Name: 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 학습하세요 정량적 형광 웨스턴 블로팅을 이용한 세포 내 PRMT 효소 활성 측정 방법을. 이 프로토콜은 아르기닌 메틸화 수준을 분석하여 생물학적 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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1. 세포 배양 및 도금
참고: 권장 미디어를 갖춘 배양 세포와 마이코플라즈마 오염을 정기적으로 테스트합니다. HEK293T, MCF7 및 C2C12 세포는 이러한 세포주들이 PRMT 어약에서 성공적으로 사용되었기 때문에 예로 선택되었다.
<ol><li>DMEM의 문화 HEK293T, MCF7 및 C2C12는 10% 태아 소 혈청(FBS), 페니실린(100 UmL-1),연쇄상 구균(100 μgmL-1)으로10cm 조직 배양(TC) 요리로 보충하였다.</li>
	<li>PRMT8 분석의 경우, 분석 개시 3일 전에 독시사이클린(2 μg/mL)을 함유한 매체에서 PRMT1 유도할 수 없는 녹다운 HEK293T 세포를 성장시한다.</li>
	<li>세포를 플레이트하려면 플레이트에서 미디어를 제거하고 폐기합니다.</li>
	<li>10mL의 PBS(Ca+2 및 Mg+2 이온 제외)를 추가하여 세포를 세척하고 용액을 폐기합니다.</li>
	<li>트립신-EDTA(0.25%)의 mL 1mL를 추가한 다음 실온(RT)에서 1분 동안 배양한 다음 용액을 폐기합니다. 세포가 둥글게 될 때까지 배양하고 접시에서 분리합니다. 필요한 경우 접시를 눌러 세포를 분리합니다. C2C12와 같은 시도하기 어려운 세포를 위해 플레이트를 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다. 참고: 세포 생존가능성을 감소시키기 때문에 장기간(>10분) 동안 트립신 용액에 세포 노출을 피하십시오.</li>
	<li>플레이트에 예동이 있는 매체 1mL을 넣고, 부드럽게 파이펫 셀을 위아래로 사용하여 세포 덩어리를 분해합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮기고 3-5mL의 미디어를 추가합니다.</li>
	<li>세포 수를 측정하려면, 10 μL의 세포셀을 Trypan 블루의 10 μL로 혼합하고 10 μL을 혈류계로 옮기거나 다른 세포 계수 방법을 사용합니다.</li>
	<li>세포를 권장하는 세포 밀도로 희석하고 500 μL/잘 24웰 TC플레이트(표 1)에넣습니다. 내인성 아세서(PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 및 PRMT9)의 경우 3.1단계로 이동합니다.</li>
</ol>2. 세포 질주
<ol><li>외인성 소사(PRMT3, PRMT6, PRMT8)의 경우 권장량의 DNA(표 2)를 가진 HEK293T 세포입니다. HEK293T 세포는 트랜스펙트가 용이하므로 제조업체의 지시에 따라 모든 경질 시약을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 화합물 처리
참고: 배양 매체의 최종 디메틸 설산화물(DMSO) 농도가 0.1%를 초과하지 마십시오. 각 웰에 동일한 DMSO 농도를 유지합니다. 선택적 PRMT 억제제(화학 프로브) 및 밀접하게 관련된 비활성 유사체는 표 3에서발견될 수 있다.
<ol><li>내인성 아약(PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 및 PRMT9)의 경우 세포에서 미디어를 제거하고 500 μL의 미디어를 화합물 또는 DMSO만으로 교체합니다(대조군). 참고: R 메틸화 수치가 80% 이상 감소하는 것을 관찰하는 데 는 보통 2일이 걸립니다.</li>
	<li>외인성 아세약(PRMT3, PRMT6, PRMT8)의 경우, 트랜스펙트 후 미디어 4h를 제거하고, 화합물 또는 DMSO만으로 500 μL의 미디어를 추가하고(대조)하고, 20-24h에 대한 배양한다.</li>
</ol>4. 세포 리자테 준비
<ol><li>우물에서 모든 미디어를 제거하고, 잔류 매체를 제거하기 위해 PBS100 μL로 세척, 그리고 용해 버퍼 60 μL (20 m Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM 에틸렌디아마네트라 아세틱 산 (EDTA), 10 mM MgCl2,0.5 % 트리톤 X-100, 12.5 U mL-1 벤조, 완성 EDA 의 용액 을 추가합니다.<ol>
