Name: iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 배우세요 iPSC-대식세포를 이용한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증 정량 분석 방법을. 고내용 이미징을 통해 미세아교세포의 탐식 기능을 신경퇴행성 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 높은 함량현미경 검사법에 대한 도움을 준 발 밀러 박사와 소하이브 니자미 박사와 고함량 현미경에 대한 접근을 위한 다니엘 이브너 박사에게 감사드립니다. 또한, 저자는 분석 개발 조언에 대한 박사 엠마 미드, 부인 캐시 브라운 iPSC 지원을 감사드립니다. 이 작품은 알츠하이머 연구 영국 옥스포드 약물 발견 연구소에 의해 지원되었다 (ARUK ODDI, 보조금 참조 ARUK-2020DDI-OX), 옥스포드 마틴 학교 LC0910-004에서 제임스 마틴 줄기 세포 시설 옥스포드에 추가 지원 (S.A.C.); 파킨슨 병 영국에서 기념물 신뢰 발견 상 (J-1403); MRC 치매 플랫폼 영국 줄기 세포 네트워크 자본 장비 MC_EX_MR/ N50192X/1, 파트너십 MR/N013255/1, 모멘텀 MC_PC_16034 어워드.

<ol><li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748(2013).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).</li>
<li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).</li>
<li>Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+in+the+brain%3A+Homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease.</a> Frontiers in Immunology. 10, 790(2019).</li>
<li>Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+inflammation+and+phagocytosis+in+Alzheimer%27s+disease%3A+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).</li>
<li>Brown, G. C., Neher, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of live neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).</li>
<li>Scott-Hewitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+externalization+of+phosphatidylserine+mediates+developmental+synaptic+pruning+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 105380(2020).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+splicing+isoform+of+GPR56+mediates+microglial+synaptic+refinement+via+phosphatidylserine+binding%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding.</a> The EMBO Journal. 39 (16), 104136(2020).</li>
<li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+externalization+results+from+and+causes+neurite+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li>
<li>Skjesol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TLR4+adaptor+TRAM+controls+the+phagocytosis+of+Gram-negative+bacteria+by+interacting+with+the+Rab11-family+interacting+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2.</a> PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684(2019).</li>
<li>Wong, K., Li, X., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+induces+elevation+of+intracellular+calcium+and+phosphatidylserine+externalization+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets.</a> Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).</li>
<li>van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li>
<li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li>
<li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+Alzheimer%27s+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout%2C+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151(2020).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer%27s+disease+not+evident+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li>
<li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+robust+Z%27+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699(2020).</li>
<li>Fernandes, H. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+Stress+and+Autophagic+Perturbations+Lead+to+Elevated+Extracellular+%CE%B1-Synuclein+in+GBA-N370S+Parkinson%27s+iPSC-Derived+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).</li>
<li>Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neurons+without+inflammation+by+microglial+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).</li>
<li>Kober, D. L., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2-ligand+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">TREM2-ligand interactions in health and disease.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+clearance+of+apoptotic+neurons+by+microglia%2Fbrain+macrophages+in+vitro%3A+Involvement+of+lectin-%2C+integrin-%2C+and+phosphatidylserine-mediated+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).</li>
<li>Hsieh, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TREM2+ligands+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+neuronal+cells+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).</li>
<li>Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+microglial+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+the+brain+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease.</a> Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49(2018).</li>
<li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li>
<li>Shirotani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminophospholipids+are+signal-transducing+TREM2+ligands+on+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Garcia-Reitboeck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia-like+cells+harboring+TREM2+missense+mutations+show+specific+deficits+in+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis.</a> Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Microglia는 세포 세포 신경세포의 phagocytosis를 포함하여 신경 퇴행성 질병의 개시 그리고 진행에 영향을 미치는 중요한 기능을 가지고 있습니다. 손상된 microglial phagocytosis 및 시 냅 스의 부적 절 교 감 증 둘 다 신경 퇴행 성 질환과 관련 된, 기본 메커니즘 및 인과 잘 이해 되지 않지만4,23. 이 논문은 iPSC-대식세포에 의한 세포 세포 의 식세포증을 측정하는 식세포 분석법을 간략하게 설명하며, 라이브 셀 타임랩스 이미징 판독또는 고정 셀 고함량 현미경 검사법 또는 단일 분석기의 조합으로 구성된다. 이 다재다능함은 분석이 몇 가지 우물에서 시간이 지남에 따라 개별 phagocytic 이벤트를 연구하는 데 사용되거나 여러 조건이나 치료법으로 고함량 스크리닝에 사용될 수 있음을 의미합니다. 고함량 분석이 단일 타임포인트에 고정되므로 여러 분석 플레이트를 동시에 준비할 수 있습니다. 고함량 분석은 질병 관련 유전 이체로 대식세포/마이크로글리아를 특성화하거나 식세포증의 변화에 대한 작은 분자 억제제를 선별하는 잠재적 인 유틸리티를 가지고 있습니다. 분석은 또한 쉽게 다른 microglia 모델의 phagocytosis를 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다, 또는 잠재적으로 성상 세포. 식증 분석은 잠재적으로 살아있는 세포 이미징 얼룩, 예를 들어, 미토콘드리아, 칼슘, 또는 ROS 지표로 멀티플렉스화될 수 있으며, 단백질에 대한 고정 후 면역형광 염색을 수행할 수 있다. 세포 세포 세포를 활용하는 기존의 식세포 분석법에 비해, 이 프로토콜이 부여하는 주요 장점은 phagocytic 화물의 제조가 비교적 간단하고 빠르며 균일 한 제품으로 초래한다는 것입니다. 다른 아세약은 2시간 25분, 오카다산용 2시간 25분, 4-16h26,27,28,29 또는 UV-조사용 S-니트로소-L-시스테인을 가진 뉴런 또는 SH-SY5Ys의 세포 나 SH-SY5Ys의 세포멸을 유도하고, 24h30의세포에서 다른 세포에 발생할 수 있다. 더욱이, 살아있는 세포 화상 진찰 및 고함량 화상 진찰 읽기는 저자가 인식하는 한, 이전에 설명되지 않았습니다. 파포름알데히드 고정을 사용하여 phagocytic 화물을 준비하는 주요 제한은 세포가 더 작은 크기로 인해 세포가 세포로 분할되는 것을 막기 때문에 세포가 세포가 세포가 세포로 분할되는 것을 완전히 재구성하지 않는다는 것입니다. 그것은 고정이 phagocytes를 유치하는 표적 세포에서 뉴클레오티드 "나를 찾아"신호 (예를 들어, ATP, UDP)의 분비에 어떤 효과 고정이 있는지 알 수 없습니다. 세포 세포와 유사하게, 고정된 SH-SY5Ys는 요오드제를 프로피듐에 대한 일부 멤브레인 투과성을 나타낸다. 멤브레인 투과성은 "나를 찾아"신호의 방출과 관련이 있습니다; 그러나, 이것은 고정된 SH-SY5Ys에서 공부되지 않았으며, 뉴클레오티드가 너무 빨리 방출되는 경우에, SH-SY5Ys가 iPSC-대식세포에 추가되기 전에 멀리 세척될 것이다.
