 위해 37°C의 준비된 슬라이스를 배양하거나 실험 전 최소 한 시간 동안 섭씨 24도에서 섭씨 37도로 배양되는 슬라이스를 이송한다. 기록 하기 전에 적어도 한 시간 현미경을 전환 하 고 37 섭씨 37 도 무대 상단 인큐베이터를 평형. 무대의 슬라이스가 들어 있는 커버 글래스 하단 페트리 접시를 고정합니다.브라이트필드 모드에서 10X 목표를 설정하여 현미경에 초점을 맞추고 슬라이스 내에서 주황색 갈색 타원형을 찾아 밝은 필드 모드를 사용하여 섬을 찾습니다. 현미경의 터치 스크린 컨트롤러에 CS 버튼을 눌러 현미경을 공초점 이미징으로 전환합니다. 반사도를 사용하여 섬을 보려면 638 레이저 검출기 및 PMT 검출기를 켭니다.레이저 전원을 1~2% 설정하고 노치 필터를 끕니다. 405 나노미터 레이저 및 PMT 검출기를 사용하여 핵산 얼룩을 관찰한다. CD8 항체 검출및 488 나노미터 레이저 및 하이브리드 검출기를 위한 하이브리드 검출기는 인슐린 테트라머를 볼 수 있다.스테이지 컨트롤러의 X 및 Y 노브를 사용하여 시야에 관심 있는 별의 중심을 이용하여 센터. 관심 있는 것이 있으면 20X 목표로 전환하고 확대하여 이 점은 프레임의 대부분을 차지합니다. 아일렛의 z 스택을 가지고, 다음 세포가 살아 있고 모든 주변 면역 세포가 초점을 맞추고있는 최고의 광학 섹션을 찾을 수 있습니다.현미경을 XYZT 모드에서 기록하도록 설정하고 설정을 최적화하여 몇 시간 동안 20분마다 선택한 단계의 z 스택을 기록합니다. 췌장 조직 조각의 섬은 밝은 필드를 사용하여 시각화하고 빛 현미경 을 반사했다. 섬내 인슐린은 세분성을 증가시키고 다량의 반사된 빛의 흡수를 일으켜 섬의 가시성을 증가시킨다.살아있는 인간 췌장 조직 조각의 생존성은 염색에 의해 평가되었습니다. 살아있는 세포는 녹색으로 표시되고 죽은 세포는 파란색으로 표시됩니다. 생존가능성에 대한 또 다른 긍정적인 지표는 관찰 가능한 기초 활동입니다.살아있는 췌장 슬라이스가 세포 투과성 칼슘 지표로 로드되었을 때, 포도당 자극은 마우스와 인간 췌장 조각 모두에서 관찰되었다. 포도당 자극 중 개별 세포의 형광도 정량화되었다. 손상되지 않은 병은 디티존 염색 및 반사된 광 현미경 검사를 사용하여 관찰되었다.병에 걸린 섬은 면역 세포 침투 및 세포 죽음 때문에 세분성을 잃기 시작합니다. 면역 세포 인구는 CD8 항체 및 인슐린 테트라머 염색을 사용하여 확인할 수 있습니다. 공동 염색은 세포가 인슐린 항원을 구체적으로 표적으로 하는 이펙터 T 세포임을 나타낸다.이 절차에서 기억해야 할 가장 중요한 것은 항상 용액 프로테아제 억제제에 슬라이스를 유지하는 것입니다. 이 절차에 따라 면역 세포 실험에 있는 수많은 기능은 면역 세포 상호 작용및 아슬렛 기능의 효력을 공부할 수 있도록 수행될 수 있습니다.

observing-islet-function-islet-immune-cell-interactions-live

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

immunohistochemically 스테인드 췌장 표본의 대규모 조달 및 분석의 새로운 컴퓨터를 이용한 방법에 설명되어 있습니다 : 전체 섹션 (1) 가상 슬라이스 캡처를, 대규모 데이터 (2) 질량 분석, 2D 가상 조각 (3) 재건 (4) 3D 아일릿 매핑, 그리고 (5) 수학 분석.

컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 췌장 아일릿 질량, 크기 유통과 건축의 부량

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

우리는 급성 췌장 조직 조각의 준비와 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에서의 사용을 제시하여 많은 수의 살아있는 세포, 오랜 기간 동안 그리고 높은 시공간 분해능으로 칼슘 역학을 동시에 연구합니다.

급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

이 프로토콜은 거의 생리학적 조건에서 세포 기능을 연구하기 위해 사망한 장기 기증자로부터 인간 췌장 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 혁신적인 접근법은 정상 및 구조적으로 손상된 섬과 내분비 구획 간의 복잡한 상호 작용을 조사할 수 있게 합니다.

내분비 및 외분비 췌장 생리학을 연구하기 위해 인간 췌장 조직 절편 생성

학습하세요 살아있는 췌장 조직 조각법을 통해 아일렛 생리 기능과 면역 세포 상호 작용을 관찰하는 방법을. 이 기법은 제1형 및 제2형 당뇨병 등 췌장 질환의 병리 메커니즘 연구에 활용됩니다.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

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