<li>RT에서 1분 미만 동안 배양하여 플레이트를 흔들어 세포 에 용해 버퍼를 분배합니다. 그런 다음 20%의 3 μL을 20%의 1μL/v 나트륨 도데킬 황산염(SDS)에 넣고, 최종 1% 농도에 넣고 부드럽게 흔들어 섞는다. 리세이트를 미세 원심 분리튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오. 참고: 벤조나아제와 단백질 억제제 칵테일을 사용하기 전에 신선하게 추가하세요. 벤조나아제의 첨가는 세포 용해 점도를 감소시키는 핵산을 빠르게 가수분해합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 시료의 단백질 농도를 결정하거나 용액에서 1% SDS를 용인하는 다른 방법을 사용하십시오.<ol>
<li>용액 및 단백질 표준(0, 1, 2, 4 및 8 μg/mL)을 96웰 클리어 플레이트의 우물에 넣습니다.</li>
		<li>시약 A를 시약 B와 50:1 비율로 혼합하고 우물당 200 μL을 추가합니다. 37°C에서 20분 동안 배양하고 흡광도를 읽습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>리시스 버퍼로 단백질 농도를 조정하여 시료 전체에 걸쳐 동일합니다.</li>
	<li>4x 로딩 버퍼20μL을 셀 용해 60μL에 넣고 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 열 성수 후, 용재는 -20 °C에 저장 될 수있다.</li>
</ol>5. 웨스턴 블롯 분석
<ol><li>히스톤 단백질을 분석하기 위해 총 세포 용액의 5-20 μg와 다른 단백질을 위한 20-100 μg를 4-12% 비스 트리스 단백질 젤로 적재한다.</li>
	<li>100V에서 약 2시간 동안 또는 염료 전면이 젤의 바닥에 도달할 때까지 MOPS SDS 러닝 버퍼(50mM MOPS, 50mM Tris Base, 0.1% SDS w/v, 1mM EDTA, pH 7.7)에서 젤을 실행한다.</li>
	<li>젖은 이송을 수행하는 경우, 얼음 차가운 트리스- 글리신 전달 버퍼 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, 20 % v / v 메탄올, 0.05 % w / v SDS)로 전송 샌드위치를 조립합니다.<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 스폰지, 필터 용지, PVDF 멤브레인 및 젤을 놓습니다. 메탄올에 담그고 조립 전에 30s의 이송 버퍼에 젤을 계평화하여 PVDF 멤브레인을 활성화합니다. 참고: 사용 권장 PVDF 서부 블로팅 멤브레인은히스톤(재료의 표)과같은 저분자 단백질에 대한 자가 형광 및 적합성이 낮기 때문에 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 70 V에서 얼음에 1.5h로 전달합니다.</li>
	<li>블로킹 버퍼에서 30분 동안 멤브레인을 차단합니다(인산염 완충식염, PBS에서 우유를 5% w/v). 세척 버퍼 (PBST : PBS에서 0.1 % v / v 트위엔 -20) 및 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 (PBST에서 5 % BSA)에서 1 차 항체와 함께 배양 (PBST에서 5 % BSA) 하룻밤 4 °C(표 3). 참고: 더 긴 보관을 위해 BSA 용액을 여과 소독하고, 0.02%를 추가하여 아지드 나트륨 을 넣고 4°C로 유지하십시오.</li>
	<li>PBST로 3 x 5 분 세척 막. 그런 다음 염소 안티 래빗 (IR800) 및 당나귀 안티 마우스 (IR680) 항체를 권장 차단 버퍼(재료 표, 표 3)로배양하고 PBST로 3 x 5 분 세척하십시오.</li>
	<li>800 및 700 nm에서 형광 서쪽 블롯 이미저에서 신호를 읽으십시오. 바람직하게는 높은 감도 및 동적 범위, 높은 신호 대 잡음 비율, 이미지 포화에 도달 할 때 경고뿐만 아니라 동일한 샘플 밴드에서 두 형광 색상의 멀티 플렉싱과 단일 이미지에서 명확하게 강한 희미한 밴드를 이미징 할 수있는 계측기를 사용합니다.</li>
	<li>형광 서양 이미징에 적합한 소프트웨어를 사용하여 서양 얼룩 분석을 위한 대역 강도를 결정합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 재정적 이익이나 상충하는 이해관계가 없습니다.