프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 pH 에스테르가 있는 죽은 SH-SY5Y를 pH 에스테르로 염색하는 것입니다. 이 염료는 죽은 SH-SY5Ys의 표면에 무료 기본 아민과 신속하고 공유적으로 반응한다. 염색 지속 시간을 최적화할 필요가 없습니다. 그러나 라벨을 붙이기 전에 염료를 처리하는 데 주의를 기울여야 합니다. 라벨링 반응은 무료 아민을 포함하는 버퍼에서 수행되어서는 안 됩니다. 더욱이, DMSO 재고가 감기 수성 완충또는 높은 최종 농도로 희석될 경우 강수량이 발생할 위험이 있다. 침전물은 현미경의 밑에 조밀한 어두운 객체로 나타납니다. 또한, pH 에 민감한 염료 용액은 일반 플라스틱 원심분리기 튜브에 달라 붙어 천천히 하스포합니다. 따라서 라벨링 단계에는 바인딩이 낮은 튜브가 권장됩니다. pH 에 민감한 염료를 사용하면 영구적으로 형광 염료 대신 에광된 입자의 식별을 돕고 플라즈마 멤브레인을 접대하는 입자에 대해 도움을 줄 수 있습니다. 중립 pH에는 약간의 형광이 있기 때문에, 식세포 화물및 iPSC-대식세포의 밀도는 정확한 세분화를 위해 충분히 낮게 유지되어야 하지만, 수많은 식세포 이벤트가 포착될 만큼 충분히 높습니다. 고함량 현미경 검사는 우물에서 화물의 중간 밀도(iPSC-대식세포당 2SH-SY5Ys 이상)로 식증을 정확하게 식별할 수 있었습니다. 반대로, 깊은 적색 스펙트럼에서 현미경의 민감도가 약하기 때문에, 살아있는 세포 시간 경과 이미징 데이터에서 iPSC-대식세포의 세분화는 자신감이 부족하고 거짓 긍정의 가능성을 줄이기 위해 화물의 매우 낮은 밀도를 사용해야 했습니다 (2 개의 iPSC-대식세포마다 1 SH-SY5Y). 적절한 세분화 및 화물 밀도의 검증은 처리되지 않은 및 사이토샬라신 D 처리 우물 사이의 비교와 함께 수행되어야합니다. 잘 최적화된 분석에서, cytochalasin D는 처리되지 않은 견본에 비해 세포 당 반점의 평균 수를 90% 감소시켜야 합니다.
프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 iPSC-대식세포 염색으로, 이는 모든 외부 SH-SY5Y가 개구부에서 제외되도록 세포를 이미지 분석에서 식별하고 분할할 수 있도록 하는 것입니다. 권장염료는 세포 감이 있으며 세포질 내불용 형광 제품으로 변환되어 고칠 수 있으며 독성이 없습니다 (재료 표참조). 염색 단계는 고함량 이미징 phagocytosis 분석과 iPSC-대식세포의 사용에 최적화되었으며, 다른 세포 유형을 사용하는 경우 다시 최적화되어야 한다고 제안합니다. 세포 염색의 지속 기간은 세포 내의 불용성 형광 제품의 증착을 향상시키기 위하여 증가할 수 있습니다. 염료 농도가 최적화되면 유기 용매 차량의 독성 수준을 피하기 위해주의를 기울여야합니다.
분석의 성공에 대한 세 번째 중요한 요소는 데이터 분석입니다. 제공된 분석 파이프라인은 얼룩 강도 또는 세포 형태에 대한 차이로 인해 파이프라인의 세분화 효과를 기록할 수 있기 때문에 규범이 아닌 지침이 될 수 있습니다. 따라서 적절한 양수 및 음수 컨트롤에 대한 파이프라인 테스트와 최적화해야 하는 매개 변수를 프로토콜 텍스트에 표시하여 일부 최적화가 필요합니다. 부정적인 대조군은 SH-SY5Ys를 첨가하기 전에 iPSC-대식세포가 세포증 D와 같은 강력한 식세포 억제제로 미리 처리되는 조건을 포함해야 한다. 또 다른 가능한 부정적인 제어는 분석의 끝에 iPSC-대식세포의 이전에 처리되지 않은 우물에 SH-SY5Ys를 첨가하고, 고정하기 10 분 전에, 이는 화물의 일부 침전을 허용하지만 phagocytosis의 감사 수량에 너무 짧다. phagocytosis 이벤트는 깊은 적색 형광 채널을 사용하여 소프트웨어 알고리즘에 의해 정의된 iPSC-대식세포의 테두리 내의 적색 형광 개체로 정의됩니다. 세포의 세분화가 불량한경우(도 2),iPSC-대식세포에 근접한 많은 비-식세포 SH-SY5Y가 분석, 즉 거짓 긍정에 잘못 포함될 수 있다. 좋은 세분화를 달성하는 가장 중요한 요소는 iPSC-대식세포의 엄격한 묘사입니다. 두 해석모두에 대한 세분화가 자동화되므로 모든 셀에 대해 완벽한 세분화를 얻을 수 없습니다. 그러나 몇 가지 테스트 이미지를 참조로 사용하여 세분화를 보다 최적입니다. 사이토찰라신 D 제어는 이 조건에서 검출된 많은 수의 phagocytic 이벤트가 세분화가 최적이아님을 나타내기 때문에 최적의 세분화를 평가하는 데 중요합니다. 데이터 분석 파이프라인의 최적화는 세포당 phagocytic 이벤트의 수가 세포별 80%-90% 더 낮을 때까지 이상적으로 반복되어야 하며, 아토찰라신 D 조건에서는 억제제가 없다.
발생 가능성이 가장 높은 phagocytosis 분석의 문제점은 다음과 같습니다: (1) 양성 대조군에서 약한 pH 에 민감한 형광, (2) 분석의 끝에 대식세포의 희소 또는 고르지 않은 분포, 또는 (3) 비 phagocytosed SH-SY5Ys에서 분석에서 거짓 긍정의 높은 숫자. 약한 pH 에 민감한 형광의 문제 해결은 먼저 SH-SY5Ys의 염색이 강한 마젠타 색을 가진 세포 펠릿귀가 초래되었다는 것을 확인해야합니다. 색상이 약한 경우, 신선한 염료 재고가 사용되는지 확인하고, 라벨링 버퍼가 아민이 없는지 확인하고, 염색하기 전에 SH-SY5Y에 추가 세척을 추가하고, 정확한 수의 SH-SY5Y가 염색되었는지 확인하고, 염료 침전량이 증거가 없는지 확인하고, 염료 침전물의 농도를 최적화합니다. SH-SY5Y가 강하게 염색되면 분석판에 첨가된 농도가 정확한지 확인하고 iPSC-대식세포가 건강하고 너무 오래되지 않았는지 확인하십시오. 두 번째 유형의 문제인 고르지 않은 대식세포 분포는 파이펫 팅 중 세포의 손실로 인해 발생할 수 있으며 좁은 보어 팁을 피하면서 세포에서 경험하는 파이펫팅 력을 줄이기 위한 조치를 취해야 합니다. 문제가 남아 있으면 iPSC-대식세포를 세포 에 대한 무의미한 염료로 적재하는 잠복기 시간을 줄입니다. 세 번째 문제는 분석에서 비식세포 입자를 잘못 포함하는 것과 관련하여 분석 파이프라인의 최적화가 더 필요하다는 것을 나타냅니다. 문제 해결은 먼저 셀 세분화 및 소프트웨어가 인접 한 개체를 포함 하는지 여부에 초점을 맞추어야 합니다. 조정할 수 있는 특정 매개 변수는 관련 단계 이하의 노트에서 제안된다(라이브 셀 타임랩스 분석을 위한 단계 6.1.11-6.15 및 고함량 분석을 위한 단계 6.2.4-6.2.8). 세포 세분화를 더 개선할 수 없는 경우, 고함량 분석은 부적절하게 분할된 iPSC-대식세포를 배제하는 추가 단계(단계 6.2.8)를 가한다. 더욱이, iPSC-대식세포 내에서 pH 민감형의 허용된 반점을 걸러내는 모듈을 최적화하여 허용된 개체의 임계값 강도를 증가시켜 비-phagocytosed SH-SY5Ys를 배제하는 데 도움이 될 것입니다(라이브 셀 타임랩스 분석을 위한 단계 6.1.17, 및 높은 함량 분석을 위한 단계 6.2.11).
우리는 각각 장점과 한계가 있는 phagocytosis 분석에 대한 현미경 판독의 두 가지 유형을 개발했습니다. 라이브 셀 타임랩스 이미징은 phagocytosis 운동학에 대한 추가 정보를 제공하는 장점이 있으며 고콘텐츠 이미징 플랫폼보다 더 널리 사용할 수 있습니다. 권장된 오픈 소스 소프트웨어는 현미경 소스에 불가지론적이며 라이브 셀 타임 랩스 기능의 유무에 관계없이 양질의 형광 현미경과 함께 사용할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징의 주요 제한은 제한된 감도와 광학으로 iPSC-대식세포의 좋은 세분화를 감지하고 수행하는 것이 더 어려워집니다. 이 제한은 iPSC-대식세포 염색의 기간을 증가시키거나, 사용 가능한 경우에 더 민감한 현미경으로 전환하여 완화될 수 있었습니다. 고함량 이미징 식세포 분석은 고함량 이미징 시스템을 사용할 수 있는 경우 권장 판독입니다. 고콘텐츠 이미징 시스템은 더 높은 처리량과 보다 안정적인 데이터를 가능하게 하여 이 분석이 스크리닝에 사용될 수 있게 해주며, 이 분석은 "셀당 반점 수" 출력20에대해 ≥0.7의 강력한 Z'가 예상될 것으로 예상됩니다. 라이브 셀 타임랩스 방법에 비해, 고함량 현미경 판독기는 더 높은 감도, 높은 수준의 자동화 및 속도, 더 많은 우물 및 이미징 필드를 처리할 수 있으며 고해상도 공초점 이미지가 생성됩니다. 세포 세분화는 좋은 이미지로 더 효과적이며, 세분화는 고불규칙한 모양의 세포에 적합한 더 많은 세포 세분화 방법을 제공하는 고함량 이미징 분석 소프트웨어에 의해 추가적으로 지원된다. 고함량 이미징 분석 소프트웨어는 또한 phagocytosis의 더 많은 매개 변수를 계산, 오픈 소스 소프트웨어에 비해, 이러한 phagocytic 세포의 백분율등. 고함량 phagocytosis 분석의 주요 한계는 이미징 시스템 및 분석 소프트웨어의 비용과 접근성 중 하나입니다.
결론적으로, 이 논문에 제시된 정량적 phagocytosis 분석체는 체외에서 죽은 뉴런의 microglia phagocytosis를 모델링하기 위한 유용한 도구입니다. 마이크로글리아는 iPSC-대식세포에 의해 모델링되고 죽은 뉴런은 파라포름알데히드 고정 SH-SY5Ys에 의해 모델링됩니다. 비록 가장 본격적인 microglia 및 죽은/apoptotic 뉴런 모델 게시, 이들은 쉽게 준비 하 고 확장. 분석 자체는 매우 다재다능하며 두 가지 유형의 이미징 판독이 상세하며, 다른 마이크로글리아/대식세포 단양 모델 또는 다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 적응할 가능성이 있습니다. 고함량 이미징 판독값은 정량적 데이터를 얻기에 유리하며, iPSC-대식세포에서 식세포증의 소분자 변조기 또는 스크린 유전적 변이체까지 확장할 수 있다. 그러나 고함량 이미징 시스템은 비용이 많이 들고 데이터 가중이기 때문에 필요한 경우 양질의 기존 형광 현미경으로 대체 될 수있는 라이브 셀 타임 랩스 현미경을 사용하여 프로토콜에 대체 된 대체 된 이미징 판독이 프로토콜에 포함되었습니다.

