Name: 온난 허혈/재관류 손상의 쥐 폐 이식 모델: 결과 개선을 위한 최적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 학습하세요 쥐 폐 이식 수술의 표준화된 커핑 기법과 해부학적 랜드마크 식별 방법. 체중 기반 커프 선택과 재현 가능한 수술 절차를 통해 허혈-재관류 손상 및 분자 메커니즘 연구의 신뢰성을 높입니다.

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수컷 Sprague-Dawley 쥐(체중 180-270g)를 상업적으로(예: Envigo) 구입하여 오하이오 주립 대학 동물 시설에서 병원체가 없는 조건에서 사육했습니다. 모든 절차는 NIH 및 National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals에 따라 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 프로토콜 # 2012A00000135-R2)의 승인을 받아 인도적으로 수행되었습니다.
1. 초기 설정
<ol><li>수술 장치를 설정합니다. 참고: 이것은 비생존 수술입니다. 생존 수술을 수행하려면 멸균 기구와 장벽 예방 조치를 취해야 합니다.<ol><li>심박수/산소 포화도 모니터링 장비와 보온 보드를 42°C로 켭니다.</li>
		<li>환기 및 마취 기계를 켜서 이소플루란 증발기를 예열합니다. 참고: 일회 호흡량(Td) 7.2mL/kg, 호기말 양압(PEEP) 2cmH2O, 호흡수 80bpm을 사용하십시오.</li>
		<li>마취 주사기에 액체 이소플루란 10mL를 채우고 주사기를 환기 및 마취 기계에 장착합니다.</li>
		<li>미세외과 의사의 선호도에 맞게 높이와 초점을 조정한 상태에서 수술용 현미경을 켭니다.</li>
		<li>전기 소작 장치를 켭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수술 도구를 준비하고 배치합니다(그림 1). 참고: 모든 수술 도구는 121°C에서 30분 동안 고압증기멸균되었습니다.</li>
	<li>기증자와 수혜자 쥐의 체중을 수집하고 기록합니다.</li>
	<li>표 1과 쥐의 체중을 사용하여 커프를 만드는 데 사용할 혈관 카테터(20, 18, 16, 14 또는 12G)의 정확한 게이지를 결정합니다.</li>
	<li>체중에 따른 크기 가이드를 사용하여 폐동맥(PA), 기관지(Br) 및 폐정맥(PV)에 대한 커프를 준비합니다(표 1 및 그림 2).<ol><li>20G, 18G, 16G, 14G 또는 12G 크기의 혈관 카테터(그림 2A-E)를 수술 현미경으로 멸균 표면에 놓습니다.</li>
		<li>그런 다음 늑골 등 수술 블레이드 #11(그림 2F)을 사용하여 혈관 카테터를 90° 각도로 절단하여 커프 본체 상단에 1mm X 1mm 탭(너비 x 높이)이 있는 2mm 길이의 커프 본체를 형성합니다(그림 2G).</li>
		<li>사용할 준비가 될 때까지 커프를 멸균 식염수에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>솔루션을 준비합니다.<ol><li>케타민 10mL(100mg/mL)에 자일라진(1mL) 1mL를 첨가하여 멸균 주사 바이알에 케타민과 자일라진의 혼합물을 준비합니다. 알림: 이 칵테일의 만료 날짜는 사용된 구성 요소의 가장 빠른 만료 날짜를 사용하여 결정됩니다.</li>