여기서, PRMT 제품군의 구성원을 위한 상세한 세포 분석 프로토콜은 형광 서쪽 블로팅 방법을 사용하는 것으로 기술된다. 아르기닌 메틸화의 변화가 개별 PRMT 손실 또는 촉매 억제에 따라 쉽게 검출될 수 있고 다른 가족 구성원에 의해 보상될 수 없는 독특한 기판이 선택되었다. 일부 단백질은 다중 PRMTs(21,23)에의해 메틸화되며, 일부 PRMT가 주어진 단백질 기판24,25,26,27에서소량의 세포 마크만 기여하는 기판 특이성에 중첩을 제안하며, 예를 들어 PRMT8과 PRMT1모두 EWS의 메틸화에 기여한다. 따라서, 각 분석은 녹다운 및/또는 과발현 실험을 통해 기판 및 항체의 철저한 검증을 요구하고 잘 특징적인 선택적 억제제를 통해 추가 검증을 요구했다. PRMT 특이기는 메틸-아르기닌 마크 수준에 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 감소된 세포 생존력 및 증식의 복합 효과를 피하기 위해 PRMT 손실/억제 후 2-3일 이내에 메틸화 마크 변화를 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. PRMT1, 4, 5, 7 및 9에 대한 고유 기판을 찾을 수 있었지만; PRMT3, 6, 8의 경우 기능 접근 방식을 채택해야 했습니다. 몇몇 아르기닌 메틸 특이적 항체는 각종 세포 표적을 위해 시험되었습니다, 그러나 PRMT3 및 PRMT6 녹다운의 3 일 안에 중요한 변경을 검출할 수 없었습니다; 따라서, 바이오마커 어약은 촉매비활성 돌연변이체와 함께 ectopically 발현된 효소를 사용하여 개발되었으며, 이는 기준기질 메틸화에 대한 대조군역할을 하였다. PRMT8은 가까운 PRMT1 동형 론이며 유사한 기판 기본 설정을 공유합니다. PRMT8 선택적 바이오마커를 식별할 수 없기 때문에 PRMT1 녹다운 세포의 분석이 개발되었으며, PRMT8은 EWS와 함께 공동 발현되었다. PRMT1은 또한 H4R3 비대칭 메틸화에 대한 주요 효소이므로, PrMT3 및 PRMT6 세포 분석제의 바이오마커로서 H4R3me2a를 사용하는 주요 효소이며, 기저 H4R3me2a 수준이 낮은 세포를 촉매 활성 돌연변이뿐만 아니라 촉매 활성 돌연변이체로 선택하였다. 내인성 소제가 선호되지만, 외인성 소는 몇몇 선택적PRMT억제제7,8,9의세포 효능을 시험하는 데 매우 귀중한 것으로 판명된다. PRMT 생물학에 대한 지식이 증가함에 따라 PRMT3, PRMT6 및 PRMT8에 대한 보다 구체적인 바이오마커 단백질을 찾아서 분해를 개선할 것으로 기대합니다.
검증된 항체및 적당한 통제의 사용은 PRMT 분석 성능에 중요합니다. 여기에 권장되는 모든 항체는 녹다운 및 과발현 실험에 의해 철저히 검증되었지만, 특히 다발성 항체의 경우 배치 대 배치 차이는 여전히 성능에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 분석 신뢰성을 확인하기 위해 밀접하게 관련된 부정적인 제어와 함께 유전 방법 및 화학 프로브를 사용하는 것이 중요합니다. 또한 단백질 과발현이 필요한 PRMT 아세약의 경우, 야생형 단백질과 함께 촉매활성 돌연변이를 사용하여 기저 메틸화 수준을 결정하는 것이 중요합니다.
세포내 PRMT의 활성을 프로파일링하기 위한 정량적 분석의 이 수집은 기본적인 세포 배양 및 형광 서부 블로팅 기술만을 포함하는 최소한의 장비및 제한된 기술 적 전문 지식으로 신속하고 쉽게 구현될 수 있기 때문에 과학 계에 광범위하게 유용할 수 있습니다. PRMT에 대한 권장 항체 및 화학 프로브는 또한 주어진 ABPP 프로브의 적합성을 확립하고, 표적 참여를 모니터링하고, 경쟁ABPP 형식을 사용하여 오프 타겟 효과를 평가하기 위해 활성 기반 단백질 프로파일링(ABPP) 분석을 위해 사용될 수 있다. 여기에서 논의된 분석 발달 접근은 또한 단백질 lysine-메틸 전달효소 및 아세틸 전달효소와 같은 그밖 효소 가족을 위해 추정될 수 있습니다.