Microglia는 뇌 조직 거주자 대식세포이며, 그들의 기능은 면역 감시를 포함, 상해 / 감염에 염증 반응을 조정, 시냅스 리모델링, 죽은 세포의 phagocytosis, myelin, 단백질 집계, 및 병원균. Phagocytosis는 microglia가 표면 수용체와 화물을 인식하고 다음화물의 저하를 위해 리소좀과 융합 phagosome로 개체를 삼키기 위해 자신의 세포 골격을 재구성하는 과정입니다. 건강한 microglia phagocytose 세포 세포는 괴사1되기전에 그들을 제거하는 것을. 세포 세포의 식세포는 또한 efferocytosis로 알려져 있으며, 죽어가는 세포2에의하여 인산다이들세린 "eat-me" 신호의 표시를 요구한다. 수많은 마이크로글리아 수용체는 TIM-4, BAI1, Stabilin-2 및 TREM2를 포함하여 인산염에 직접 결합합니다. Microglial TAM 수용체(예를 들어, MERTK) 및 인테그린은 각각 액세서리 단백질 GAS6 또는 MFG-E8을 사용하여 인파디델세린에 간접적으로 결합한다. 다른 "eat-me" 신호는 죽어가는 세포의 인식에 필요할 수 있습니다., 이들은 글리코실화 또는 표면 단백질의 전하에 변화를 포함; 세포 내 단백질 ICAM3, 칼레티쿨린, 세포 표면의 부속제-I의 발현; 산화 LDL; 또는 마이크로글리아 생산에 의한 세포 세포의 코팅은 C1q1,2를상량한다.
파킨슨병, 알츠하이머병, 전두엽 치매, 근위축성 측삭 경화증 을 포함한 신경퇴행성 질환은 죽은 세포, 골린 단편, 단백질 응집체 와 같은 뇌 폐기물의 축적을 포함하여 마이크로글리아 기능에 대한 손상과 관련이 있으며, 이러한자극3에대한 과장된 염증 반응. 식세포증은 신경 퇴행성 질환에서 손상될 수 있으며 노화, 염증 또는 특정 유전적 위험 변이체4,5의조합으로 인해 병리학에 기여할 수 있다. 한편, 마이크로글리아가 부적절한 식세포증이 가능한 뉴런 또는 시냅스6,7,8을할 수 있다는 신경퇴행성 질환의 동물 모델도 있다. 이 메커니즘은 마이크로글리아질 식세포 수용체 TREM2 또는 GPR56에 의해 직접적으로 감지되거나 간접적으로 용해 성 체형 C1q 코팅C1q코팅에 의해 감지되는 손상된 뉴라이트의 인산화제린 디스플레이에 의해 선동될 가능성이 높으며, 이는 CR3-phagois1, CR3-phagois1, 90-phagoistoted10에이르는 코피타이들벨세린 농축 멤브레인을 코팅하는 용해성 상류체에 의해 간접적으로 감지된다.
식세포 기능의 시험관 내 소사, 예를 들어, 마이크로글리아에서 유전 적 위험 변이체의 현상적 영향을 평가하기 위해, 라텍스 구슬4와같은 비생리적 화물을 사용하여 자주 수행된다. 형광으로 표지된 박테리아와 zymosan은 생리적이지만 신경 퇴행성 질환과 관련이 없는 사용됩니다. 비생리적 생리성 화물은 식세포 침몰의 기본 기계에서 결함을 감지하는 데 사용할 수 있지만 세포 신경의 phagocytosis에서 첫 번째 "인식"단계를 정확하게 모델링하지 못합니다. 화물의 크기, 모양, 강성 및 유형은 또한 활성화된 세포내 신호 경로를 지시하여 microglia 활성화 상태의 다른 결과를 초래합니다. 예를 들어, 대장균 균은 인간 세포와 달리 작고 뻣뻣하며, 표면에 있는 리포폴리사카라이드는 식세포증 및 프로 염증 신호 경로를 활성화하는 톨-유사 수용체 4(TLR4)에 의해 인식된다2,12.
신경 퇴행성 질환 연구의 맥락에서, 더 관련 phagocytic 화물 포유류 플라즈마 막에 인산화 체린 디스플레이 있을 것 이다, 이상적으로 인간과 신경 것, microglia 발생할 가능성이 신호를 포함. 이러한 식세포프로토콜의 경우, 인간 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y는 배양하기 쉬운 뉴런 모델로 선택되었다. 영구 표면 인산화제린 디스플레이는 파라포름알데히드에 의해 인위적으로 유도되었으며, 이는 이전에 혈소판13의포스파디들세린 디스플레이를 유발하는 것으로 나타났다. microglia 세포 모델 인간 iPSC-대식세포가 사용되어 인간 마이크로글리아의 온토게니 및 전사 프로파일을 모방하고, phagocytically유능한 14,15,16,17. iPSC-대식세포는 가장 정통 적인 microglia 모델 사용, 예를 들어, 그들은 마이크로 글리아 형태를 모방 하지 않습니다;; 그러나, 원할 경우 microglia의 보다 정통 단일문화 iPSC 모델로 대체할 수있다. 인간 iPSC 모델은 인간 대 마우스 신경퇴행성 질환 조직조직(18)에서관찰된 마이크로글리아 전사 모듈의 제한된 중첩에 대한 우려로 인해 신경 변성을 연구하기 위한 1차 설치류 마이크로글리아보다 바람직하다. 죽은 SH-SY5Ys는 중성 pH에서 약하게 형광하고 phagocytosis 후 iPSC 대식세포의 phagolysosomes 안쪽에 더 강하게 형광하는 산에 민감한 염료로 얼룩져 있습니다. 산에 민감한 염료를 사용하면 식세포 이벤트를 감지하는 정확도를 향상시키고, 라이브 및 고정 대식세포19의다양한 판독을 위한 다기능성을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 식세포증의 라이브 셀 타임랩스 이미징과 식세포증에 대한 고정 된 고함량 이미징 분석, 판독 전에 동일한 세포 준비 단계를 모두 간략하게 설명합니다(그림 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> 그림 1: 방법론의 회로도. cagocytosis 분석의 개요, 여기서 SH-SY5Ys의 준비 및 iPSC-대식세포의 염색은 병렬로 수행되고, 다음 SH-SY5Ys는 iPSC-대식세포에 배관된다. 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰은 즉시 능력을 발휘하거나, 세포는 필요한 기간 동안 37°C/5% CO2에서 배양되고 고함량 현미경 검사를 수행하기 전에 고정된다. PFA: 파라포멀데히드, HBM: 페놀 레드 프리 HEPES 버퍼링 미디어, pHr: pH-민감한 적색 형광염염수 STP 에스테르 솔루션, PRFMM: 페놀 레드 프리 대식세포 미디어. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td>352096</td> 세포 2-20 &micro<td>의 원심분리</td></tr><tr><td>용; L, 20-200 &마이크로; L, 100-1000 &마이크로; L 단일 채널 마이크로피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올 50mM</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>PBS의 공장 매체 구성 요소 4% 파라포름알데히</td>드 <td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>세포 고정용</td></tr><tr><td>6-웰 플레이트, 조직 배양 처리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AggreWell-800 24-웰 플레이트</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>배아체 형성을 위한 Microwell 저접착 24웰 플레이트</td></tr><tr><td>Annexin V-FITC Apoptosis 염색/검출 키트</td><td>Abcam</td><td>ab14085</td><td>Kit for annexin V-FITC staining, 고정 SH-SY5Ys의 품질 관리를 위한 분석법으로. 키트에는 annexin 결합 완충액, annexin V-FITC 및 propidium iodide가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>자동 세포 계수기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 마이크로원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra Microplates, 조직 배양 처리, 검은색, 96웰(뚜껑 포함)</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>검은색 웰 벽과 광학적으로 투명한 바닥이 있는 96웰 조직 배양(TC) 처리 마이크로플레이트, 식세포작용 분석용</td></tr><tr><td>CellProfiler 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>: 라이브 셀 타임 랩스 현미경으로 얻은 식세포작용 이미지 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어입니다. 웹 사이트(http://cellprofiler.org/)에서 무료로 다운로드할 수 있는 이 프로토콜은 버전 2.2.0을 사용했습니다.</td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red dye</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34565</td><td>iPS-대식세포의 세포질 염색을 위한 진한 적색 형광, 세포 투과성, 숙시니미딜 에스테르 반응성 염료. CellTracker Deep Red 염료를 DMSO에 2mM(1.4mg/mL)로 용해시킵니다. 