		<li>쥐에게 적절한 용량을 주사기에 넣습니다(쥐의 체중 100g당 케타민/자일라진 혼합물 0.1mL, 예: 쥐 200g의 경우 케타민/자일라진 혼합물 0.2mL가 전달됨). 참고: 이 용량은 91mg/kg의 케타민과 9.1mg/kg의 자일라진을 쥐에게 전달하며 쥐를 60-80분 동안 진정시켜야 합니다.</li>
		<li>1,000 U/kg의 용량으로 전달될 헤파린을 준비합니다.</li>
		<li>식염수, PBS 및 보존 용액을 얼음 위에 보관한다(Table of Materials).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 기증자 쥐 준비
<ol><li>케타민과 자일라진 혼합물을 복강 주사하고 발가락 핀치에 대한 반응 부족으로 평가할 수 있는 마취 수술면이 발달할 때까지 ~10분 동안 기증자 쥐의 마취를 유도합니다.</li>
	<li>전자 클리퍼를 사용하여 절개 부위를 면도하십시오.</li>
	<li>기증자 쥐를 수술 용 온난화 보드에 앙와위 자세로 놓고 베타 딘을 적신 멸균 거즈로 절개 부위를 닦습니다. 그런 다음 70% 이소프로필 알코올 면봉으로 해당 부위를 닦습니다. 3 번 반복하십시오.</li>
	<li>가위를 사용하여 목 중앙에 3-4cm의 정중선 피부 절개를 하고 집게(출혈을 피하기 위해 가위 대신)를 사용하여 피하 조직과 근육을 조심스럽게 절개합니다.</li>
	<li>기관내 삽관의 경우 기관 주위에 4-0 실크 봉합사를 끼우고 16G 혈관 카테터를 기관에 삽입합니다. 이중 매듭으로 기관 주위의 봉합사를 단단히 묶은 다음 단일 매듭으로 마무리하여 혈관 카테터를 제자리에 고정합니다.</li>
	<li>혈관 카테터를 인공 호흡기에 연결하고 1-2 %의 이소 플루 란으로 쥐의 마취 수술면을 유지하십시오.</li>
	<li>가위를 사용하여 복강근 절개술과 횡단 절개를 결합한 복강경 절개술을 시행합니다.</li>
	<li>하대정맥(IVC)을 통해 인슐린 주사기로 헤파린(1,000U/kg)을 주사하고 전신 순환을 위해 10분 동안 기다립니다. 참고: 이 헤파린 투여는 기증자 폐의 혈전을 예방합니다.</li>
	<li>흉궁을 따라 절단하여 횡격막을 조심스럽게 해부한 다음 흉골을 따라 목까지 흉강을 노출시킵니다.</li>
</ol>3. 기증자 폐 온열 허혈 및 조달
<ol><li>IVC를 절단하여 기증자 쥐를 안락사시킵니다.</li>
	<li>폐가 여전히 환기되는 동안, 튜브에 연결된 중력에 의해 28 cmH2O에 매달린 주사기에 20 mL의 보존 용액과 함께 미세 해부 스프링 가위로 오른쪽 및 왼쪽 귓바퀴를 절단하고 폐동맥을 통해 직접 도입되는 18 G 혈관 카테터.</li>
	<li>기관내관에서 인공호흡기를 분리하고 체중에 따라 적절한 양의 공기로 채워진 5mL 주사기에 연결합니다. 참고: 폐를 팽창시키는 공기의 양은 일회 호흡량의 두 배(Td = 7.2mL/kg)로 계산할 수 있습니다(예: 200g 쥐의 Td는 1.44mL이고 여기에 2를 곱하면 폐를 팽창시키는 데 필요한 공기 2.88mL가 됩니다.</li>
	<li>기증자의 폐를 팽창시킵니다.</li>
	<li>폐를 팽창시키기 위해 기관에 Yasargil 클램프를 넣고 멸균 된면 거즈로 폐와 심장을 덮으십시오. 식염수로 거즈에 수분을 공급하고 기증자 쥐를 언더 패드로 감싼 다음 온열 수술 보드에 1시간 동안 그대로 두어 폐에 따뜻한 허혈을 유도합니다(그림 3).</li>
	<li>따뜻한 허혈 1시간 후, 미세 해부 스프링 가위와 집게로 심폐 블록을 절제하고 얼음 위의 멸균 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS로 적신 멸균 거즈에 놓습니다. 알림: 다음 단계는 모두 폐가 얼음 위의 페트리 접시에 있는 동안 이루어져야 합니다.</li>