아르기닌 메틸화는 단백질-단백질 및 단백질-RNA 상호 작용을 조절하는 중요한 번역 후 변형으로, 따라서 사전 mRNA 접합, DNA 손상, 전사 반응 및 성장 인자 매개 변환1,2와같은 다양한 세포 공정에서 중요한 역할을 한다. 아르기닌은 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라아제(PRMT)에 의해 메틸화되어 모노메틸 아르기닌(Rme1), 비대칭 디메틸라르기닌(Rme2a), 또는 대칭 디메틸라르기닌(Rme2s)3을생성한다. 메틸화 유형에 기초하여, PRMT는 단일 및 비대칭 디메틸화를 촉매하는 유형 I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 및 8)의 세 그룹으로 분류됩니다. 모노 및 대칭 디메틸화를 촉매하는 유형 II (PRMT5 및 PRMT9); 및 유형 III (PRMT7), 이는 단지 단종 아르기닌3을할 수 있습니다.
시판되는 아르기닌 메틸화 특이적 항체의 수가 증가함에 따라, PRMT 활성은 서양 블로팅을 사용하여 측정될 수 있다. 형광계 웨스턴 블롯은 더 큰 동적 범위와 선형성, 높은 감도, 멀티플렉스4를허용하기 때문에 화학 발광 검출보다 바람직한 기술이다. 단백질 메틸화 수준을 정량화하려면 메틸화 신호의 정상화가 총 단백질 수준으로 정량화됩니다. 상이한 숙주 종(예를 들어, 마우스 및 토끼)에서 제기된 총 및 메틸화 단백질에 대한 항체를 선택함으로써, 상이한 형광으로 표지된 이차 항체를 사용할 수 있고 두 항체모두에 대한 신호가 동일한 샘플 대역에서 결정될 수 있다. 메틸-아르기닌 항체는 메틸 아르기닌이 특정 맥락에서 발견되는 단백, 비대칭 또는 대칭적으로 희석된 단백질을 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. PRMTs메틸레이트 글리신 및 아르기닌이 풍부한 모티프의 대다수가 기판5내에서 발생했기 때문에, 다름또는 비대칭, 대칭 디메틸-아르기닌 글리신 반복을 포함하는 펩티드에 대해 각각 D5A12, ASYM24 또는 ASYM25, 및 SYM111, SYM11, SYM11, SYM11 등이 들어 있었다. 다른 메틸-아르기닌 항체는 이러한 특정 문맥에서 메틸-아르기닌의 검출을 용이하게 하는 반복적인 맥락에서 비대칭, 대칭 디메틸 및 단메틸 아르기닌을 포함하는 펩티드 라이브러리에 대해 생성되었다6. 또한 히스톤 H4R3me2a 또는 BAF155-R1064me2a와 같은 메틸화의 선택적 검출을 가능하게 하는 단일 단백질에 특정 아르기닌 마크를 인식하는 항체의 수가 증가하고 있다.
PRMT 세포 소의를 위한 공구로 이용될 수 있는 몇몇 상업적으로 유효한 PRMT 억제제가 있습니다. 그러나, 그들 모두는 철저하게 선택성과 오프 대상 효과에 대한 특성화하고 일부는주의해서 사용해야합니다. 구조 게놈 컨소시엄은 학술 실험실 및 제약 파트너와 협력하여 과학 계의 제한없이 사용할 수있는 강력하고 선택적이며 세포 투과성 PRMT 억제제 (화학 프로브)를 개발했습니다. 이러한 억제제에 대한 정보는 https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics 및 https://www.chemicalprobes.org/ 찾을 수 있습니다. 화학 프로브는 체외 IC50 또는 Kd < 100 nM을 가진 소분자 억제제, 동일한 패밀리의 단백질보다 30배 이상 선택성, 그리고 1 μM에서 의한 세포 활성을 추가로, 각 화학 프로브는 의도된 표적7,8,9,10,11,12에대해 비활성인 근접 화학아날로그를갖는다.
이 프로토콜의 목표는 형광 서부 블롯 방법을 사용하여 개별 PRMT 가족 구성원의 세포 활성을 측정하는 것입니다. 여기에서 검증된 분석 바이오마커, 항체 및 강력한 세포 활성 억제제에 대한 자세한 정보와 성공적인 분석 구현을 위한 귀중한 전략이 제공된다.