1 &mu; M, 대식세포 배지로 DMSO 스톡을 희석하여.&nbsp;</td></tr><tr><td>클래스 2 층류 공기 흐름 안전 캐비닛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 가스 용기</td><td></td><td></td><td>EVOS FL 자동</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터용 액세서리, 37°로 설정; C 및 5 % CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columbus 이미지 데이터 저장 및 분석 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Opera Phoenix용 데이터 저장 및 분석 플랫폼. 모든 주요 고함량 스크리닝 장비를 지원합니다.</td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Cayman</td><td>11330</td><td>식세포작용 분석을 위한 음성 대조군 치료. DMSO에서 10mM로 재구성하고 -20°C에서 부분 표본을 저장합니다. C, 추가 동결-해동 주기를 피하십시오. 최종 농도 10 &M.에서 사용합니다.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>SH-SY5Y 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>CellTracker 및 pHrodo 염료용 용매</td></tr><tr><td>EVOS FL 자동 이미징 시스템</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMF4300</td><td>라이브 셀 타임랩스 이미징 현미경</td></tr><tr><td>EVOS 라이트 큐브 CY5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4656</td><td>EVOS FL 용 액세서리 자동</td></tr><tr><td>EVOS 라이트 큐브 DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4650</td><td>EVOS FL 용 액세서리 자동</td></tr><tr><td>EVOS 라이트 큐브 RFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4652</td><td>EVOS FL 용 액세서리 자동</td></tr><tr><td>EVOS 온스테이지 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMC1000</td><td>액세서리 EVOS FL 용</td>자동</tr><tr><td>태아 혈청</td><td>시그마</td><td>F4135</td><td>SH-SY5Y 매체</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 분석 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, hESC 인증, 감소 성장 인자 기저막 매트릭스</td><td>Invitrogen</td><td>A1413302</td><td>hESC 배양을 위한 hESC 인증 기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>공장 및 대식세포 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>BE 10-547F</td><td>Hank' s 세척 단계를 위한 균형 잡힌 소금 용액</td></tr><tr><td>인간 재조합 BMP4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td>배아 신체 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>인간 재조합 IL-3</td><td>Gibco</td><td>PHC0033</td><td>공장 및 대식 세포 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>인간 재조합 SCF</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>배아 신체 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>인간 재조합 VEGF</td><td>Gibco</td><td>PHC9394</td><td>배아체 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>Live Cell Imaging Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>A14291DJ</td><td>죽은 SH-SY5Ys 저단백질 결합 라벨링을 위한 페놀 무함유 HEPES 완충 배지</td></tr><tr><td>2 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30108.132</td><td>염색용 SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC9501</td><td>공장 및 대식세포 배지</td></tr><tr><td>mTeSR1 배지 구성</td> 요소 <td>STEMCELL 기술</td><td>85850</td><td>iPSC 배지</td></tr><tr><td>멀티채널 20-200 uL 피펫</td><td></td><td></td><td>96웰 플레이트</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes 시약</td>의 액체 처리용, <td>iPS-대식세포 핵 염색을 위한 스포이드 병에 담긴 Thermo Fisher R37605 Hoechst 33342 제형, 대식세포 배지에서 0.5 drops/mL 사용.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opera Phoenix High-Content 스크리닝 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14000000</td><td>Harmony 소프트웨어 버전 4.9와 함께 사용되는 High-content imaging microscope.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>공장의 구성 요소, 대식 세포 및 SH-SY5Y 배지</td></tr><tr><td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36011</td><td>죽은 SH-SY5Ys 라벨링을 위한 pH 민감성 적색 형광 염료. DMSO의 pHrodo iFL Red STP 에스테르 분말을 5mg/mL 농도로 재구성합니다. 100만 개의 SH-SY5Y마다 2.5 &mu를 추가합니다. L (12.5 &mu; g) Live Cell Imaging Solution에 현탁된 예열 세포에 대한 pHrodo iFL Red STP 에스테르 스톡.&nbsp;</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 필러</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T175 플라스크, 조직 배양 처리</td><td></td><td></td> "<td>공장"으로 알려진 iPSC-대식세포 전구체의 분화를 위한 용기</td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td></td><td></td><td>SH-SY5Y 배양용</td></tr><tr><td>용기 투명 플레이트 밀봉기</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676001</td><td>분석 플레이트 보관 및 운송용</td></tr><tr><td>TrypLE Express(1X),</td><td></td><td>재조합 트립신 유사 효소와 1.1 mM EDTA를 함유 한 페놀 레드 Gibco 12604013 세포 해리 완충액을 사용하지 않고 깔끔하게 사용합니다.</td><td></td></tr><tr><td>물 목욕, 37°C로 설정; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민, 겐타마이신 및 페놀이 적색</td><td>Lonza</td><td>BE04-418F</td><td>공장 및 대식세포 배지 구성 요소</td></tr><tr><td>X-VIVO 15 배지 L-글루타민 미포함</td><td>Lonza</td><td>04-744Q</td><td>페놀 적색 대식세포 배지, 첨가제 또는 성장 인자 없이 식세포작용에 사용</td></tr></tbody></table>