	<li>미세 해부 스프링 가위로 폐 인대를 조심스럽게 절개하여 왼쪽 폐를 식도와 기근 후 엽에서 분리합니다.</li>
	<li>Vannas-Tubingen 스프링 가위로 왼쪽 폐 폐문 부위를 조심스럽게 다듬고 왼쪽 PV, PA 및 Br을 조달합니다.</li>
	<li>PV, PA 또는 Br에 커프를 놓습니다(그림 4A-C).<ol><li>모기 지혈제를 사용하여 커프 탭을 잡습니다.</li>
		<li>가는 집게를 사용하여 적절한 커프 본체를 통해 PV, PA 또는 Br의 말단부를 잡고 커프 주변의 여분의 조직을 뒤집고 8-0을 사용하여 고정합니다. 나일론 봉합사. Vannas-Tubingen 스프링 가위를 사용하여 여분의 조직과 커프 본체 주변의 커프를 다듬습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>기증자 폐를 거즈로 덮고 식염수로 적셔 수혜자 쥐에게 이식할 준비가 될 때까지 얼음 위의 페트리 접시에 올려 둡니다(그림 4D). 참고: 평균 한랭 허혈 시간은 서경 84분± 11분입니다.</li>
</ol>4. 수혜자 쥐 준비
<ol><li>케타민과 자일라진 혼합물(100 g rat 당 0.1 mL)을 복강 주사하고 발가락 핀치에 대한 반응 부족으로 평가할 수 있는 마취 수술면이 발달할 때까지 10분 동안 기다림으로써 기증자 쥐와 동일한 방법으로 수용자 쥐에게 마취를 유도한다.</li>
	<li>전자 가위를 사용하여 절개 부위를 면도합니다.</li>
	<li>기증자 쥐를 앙와위 자세로 놓고 베타 딘을 적신 멸균 거즈로 절개 부위를 닦아냅니다. 그런 다음 70% 이소프로필 알코올 면봉으로 해당 부위를 닦습니다. 3 번 반복하십시오.</li>
	<li>쥐가 환기 기계에 고정되기 전에 4번째 늑간 공간을 찾을 준비를하기 위해 쥐의 가슴에 선을 그립니다.<ol><li>흉골 상 노치에서 xiphoid 과정까지 가슴을 측정하고 선을 그립니다 (그림 5A).</li>
		<li>이 선의 중간에 흉골 상 노치에서 xiphoid 과정까지 측정의 절반을 측정하는 가슴의 왼쪽을 따라 선을 그립니다 (그림 5A 및 B).</li>
	</ol></li>
	<li>기관내 삽관 키트의 LED 조명에 연결된 광섬유 케이블을 사용하여 시각화를 통해 16G 혈관 카테터를 사용하여 수혜자를 삽관합니다.</li>
	<li>혈관 카테터를 인공 호흡기에 연결하고 1-2 % 이소 플루 란으로 마취 수술면을 유지하십시오.</li>
	<li>4번째 늑간 공간을 찾으려면 강한 만져지는 심장 충동이 느껴질 수있는 흉벽 영역을 찾으십시오 (그림 5C, 빨간색 원).</li>
	<li>이 위치에서 가위로 피부를 절개하고 미세 해부 스프링 가위로 근육을 절개하고 견인기를 사용하여 4번째 늑간 공간을 최대한 넓게 엽니 다. 알림: 근육 절개 중 출혈을 피하거나 멈추기 위해 전기 소작을 사용하십시오.</li>
	<li>늑간 공간이 활짝 열리면 Vannas-Tubingen 스프링 가위를 사용하여 수혜자의 왼쪽 폐 주위의 인대를 조심스럽게 해부하고 멸균 면봉과 집게를 사용하여 폐를 가슴 부위에서 빼냅니다.</li>
	<li>멸균 거즈를 왼쪽 폐 주위에 놓고 Dieffenbach 불독 클램프로 잡습니다.</li>
	<li>Yasargil cl을 적용amp 가능한 한 근위부로 왼쪽 폐 폐문 부위에.</li>
</ol>5. 문합
<ol><li>폐정맥(PV) 문합<ol><li>수혜자의 PV 주위에 7-0 나일론 봉합사를 놓습니다.</li>