<table><tbody><tr><td>10cm TC 접시</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC 플레이트</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 12% Bis-Tris 단백질 겔</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond P PVDF 멤브레인</td><td>Millipore-Sigma</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>anti-Asym 24</td><td>Millipore-Sigma</td><td>07-414</td><td></td></tr><tr><td>anti-Asym 25</td><td>Millipore-Sigma</td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>anti-B-actin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>안티 BAF155</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-32763</td><td></td></tr><tr><td>안티 BAF155-R1064me2a</td><td>밀리포어 시그마</td><td>ABE1339</td><td></td></tr><tr><td>안티 플래그 (#, 1:5000)</td><td>밀리포어 시그마</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>안티 GFP</td><td>클론텍</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>안티 H3</td><td>Abcam</td><td>ab10799</td><td></td></tr><tr><td>안티 H3R2me2a</td><td>밀리포어 시그마</td><td>04-848</td><td></td></tr><tr><td>안티-H3R8me2a</td><td>록랜드</td><td>600-401-I67</td><td></td></tr><tr><td>안티-H4</td><td>Abcam</td><td>ab174628</td><td></td></tr><tr><td>안티-H4R3me2a</td><td>액티브 모티프</td><td>39705</td><td></td></tr><tr><td>안티-Hsp/Hsc70</td><td>엔조</td><td>ADI-SPA-820</td><td></td></tr><tr><td>안티-PRMT1</td><td>밀리포어-시그마</td><td>07-404</td><td></td></tr><tr><td>안티-PRMT3</td><td>Abcam</td><td>ab191562</td><td></td></tr><tr><td>anti-PRMT4</td>, <td>Bethyl</td><td>#A300-421A</td><td></td></tr>, <tr><td>anti-PRMT5</td>, <td>Abcam</td><td>ab109451</td><td></td></tr>, <tr><td>anti-PRMT6</td>, <td>Abcam</td><td>ab47244</td><td></td></tr>, <tr><td>anti-PRMT7</td>, <td>Abcam</td><td>, ab179822</td><td></td></tr>, <tr><td>anti-Rme1</td><td>CST</td><td>, 8015</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rme2a,</td><td>CST,</td><td>13522</td><td></td></tr>, <tr><td>anti-Rme2s,</td><td>CST</td><td>13222</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)</td><td></td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)</td><td>Abcam</td><td>ab56800</td><td></td></tr><tr><td>anti-SAP145-R508me2s</td><td></td><td></td><td>City of Hope Beckman Research Institute of City of</td></tr><tr><td>Hope anti-SmBB'</td><td>산타 크루즈 생명 과학</td><td>sc-130670</td><td></td></tr><tr><td>벤조 나제</td><td></td><td></td><td>생산 사내</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore - 시그마</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td></td><td></td><td>선물 박사 스테판 리처드, 맥길 대학</td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA 무료 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Millipore - 시그마</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioshop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG-IR680</td><td>Licor</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>80150</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Bioshop</td><td>GLN002.5</td><td></td></tr><tr><td>염소-안티-토끼 IgG-IR800</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>York University</td></tr><tr><td>Image Studio 소프트웨어 ver 5.2</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>로딩 버퍼: NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (4x)</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td></td><td>ATCC&reg; HTB-22&무역;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 차단 버퍼 (PBST로 4배 희석)</td><td>Licor</td><td>927-40000</td><td>Intercept (PBS) 차단 버퍼도 사용할 수 있습니다 # 927-70001</td></tr><tr><td>Odyssey CLX 이미징 시스템</td><td>Licor</td><td>모델 번호 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS (조직 배양)</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>PBS (웨스턴 블롯)</td><td>Bioshop</td><td>PBS405.4</td><td></td></tr><tr><td>penstrep</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>피어스&트레이드; BCA 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher Scientiffic</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1</td><td></td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td></td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수기</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (0.25%)</td><td>Wisent</td><td>325-043-EL</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bioshop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tritton X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td>트리빵 블루</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr></tbody></table>