ipsc-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia는 파킨슨 병과 알츠하이머 병을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환에서 신경 면역 반응을 조율합니다. Microglia는 phagocytosis의 전문적인 양식인 efferocytosis의 과정을 통해 죽고 죽어가는 뉴런을 정리합니다. phagocytosis 기능은 microglia에 영향을 미치는 환경 또는 유전 위험 요소에 의해 중단될 수 있습니다. 이 논문은 식세포화물에 대한 pH 민감성 염료로 표지된 인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)를 사용하여 마이크로글리아의 유도된 만능 줄기 세포(iPSC) 모델에서 미세글리아 에페로세포증을 연구하기 위한 신속하고 간단한 체외 현미경 프로토콜을 제시한다. 절차는 파고 세포에 의해 "먹는 나"신호로 인식 표면 인산화를 표시 죽은 신경 모세포종 세포의 높은 수율 결과. 상기 96웰 플레이트 분석법은 라이브 셀 타임랩스 이미징에 적합하거나, 플레이트는 고함량 현미경 검사법에 의해 추가 처리 및 정량화되기 전에 성공적으로 고정될 수 있다. 고정 세포 고함량 현미경 검사는 소분자 억제제의 스크리닝을 위해 분석법을 확장하거나 유전 적 변이체 iPSC 라인의 phagocytic 기능을 평가할 수 있게 한다. 이 분석체는 iPSC-대식세포에 의한 전체 죽은 신경모세포종의 식증증을 연구하기 위해 개발되었지만, 분석체는 시냅토좀 및 골린 및 기타 식세포 유형과 같은 신경 퇴행성 질환과 관련된 다른 화물에 쉽게 적응할 수 있다.