		<li>Vannas-Tubingen 스프링 가위를 사용하여 상부 및 하부 분절 정맥을 가능한 한 원위부로 절단하여 수혜자의 PV를 절개하고 인슐린 주사기를 사용하여 0.2mL의 헤파린 처리 식염수(1U/mL)로 혈액을 씻어냅니다.</li>
		<li>얼음처럼 차갑고 젖은 멸균 거즈로 감싼 기증자 폐를 흉강에 넣습니다.</li>
		<li>기증자의 커프가 달린 PV를 수혜자의 PV에 삽입한 다음 미리 배치된 7-0 나일론 봉합사로 고정합니다(그림 6).</li>
	</ol></li>
	<li>기관지 (Br) 문합<ol><li>수혜자의 Br 주위에 7-0 나일론 봉합사를 놓습니다.</li>
		<li>Vannas-Tubingen 스프링 가위로 상부 및 하부 분절 기도를 가능한 한 원위까지 가로로 절단하여 수혜자의 Br을 절개합니다.</li>
		<li>기증자의 커프가 채워진 Br을 수혜자의 Br에 삽입하고 미리 배치된 7-0 나일론 봉합사로 고정합니다(그림 6).</li>
	</ol></li>
	<li>폐동맥(PA) 문합:<ol><li>수혜자의 PA 주위에 7-0 나일론 봉합사를 놓습니다.</li>
		<li>외래 덮개에서 수혜자의 PA를 절개하고 Vannas-Tubingen 스프링 가위로 혈관 둘레의 절반을 절개한 다음 인슐린 주사기를 사용하여 0.2mL 헤파린 처리 식염수(1U/mL)로 PA의 혈액을 씻어냅니다.</li>
		<li>기증자의 커프가 채워진 PA를 수혜자의 PA에 삽입하고 미리 배치된 7-0 나일론 봉합사로 고정합니다(그림 6).</li>
	</ol></li>
</ol>6. 재관류
<ol><li>이식된 기증자 폐의 재관류 및 환기를 허용하기 위해 문에 있는 Yasargil 클램프를 제거합니다(그림 7).</li>
	<li>미세 해부 스프링 가위와 집게를 사용하여 수혜자의 원래 왼쪽 폐를 해부합니다.</li>
	<li>이식 된 왼쪽 폐를 수혜자의 흉부에 조심스럽게 재배치하십시오.</li>
	<li>6-0 나일론 봉합사를 사용하여 개흉술 절개를 닫습니다.<ol><li>4번째 갈비뼈보다 우수하고 5번째 갈비뼈보다 열등한 갈비뼈 주위에 간단한 이중 매듭이 있는 3개의 6-0 나일론 봉합사를 놓습니다(그림 8A).</li>
		<li>지혈기를 사용하여 세 개의 봉합사를 함께 모으십시오(그림 8B).</li>
		<li>환기 설정에서 PEEP를 6cmH2O로 높입니다.</li>
		<li>상처를 봉합하기 위해 당겨서 세 개의 매듭을 동시에 묶습니다(그림 8C).</li>
		<li>PEEP를 즉시 2cmH2O로 낮추십시오.</li>
		<li>6-0 나일론 봉합사로 피부를 닫습니다. 참고: 우리 실험실은 이식 후 급성기를 연구하므로 이 모델의 수용자 쥐는 이식 후 3시간 동안 환기 및 마취 상태에서 생존한 다음 샘플을 수집합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>7. 실험검체(혈장, 폐조직) 채취
<ol><li>대조군 샘플의 경우 3시간 재관류 기간이 시작된 후 기증자의 우엽을 수집합니다.<ol><li>단백질 또는 RNA 발현 분석을 위해 상엽 및 기병엽 후 급속 동결하고, 조직학을 위해 중엽을 보존하고, 습식 대 건조 중량 비율을 위해 하엽을 사용합니다(그림 9A).</li>
	</ol></li>
	<li>3시간 재관류 시간이 끝나기 10분 전에 인슐린 주사기로 헤파린(1,000U/kg)을 경정맥에 주사하여 수용자 샘플을 채취할 준비를 합니다. 참고: 이 헤파린 투여는 폐의 혈전을 예방하고 조달 시 보다 철저한 홍조를 허용합니다.</li>