세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법

Quantitative Methods to Study Protein Arginine Methyltransferase 1-9 Activity in Cells

단백질 메틸 전달기(PRMTs)는 기질 단백질의 아르기닌 잔류물으로 메틸 군의 전달을 촉매한다. PRMT 제품군은 아르기닌 잔류물을 단백또는 대칭/비대칭으로 만들 수 있는 9명의 구성원으로 구성됩니다. 다양 한 단백질의 아르기닌 메 틸화의 다른 종류를 인식 하는 여러 항 체사용할 수 있습니다.; 따라서, PRMT 활성 바이오마커 의 개발을 위한 도구를 제공한다. PRMT 항체 기반 의 약은 겹치는 기판 및 모티프 기반 항체 특이성 때문에 도전적입니다. 이러한 문제와 개별 PRMT에 의해 기여 아르기닌 메틸화를 조사 하는 실험 설정 논의. 9개의 PRMT중 8개에 대한 바이오마커인 대표적인 기판의 신중한 선택을 통해 PRMT 활동 저술 패널이 설계되었다. 여기서, 세포 분석에 대한 프로토콜은 세포에서 PRMT 가족의 개별 구성원의 효소 활성을 정량적으로 측정하는 것으로 보고된다. 설명된 방법의 장점은 세포 배양 및 형광 웨스턴 블롯 기능을 가진 실험실에서 그들의 간단한 성과입니다. 기판 특이성 및 선택된 항체 신뢰성은 녹다운 및 과발현 접근법으로 완전히 검증되었다. 분석 바이오마커 및 항체의 상세한 지침 외에도 PRMT를 위한 억제제 도구 화합물 수집의 사용에 대한 정보도 제공됩니다.

이러한 프로토콜은 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라아제(PRMT) 제품군의 개별 구성원의 효소 활성을 평가하는 데 사용되는 방법론을 제공한다. 내인성 및 외인성 바이오마커, 메틸-아르기닌 인식 항체 및 억제제 툴 화합물을 이용한 PRMT 활성 평가에 대한 상세한 지침이 설명되어 있다.

Protein methyltransferases (PRMTs) catalyze the transfer of a methyl group to arginine residues of substrate proteins. The PRMT family consists of nine ...