살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰은 야생 형 iPSC-대식세포가 잘 당 20,000 세포에서 시드로 이전에 설명된 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. SH-SY5Ys의 상이한 양이 적용(10,000-30,000 단계 3.1의 세포 수에서 추정됨) 및 식세포 억제제 cytochalasin D는 일부 우물로 사전 배양(1h)을 적용하여 각 양의 SH-SY5에 대한 phagocytosis를 억제하는 대조군역할을 하였다. 화상 진찰은 SH-SY5Ys의 추가 후에 40 분 시작되고 심상은 다음 3 시간 동안 5 분 간격으로 캡처되었습니다 (데이터는 초기 40 분 지연을 포함합니다). 대표적인 타임랩스 비디오는 보충 데이터에포함되며 그림 3에 도시된 정량적 데이터를 분석한다. 우물당 10,000개의 SH-SY5Y의 양으로, 세포당 식세포 입자(spots)의 수는 시간이 지남에 따라 선형적으로 증가하고, 사이토찰라신 D에 의해 약 50%까지 억제되었다. 사이토샬라신 D에 의한 억제는 예상보다 약했으며, 조건당 단 하나의 우물만이 3개의 이미지 필드로 이미지되었기 때문에 기술적 또는 생물학적 복제가 부족하여 발생할 가능성이 큽으로써 발생했습니다. 우물당 SH-SY5Y(20,000및 30,000)의 양이 더 많은 경우, phagocytosis는 iPSC-대식세포및 SH-SY5Y의 세분화가 불량하여 보다 붐비는 시야에서 열악한 선형성을 보였습니다.
고정세포 고함량 이미징은 이전에 설명된 프로토콜을 사용하여 수행되었으며, 야생형 iPSC-대식세포는 웰당 20,000세포, SH-SY5Ys의 여러 가지 양(웰당 10,000-80,000)을, 분석 플레이트는 5시간 후에 고정및 이미지화하였다. 식세포증의 대표적인 이미지는 도 4A에제시되고, 도 4B17에도시된 분석된 데이터. SH-SY5Y의 양을 증가시켜 세포당 더 많은 수의 식세포 입자(spots)가 발생했습니다. 그러나 SH-SY5Y 수량의 두 배만 증가하면 셀당 반점 수가 1.5배 증가합니다. 이는 테스트된 양이 phagocytosis에 대한 속도 제한이 아님을 나타냅니다. 그 후 고함량 영상식세포분석은 식세포증의 여러 억제제(도4C)17을사용하여 검증하였다. 액틴 중합 억제제 는 세포질 D와 자스플라키놀라이드가 phagocytosis를 각각 91% 및 90%씩 현저히 억제하며, 식세포증 전에 1시간 전에 사전 배양하였다. 세포샬라신 D 또는 자스플라키놀라이드가 음의 대조군으로 사용될 때 분석의 견고한 Z'는 각각20으로계산된다. 리소솜 산성화 억제제 바필로마이신 A1은 phagocytosis를 31%까지 현저히 감소시켰습니다. 리소솜 산성화 억제제 대 액틴 억제제의 약한 효과는 내면화된 화물의 검출이 충고의 완전한 산성화를 필요로 하지 않을 수 있음을 시사한다. 재조합 부속서 V는 SH-SY5Ys 표면에 노출된 포스파디들세린을 구체적으로 차단하는 대조군으로 사용되어, 교피 수용체가 리간드에 접근하는 것을 방지하여 중요한 "eat-me" 신호이다. 재조합 부속서 V를 첨가하여 SH-SY5Y 첨가 직전에 우물에 첨가하면 식세포증을 30%까지 현저히 감소시다. 고정 된 SH-SY5Ys는 형광 부속서 V 프로브를 사용하여 인산화를 노출하는 것으로 확인되었으며, 반면 살아있는 SH-SY5Ys는 부속서 V 염색(도 4D)에대해 부정적이었습니다.
microglial phagocytosis 수용체 TREM2는 이전에 세포 세포 신경21의phagocytosis에 중요 한 것으로 표시 되었습니다. TREM2의 R47H 돌연변이는 알츠하이머 병의 늦은 발병을 위한 위험 유전자이며, TREM223의리간드 결합을 감소시키기 위해 가설이다. R47H TREM2 및 TREM2 KO의 식세포 기능을 평가하기 위해 고정 셀 고함량 식세포 분석은 WT/R47H/KO TREM217을사용한 동생성 iPSC-대식세포 라인을 사용하여 수행되었다. 1에서 5h까지 의 식세포 지속 시간의 몇 가지 길이는 파고 세포화물 (40,000 SH-SY5Ys)의 비틀거리는 추가를 사용하여 테스트되었습니다. 결과 신호는 선형적으로 4h로 증가하여 5h(그림 5)17에서약간 수평을 유지합니다. R47H TREM2 돌연변이체가 변한 식세포증을 나타내지 않은 반면, TREM2 KO에서 감소된 식세포증 비율 및 용량(% 현물 양성 세포)은 명백했다. TREM2 KO 세포의 식세포 결함은 TREM2 기능이 정상 식세포증을 지원하기에 충분하기 때문에 R47H TREM2 돌연변이에 의해 페노복사되지 않습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> 그림 3: 살아있는 세포 시간 경과 phagocytosis 분석에 대한 예제 데이터. 야생형 iPSC-대식세포 BIONi010-C(ECACC ID: 66540023)에 의한 죽은 SH-SY5Y의 섭취는 3시간 동안 5분 간격으로 이미지된다. 그래프에 표시되는 시간은 측정없이 처음 40 분을 포함하여 phagocytosis의 개시에서 비롯됩니다. 복제웰 3개에서 셀당 평균 반점 수가 플롯됩니다. 10,000SH-SY5Ys의 식도증은 1시간 전처리로 10μM 사이토샬라신 D로 억제되는 반면, 더 많은 양의 SH-SY5Ys(20,000 및 30,000)는 phagocytosis의 최적이 아닌 정량화를 가지고 있습니다. 표준 편차(SD), N = 1 실험을 ± 평균. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> 그림 4: 고함량 식세포 분석의 최적화 및 검증. (A)야생형 iPSC-대식세포 BIONi010-C(ECACC ID: 66540023)에 의해 SH-SY5Ys 의 대표적인 고함량 현미경 이미지. 40,000 SH-SY5Y가 있는 3h 시간 점이 표시됩니다. 형광 채널은 빨간색으로 표시된 iPSC-대식세포 얼룩과 병합되고, 핵은 파란색으로, SH-SY5Ys는 노란색으로 표시됩니다. 인셋 패널은 3배 확대된 영상의 단면이다.(B)5시간 후 식세포사멸SH-SY5Ys의 셀당 반점 수, 야생형 iPSC-대식세포에 다른 양의 화물을 첨가한다. 평균 (SEM)의 표준 오차를 ± 평균, N = 3 수확에 대한. (C)식세포증(3h)은 10μM 시토샬라신 D(Cyt), 1 μM 바필로마이신 A1(Baf), 1 μM 자스플라키놀라이드(1시간 전처리 포함)로 억제된다. Jas) 및 13 μg/mL 재조합 부속서 V(죽은 SH-SY5Ys에 동시에 추가됨; 앤). SH-SY5Y가 첨가되지 않은 iPSC-대식세포는 음의 대조군(-ve)으로 사용되었고, 양성(+ve) 제어는 SH-SY5Y를 첨가한 처리되지 않은 iPSC-대식세포이다. 실험 반복을 위한 평균으로 데이터가 정규화되었습니다. ± SEM, N = 3-6 수확 및 두 개의 야생 형 세포주 (SFC840-03-03)를 사용하면이 라인의 특성화가 설명됩니다 (페르난데스 외21 및 BIONi010-C). Dunnett의 포스트 호크 테스트와 1 방향 ANOVA, 처리되지 않은 세포에 대한 비교 * &lt; p &lt; 0.01 p.p .01. (D)인산다이들세린 디스플레이(부속품 V-FITC)를 위해 상고하게 고정된 SH-SY5Ys 얼룩(부속어 V-FITC)을 위해 균일하게 고정하고 세포 투과성(propidium 요오드)이 제한된다. 라이브 SH-SY5Ys는 배양에서 몇 가지 죽은 세포에 존재하는 초점 얼룩을 제외하고, 부속서 V-FITC 또는 프로피듐 요오드에 대한 얼룩을 하지 않습니다. 수치는 알츠하이머 연구 및 치료17의허가로 재현됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> 그림 5: Phagocytosis는 TREM2 KO에서 감소하지만 R47H TREM2 iPSC-대식세포에서는 감소하지 않습니다. 고함량 식세포 분석은 엇갈렸던 첨가물로 40,000개의 SH-SY5Y를 잘 수행했습니다. 수단은 세포당 반점 수, 셀당 현물 영역(μm2)의합, 필드당 phagocytosed 입자를 함유하는 세포의 백분율 등 파라미터에 대해 정량화되었다. 실험당 각 유전자형에 대한 의미로 데이터가 정규화되었습니다. N = 3 수확에 대한 ± SEM을 의미합니다. 반복 조치 2-way ANOVA, 던넷의 포스트 혹 후 테스트, 각 시간에 대 한 WT에 쌍으로 비교: *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001. 수치는 알츠하이머 연구 및 치료17의허가로 재현됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 S1: SH-SY5Ys 준비를 위한 예제 QC. 해리된 SH-SY5Ys는 0%(라이브 셀), 1%, 파라포름데히드(PFA)의 2%로 10분 동안 고정된 후 세척하였다. 세포는 부속서 V-FITC 및 프로피듐 요오드(PI)로 염색하고 혈류 세포측정에 의해 즉시 측정하였다. 색상 밀도 점 플롯은 단일 스테인드 및 스테인드되지 않은 컨트롤을 사용하여 사분면 게이트를 배치하여 유동 세포 측정 분석 소프트웨어에서 만들어졌습니다. 사분면은 해당 사분면 내의 이벤트 비율에 대해 추가됩니다. 살아있는 세포는 주로 4분기에 있으며 고정 셀은 주로 2분기에 있습니다. Q1 = 부속서 V/PI-, Q2 = 부속서 V+/PI+, Q3 = 부속서 V+/PI-, Q4 = 부속서 V/PI-(라이브 셀). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오: 라이브 셀 시간 경과 phagocytosis. 야생형 iPSC-대식세포 BIONi010-C(ECACC ID: 66540023)에 의해 S-SY5Ys의 대표적인 타임랩스 비디오. 이미지는 3 시간 동안 5 분마다 촬영되었습니다. 비디오가 자르고 초당 3 프레임에서 실행되어 분석의 마지막 1.5 h를 보여줍니다. 산에 민감한 염료 염색 SH-SY5Ys는 포고솜 산성화로 증가하는 빨간색, 신호 강도로 표시됩니다. Hoechst 33342로 염색된 세포 핵은 파란색으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