	<li>혈장 수집<ol><li>3시간 재관류 기간이 끝나면 IVC를 통해 주사기로 혈액 1mL를 수집합니다.</li>
		<li>얼음에 보관한 다음 2,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 채취합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>출혈을 허용하기 위해 IVC를 절단하여 수용자 쥐를 안락사시킵니다.</li>
	<li>흉궁을 따라 횡격막을 해부하고 흉곽을 해부하여 흉강을 노출시킵니다.</li>
	<li>원하는 경우 천연 또는 이식된 폐에서 기관지폐 기관지폐액을 수집합니다(선택 사항). 참고: 습식 대 건조 중량 비율 또는 조직학이 폐에서 수행되는 경우 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 기관지폐 수액 수집을 수행해서는 안 됩니다.<ol><li>기관 주위에 4-0 실크 봉합사를 끼우고 기관과 삽관 튜브 주위에 단단한 이중 매듭을 묶어 유체 누출을 방지합니다.</li>
		<li>우엽과 좌엽에서 BAL 유체 수집을 위한 얼음처럼 차가운 PBS의 양을 계산합니다. 참고: 오른쪽 폐의 용적 비율은 63%이고 왼쪽 폐의 용적 비율은 37%입니다16. 따라서 각 측면에 주입할 PBS의 양을 결정하려면 일회 호흡량(Td = 7.2mL/kg)의 두 배에 오른쪽 폐의 경우 63%, 왼쪽 폐의 경우 37%를 곱한 부피로 계산해야 합니다.</li>
		<li>왼쪽 폐 폐문 부위(그림 10A)에 Yasargil 클램프를 놓고 혈관 카테터에 연결된 주사기를 사용하여 계산된 양의 얼음처럼 차가운 PBS를 오른쪽 폐(수혜자의 천연 엽)에 주입하고 주사기 플런저를 부드럽게 위로 당겨 기관폐 지폐액을 수집합니다. 두 번 수행하십시오. 알림: 주입된 유체의 70-80% 회복을 예상해야 합니다.</li>
		<li>Yasargil cl 제거amp 왼쪽 폐에 있고 cl을 놓습니다.amp 오른쪽 폐 폐문 영역에 있습니다(그림 10B).</li>
		<li>이식된 좌엽에서 우엽에 채취한 것과 같은 방법으로 기관지폐 지폐액을 채취한 후 우측 폐 폐문골 부위에 클램프를 제거한다.</li>
	</ol></li>
	<li>튜브에 부착된 18G 혈관 카테터와28cmH2O에 매달린 20mL의 사전 냉장 보존 용액이 담긴 주사기를 사용하여 PA를 통해 미세 해부 스프링 가위로 오른쪽 및 왼쪽 귓바퀴를 절단하고 중력에 의해 폐를 플러시합니다.</li>
	<li>수혜자의 폐에서 샘플을 수집합니다.<ol style="margin-left: 40px;"><li>단백질 또는 RNA 발현 분석을 위해 상엽 및 기병후 엽을 스냅 동결하고, 조직학을 위해 중엽을 보존하고, 습윤-건조 중량 비율을 위해 하엽을 사용합니다)(그림 9A).</li>
		<li>이식된 왼쪽 좌엽을 스냅 냉동을 위해 수집된 위쪽 영역, 조직학을 위한 중간 영역, 습식 대 건조 중량 비율을 위한 아래쪽 영역의 세 부분으로 나눕니다(그림 9B).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

BAW, YGL 및 JLK는 NIH(National Institutes of Health) 보조금 R01HL143000을 통해 지원됩니다. BAW는 국방부(DOD) 보조금 W81XWH1810787을 통해 지원됩니다. SMB는 NIH 보조금 R01DK123475를 통해 지원됩니다. JM은 NIH 보조금 AR061385, AR070752, DK106394 및 AG056919와 국방부 보조금 W81XWH-18-1-0787을 통해 지원됩니다.