이 절차의 목표는 세포에 있는 단백질 아르기닌 메틸 전달효소 가족의 개별 적인 일원의 효소 활동을 측정하는 것입니다. 활성은 양적 형광 서부 블로팅을 사용하여 그들의 아르기닌 메틸화 수준 및 바이오 마커 단백질의 총 수준을 결정해서 측정됩니다. 설명된 방법의 장점은 세포 배양 및 형광 서양 블롯 기능을 가진 모든 실험실에서 간단한 성능이다.바이오 마커에 관한 상세한 지침, 항체 및 억제제 2개의 화합물은 이 기사에서 제공됩니다. 그리고 여기에서 우리는 실험 절차와 관련된 중요한 단계를 설명했습니다. 그리고 절차는 24 잘 형식에 표시됩니다.먼저, 용해 완충제준비, 벤조나제 와 단백질 억제제 칵테일을 사용하기 전에 신선하게 넣으세요. 우물에서 모든 미디어를 제거합니다. 100 마이크로리터 PBS로 세척하고 60 마이크로리터의 리시 버퍼를 웰에 추가합니다.실온에서 1분 동안 배양하여 플레이트를 흔들어 셀 위에 용해 버퍼를 분배합니다. 그런 다음 20% SDS의 마이크로리터 3개를 추가하여 1%의 농도를 찾고 부드러운 흔들림으로 섞습니다. 리세이트를 에펜도르프 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 시료의 단백질 농도를 결정하거나 용액에서 1% SDS를 용인하는 다른 방법을 사용하십시오. 용해 버퍼로 단백질 농도를 조정한 후 4회 적재 버퍼의 20 마이크로리터에서 60 마이크로리터의 세포 용액으로, 5분 동안 95도에서 가열한다. 용해 완충에 벤조나아제를 첨가하여 세포 용해 점도를 감소시키는 핵산을 빠르게 가수분해합니다.벤조나아제와 리자테는 점성이 없습니다. 벤조나아제없이 lysates는 스펀 할 때 펠릿하지 않습니다 끈적 끈적한 DNA의 큰 덩어리가있다. 히스톤 단백질을 위해 5~20마이크로그램의 총 세포 용액, 그라데이션 4-12 bis-tris 단백질 젤의 다른 단백질에 대해 20~100 마이크로그램을 적재합니다.100볼트에서 약 2시간 동안 주변 버퍼로, 또는 파란색 로딩 염료가 젤 의 바닥에 도달할 때까지 젤리 주위는 주변 버퍼로 움직입니다. 젖은 이송을 수행하는 경우, 얼음 차가운 트리스 글리신 전달 버퍼에 전송 샌드위치를 조립합니다. 메탄올에 담그고 30초 전에 전달 버퍼에 젤을 계면하여 PVDF 멤브레인을 활성화합니다.제조업체의 지침에 따라 스폰지 필터 용지, PVDF 멤브레인 및 젤을 놓습니다. 얼음에 1 시간 반 동안 70 볼트에서 트리글리신 전달 버퍼에서 단백질을 전송합니다. 전송 후 멤브레인을 블로킹 버퍼에서 30분 동안 배양합니다.세척 버퍼로 헹구고, 4도에서 하룻밤 동안 1 차 적인 항체로 배양하십시오. 다음날, 세척 버퍼로 5 분 동안 세 번 세척 막, 실온에서 30 분 동안 형광으로 표시된 이차 항체로 배양하고 세척 버퍼로 5 분 동안 세 번 씻습니다. 형광 서양 블롯 이미더의 유리 판에 멤브레인을 내려 놓습니다.고무 시트로 덮고 기포를 제거하십시오. 700 및 800 나노미터에서 신호를 읽으십시오. 스캔이 완료되면 이미지로 이동하여 700 및 800 채널 신호를 조정하여 밴드를 명확하게 확인합니다.여기서 빨간색으로 표시된 700 채널 신호는 총 단백질 수준을 나타내고, 녹색으로 표시된 800 채널 신호는 메틸화된 단백질의 수준을 나타낸다. 다음으로 분석으로 이동하여 중앙값 상단 및 하단 판독값을 선택합니다. 대역 강도를 측정하려면 직사각형 도구를 그리고 정량화하려는 대역 주위에 모양을 그립니다.700 채널과 800 채널의 강도를 찾을 수있는 모양으로 이동합니다. 신호라는 컬럼은 배경 이하가 있는 강도 수준을 제공합니다. 결과는 Excel 파일에 직접 복사할 수 있습니다.다음은 PRMT 타입 1 억제제 MS023을 가진 억제시 세포에서 PRMT1 활성의 분석을 보여주는 예입니다. PRMT1 활성은 히스톤 H4 아르기닌 3 비대칭 디메틸화 수준을 결정하여 측정된다. 여기, 메 틸 화 수준, 녹색 밴드 복용량 종속 방식으로 내려 가서, 총 히스톤 수준 레드 밴드는 변경되지 않은 유지 하는 동안.화합물 IC50을 결정하기 위해, 히스톤 H4 아르기닌-3 비대칭 디메틸화 레벨에 대한 억제제 농도의 로가릿심을 총 히스톤 수준으로 정규화한 다음 비선형 맞춤 분석을 한다. 설명된 방법은 세포에서 단백질 메틸 전달의 활동의 책임 있고 재현 가능한 이중 검출을 허용합니다. 이 방법의 장점은 학술 실험실에 접근 할 수 있고 실험실 장비에 따라 쉽게 수정 할 수있는 잘 알려진 서양 블로팅 방법론을 활용한다는 것입니다.각 개별 PRMT 가족 구성원에 대한 바이오 마커 단백질, 항체 및 화학 적 2개의 화합물을 포함하는 분석 세부 사항은 이 문서에서 제공된다.