이 체외 이미징 분석은 microglial phagocytosis에 다른 세포 치료 또는 다른 유전자형의 효과를 정량화 할 수 있습니다. 신경퇴행성 질환과 관련된 두 가지 세포 유형을 사용하여, 우리는 식세포화물에 죽은 신경 아세포종 세포를 사용하며, 이는 큰 함량이 높은 이미징 스크린에 의해 쉽고 저렴하게 확장 될 수있는 방식으로 제조됩니다. 클래스 2 생물학적 안전 캐비닛에서, 배지를 흡입하여 SH-SY5Ys를 해리.세포 해리 버퍼 4ml를 추가하고 버퍼를 즉시 제거하여 1ml 미만이 세포를 코팅하는 박막으로 남아 있도록합니다. 섭씨 37도에서 2~3분, 이산화탄소 5%를 배양합니다. 그런 다음 10 ml의 HBSS에서 T-75 플라스크에.그리고 SH-SY5Ys를 15ml 원심분리기 튜브에 파이펫합니다. 400xG의 원심분리기는 5분 동안. 수퍼네티드를 흡인시키고, 페놀 무적HEPES 버퍼링 된 미디어의 2 ml에서 세포를 다시 일시 중단하여 고정하기 전에 덩어리를 분해하십시오.튜브에 4%의 파워 포름알데히드 2ml를 추가하고 가끔 부드러운 동요로 실온에서 10 분 동안 배양하여 세포를 수정합니다. 튜브에 10ml의 HBSS를 추가합니다. 그런 다음 1200xG에서 7 분 동안 원심 분리기.슈퍼나탄을 흡인시키고, 페놀 무적HEPES 버퍼링 된 매체의 2 ml에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 100만 개의 HS-SY5Y 세포를 2ml 저단백질 결합 튜브로 카운트 앤 제거합니다. 페놀 레드 프리 HEPES 버퍼링 미디어를 사용하여 총 볼륨을 300~500 마이크로리터로 가져옵니다.그런 다음 37도의 수조에서 튜브를 잠시 따뜻하게 합니다. pH 에민감한 적색 형광염 염료 STP 에스테르를 제조업체의 지시에 따라 재구성하십시오. 그런 다음 백만 SH-SY5Y 세포당 12.5 마이크로그램의 염료를 추가합니다.튜브를 가볍게 저어 부드럽게 섞습니다. 그리고 실내 온도에서 30 분 동안 튜브를 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 1200xG에 HBSS와 원심분리기 1ml를 7분 4도에 추가합니다.상부체를 폐기합니다. 그리고 HBSS 2 ml로 씻으시면 됩니다. 페놀 무적대식 세포매체에서 세포 펠릿을 ml당 0.2~ 120만 개의 세포농도로 재중단하여 50개의 마이크로리터가 10, 000 ~ 60, 000세포를 함유하도록 한다.생물학적 안전 캐비닛에서 대식세포 에서 심홍색 형광 세포가 구형 succinimidyl 에스테르 반응성 염료의 용액을 준비합니다. Hoechst 33342를 추가하고 수조에서 작업 용액을 섭씨 37도로 따뜻하게 합니다. 다중 채널 파이펫으로 셀 상류체를 멸균 저장소로 파이프하여 iPSC 대식세포 매체를 부드럽게 흡인시합니다.다중 채널 파이펫을 사용하여 iPSC 대식세포에 염료 용액의 웰당 70 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 배양합니다. 페놀 무적대식 세포파지 미디어에서 실험적 치료법을 수리하십시오.인큐베이션 후, iPSC 대식세포 매체를 다중 채널 파이펫으로 매우 부드럽게 흡인시키고, 우물당 100마이크로리터의 HBSS를 추가한다. 부드러운 파이펫팅으로 HBSS를 즉시 제거합니다. 그런 다음 페놀 무적대식 세포지 미디어 100 마이크로리터와 별도의 우물에 실험 적 치료를 추가합니다.섭씨 37도에서 10분에서 1시간, 이산화탄소 5%를 배양합니다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 액체 의 가장자리에 있는 각 우물의 측면에서 잘 표시된 SH-SY5Y의 50 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3~5시간 동안 배양합니다.식세포증 이큐베이션 후, 멀티 채널 파이펫으로 파이펫을 사용하여 셀 수퍼나티를 부드럽게 흡인하고 폐기하십시오. PBS 100 마이크로리터로 한 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 2%의 파워 포름알데히드의 100 마이크로리터를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양하여 세포를 수정합니다.흡인 우물과 PBS의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 높은 함량현미경으로 직접 이미징을 진행하거나 플레이트 실러와 호일로 덮어 필요한 때까지 섭씨 4도에 플레이트를 보관하십시오. 고콘텐츠 이미징 현미경을 켜고 이미지 캡처 소프트웨어를 엽니다.화면 상단의 LOAD"아이콘을 클릭하여 분석 플레이트를 현미경에 로드합니다. 설치"탭을 선택합니다. 왼쪽 상단 상자의 드롭다운 메뉴에서 적절한 플레이트 유형을 선택합니다.자동 초점 옵션 : 두 피크 "목표 : 40x 물, NA 1.1 "공초점"모드, 1의 비닝. 설정 메뉴를 통해 사용하기 전에 40x 물 목표를 플러시하십시오. 채널 선택 상자에서 플러스 아이콘을 사용하여 채널 DAPI, Alexa 647 및 Alexa 568을 추가합니다.이를 하나의 마이크로미터의 단일 평면으로 측정하도록 설정합니다. 분석 플레이트의 염색 효율을 위해 시간과 전력 설정을 최적화합니다. 채널을 분리하기 위해 채널 시퀀스를 클릭하여 채널을 동시에 측정하지 않도록 합니다.탐색 및 레이아웃 정의에서 측정 웰을 선택하고 웰당 9~12개의 필드를 선택합니다. 설정 하는 동안, 플레이트지도에 대표 필드를 클릭 합니다. 그리고 각 측정 채널을 차례로 확인하여 염색이 존재하고 채널 오프셋을 조정하여 이미지가 초점을 맞추고 있는지 확인합니다.원격 분석을 위해 서버에 데이터를 업로드하려면 온라인 작업"상자와 관련 화면 이름을 클릭합니다. 저장"버튼을 클릭하여 분석 프로토콜을 저장하고 상단에 있는 실행 실험"탭을 클릭합니다. 실험 플레이트의 이름을 지정한 다음 시작을 클릭합니다"라이브 셀 타임 생활 phagocytosis 분석결과 10, 000 SH-SY5Ys, 세포당 파고세포 입자의 수는 시간이 지남에 따라 선형적으로 증가하고 사이토샬라신 D.에 의해 약 50%에 의해 억제되었고, 잘 당 SH-SY5Y의 양이 더 많으면, phagocytosis는 iPSC의 세분화 불량으로 인해 가난한 선형성을 나타냈다. 더 붐비는 시야에서 대식세포 및 SH-SY5Y.다음 결과는 식세포증의 대표적인 이미지를 포함하는 고정세포 고함량 이미징을 수행함으로써 얻어졌다. SH-SY5Y의 양을 늘리면 셀당 더 많은 수의 식세포 입자가 발생했습니다. phagocytosis 분석 은 phagocytosis의 몇몇 억제제를 사용하여 검증되었습니다.사이토샬라신 D와 자스플라키놀라이드는 각각 91% 및 90%씩 식세포증을 현저히 억제했습니다. 그리고 Bafilomycin A1크게 감소 된 phagocytosis 때 1 시간 동안 사전 배양 할 때 phagocytosis 이전 1 시간. 재조합 부속서 5의 첨가는 SH-SY5Y 첨가 직전에 우물에 첨가할 때 교포를 30% 현저히 감소시다.고정 SH-SY5Ys 우리는 형광 부속서5 프로브를 사용하여 포스파디들세린을 노출하는 것으로 확인되었습니다. 반면 라이브 SH-SY5Ys는 부속서 5 염색에 대해 부정적이었습니다. 1~5시간 의 식세포 증식 지속 시간의 여러 길이는, 파고세포화물의 비틀거리는 첨가를 사용하여 시험되었다.이 프로토콜의 전체 길이는 식세포화물을 준비하고 iPSC 대식세포를 병렬로 염색하여 단축될 수 있다. 이 작업을 수행하려면 사전에 타이밍을 파악하고 인큐베이션을 사용하여 향후 단계에 대한 솔루션을 준비하십시오.