quantitative-methods-to-study-protein-arginine-methyltransferase-1-9

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단백질 아르기닌 메틸화, 즉 효소의 클래스에 의해 촉매. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs)는 단백질 내의 아르기닌에 메틸기 (들)의 첨가의 효소 과정이다. 체외 메틸화 분석은 공지 또는 신규 PRMT 기판의 메틸화 상태를 평가하기위한 가장 신뢰할 도구이다.

체외 메틸화 분석에서 단백질 아르기닌 메틸화를 공부합니다

현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

본 보고서는 리슈마니아 세포 추출물을 사용하여 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소 활성을 측정하기 위한 체외 효소 분석을 설명합니다. 이 분석은 방사성 메틸기가 S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine에서 내인성 포스파티딜에탄올아민으로 전달되는 것을 기반으로 합니다.

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

여기, 우리가 특정 단백질 acetylation 또는 succinylation 인 (산출할) 생 수정 수정 후 도입의 비율 분석을 통해 전체 프로테옴의의 편견된 정량화 제시 양적 화학 acylation 안정 동위 원소 표시 된 anhydrides를 사용 하 여입니다. 함께 중요 한 독립적인 데이터 수집 질량 분석, 정확한 사이트 인 측정 얻을 수 있습니다.

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 향상시켰습니다. 상호 작용은 두 개의 곡선으로 플롯 될 수있다: proteolytic 곡선과 용량 의존 곡선. 우리는 모범사례로 mTOR-rapamycin 상호 작용을 사용했습니다.

라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 메틸트랜스퍼라제 활성의 직접 분석을 위한 항체-무체질 시험관내 분석이 기재되어 있다.

RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

본 프로토콜은 1H-NMR 분광법에 의한 유리 및 단백질 결합 아르기닌 및 메틸 아르기닌의 제조 및 정량 측정을 설명합니다.

핵자기공명분광법에 의한 아르기닌 메틸롬 탐구

특정 억제제를 스크리닝하기 위한 빠르고 정확한 화학 분석은 약물 개발 무기고에서 중요한 도구입니다. 여기에서는 HAT1 아세틸화 활성의 억제를 측정하기 위한 확장 가능한 아세틸 클릭 화학 분석을 제시합니다.

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

학습하세요 정량적 형광 웨스턴 블로팅을 이용한 세포 내 PRMT 효소 활성 측정 방법을. 이 프로토콜은 아르기닌 메틸화 수준을 분석하여 생물학적 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법

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