in-vitro-quantitative-imaging-assay-for-phagocytosis-dead

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 신경모세포종에 대한 미세아교세포 형성 분석을 수행합니다. 이 분석은 신경퇴행성 질환에서 미세아교세포 기능의 손상을 평가하는 데 도움이 됩니다.

미세아교세포작용 분석법: iPSC 대식세포를 사용하여 신경모세포종 세포에 대한 미세아교세포작용 모델을 확립하기 위한 체외 분석

이 비디오에서는 실시간 이미징 분석을 통해 in vitro에서 정제된 성상세포의 식세포 능력을 평가합니다. 이 분석은 성상세포의 식세포 능력을 향상시키거나 억제할 수 있는 화합물을 식별하기 위한 효과적인 스크리닝 플랫폼 역할을 합니다.

In vitro phagocytosis Assay: 실시간 성상세포 매개 시냅토솜 식세포작용을 연구하기 위한 라이브 이미징 기반 방법

출처: Funes, S., et. al., Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes(인간 시냅토솜을 사용한 유도 만능 줄기세포 및 체외 생세포 식세포작용 분석의 분화). J. Vis. Exp. (2022)이 비디오는 pH에 민감한 형광 염료 표지 시냅토솜을 사용하여 미세아교세포와 같은 세포의 식세포 능력을 연구하는 분석을 보여줍니다.

인간 시냅토솜을 이용한 미세아교세포 유사 세포의 생세포 식세포작용 분석

미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석​​은 설명한다.

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

선물이 phagocytic 용량의 기본 murine 골 수 유래 세포 붙일 레이블된 myelin 파편과 세포내 지질 작은 물방울 얼룩을 사용 하 여 평가 하는 방법.

생체 외에서 골 수 유래 세포에 의해 Myelin 파편 식 균 작용

이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

본 문서는 대식세포를 유치하기 위해 종양 세포로부터 조절된 배지의 능력을 평가하는 유용한 시험관내 분석방법을 나타낸다.

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

이 프로토콜은 인간이 유도한 다능성 줄기 세포로부터의 대식세포의 강력한 생성 및 이들의 후속 특성화 방법을 설명합니다. 세포 표면 마커 발현, 유전자 발현 및 기능성 세포는 이들 iPSC 유래 대식세포의 표현형 및 기능을 평가하기 위해 사용된다.

다능성 줄기 세포에서 인간 대식세포의 생산 및 특성화

이 프로토콜은 시험관 내 실험을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 미세 아교 세포와 같은 세포로의 분화 과정을 설명합니다. 또한 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 체외 식균 작용 분석의 기질로 사용할 수 있는 iPSC 유래 하부 운동 뉴런에서 인간 시냅토솜을 생성하는 자세한 절차도 포함되어 있습니다.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

배우세요 iPSC-대식세포를 이용한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증 정량 분석 방법을. 고내용 이미징을 통해 미세아교세포의 탐식 기능을 신경퇴행성 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

더 많은 동영상 탐색