이 보고서에서 우리는 절차를 최적화하기 위해 쥐 폐 이식 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 개입했습니다. 쥐의 폐 이식을 위한 다양한 커핑기술이 보고되었지만1,2,3,4,5,6,7,8,9,15, 이 과정은 여전히 주관적이고 미세외과 의사가 적용하기 어려울 수 있습니다. 혈액을 공급하기 위한 PV 및 PA의 적절한 크기의 커프 또는 이...

삼십 년이 넘는 기간 동안 연구자들은 생성된 데이터가 실제 임상 상태를 보다 일관되고 더 잘 반영할 수 있도록 쥐 폐 이식 모델을 수정하고 개선해 왔습니다. 우리 실험실에서 이 모델을 수행하는 동안 우리는 문합에 대한 커프 기술, 수혜자의 4번째 늑간 공간 식별, 수혜자의 시술 중 폐 팽창 및 상처 봉합, 분석을 위한 샘플 수확의 네 가지 개선 영역을 결정했습니다.
문합에 대한 커핑 기술 수정은 기증자 폐 1,2,3,4,5,6의 처리 시간을 단축하고 미세외과 의사가 문합 절차를 더 빠르고 기술적으로 쉽게 만들어 전체 이식 절차를 개선할 수 있습니다. 이식된 폐에 필요한 혈액과 기류를 공급하기 위해 적절한 크기의 커프를 사용하는 것이 중요하지만 폐정맥(PV), 폐동맥(PA) 또는 기관지(Br)5,7,8,9. PV, PA 및 Br의 직경은 기증자 및 수혜자 쥐의 체중과 관련이 있으므로 커프 크기는 체중을 기준으로 할 것을 제안합니다. 이 보고서는 이식된 폐에 혈액과 공기 공급을 최적화하는 역할을 하는 쥐의 체중(180g에서 270g 이상)을 기준으로 커프의 크기 가이드를 제공합니다(표 1).
새로운 미세외과 의사는 기증자 시술 중에 기증자 폐를 성공적이고 쉽게 조달할 수 있지만 수혜자의 시술 중에 폐를 이식하는 것은 더 복잡하고 미세외과 의사의 경험에 달려 있습니다. 수혜자의 왼쪽 폐에 접근하기 위해 4번째 늑간 공간을 찾으려는 시도는 주관성을 유지하고 시술 시간을 늘릴 수있는 더 어려운 단계 중 하나입니다. 따라서 흉부 측정과 심장의 두근거림을 이용하여4,5,6,10,11,12를 해부할 정확한 부위 흉벽을 찾아늑간 공간 위치를 식별하는 데 도움이 되는 간단하고 객관적인 방법을 소개합니다.
우리는 또한 장기 손상의 잠재적 원인인 기증자 폐 팽창에 대한 개선을 제안합니다. 기증자 폐는 재관류가 시작될 때까지 수축됩니다. 4번째 늑간 공간을 봉합하는 동안 기증자 폐는 일반적으로 PEEP를 2 cmH 2 O에서 6 cmH2O로 증가시켜팽창시킵니다. 과팽창으로 인한 폐 손상을 최소화하기 위해 5번째 갈비뼈보다 아래쪽에 있는 4번째 갈비뼈 주위에 간단한 이중 매듭으로 3개의 6-0 나일론 봉합사를 배치하는 기술을 제안합니다. 상처를 봉합 할 때가되면 3 개의 봉합사의 끝을 양손에 지혈제로 잡고 양쪽을 잡아 당겨 상처를 한꺼번에 봉합하고 PEEP를 즉시 2cmH2O로 줄입니다. 이런 식으로, 폐는 가능한 한 최단 시간 동안 확장 될 수 있습니다10.
실험이 끝나면 연구자는 종종 각 이식에서 다양한 유형의 분석을 위해 여러 유형의 샘플을 수집하려고 합니다. 예를 들어, 스냅 냉동 조직, 포르말린 고정 조직, 폐부종을 결정하기 위한 습윤 대 건조 중량 비율 조직 및 기관지정맥 세척액(BAL)은 모두 이식이 얼마나 잘 진행되었는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 기관지폐 기관지폐 수액을 수집하는 전통적인 방법은 수혜자의 천연 엽과 기증자의 이식된 엽 둘 다로부터 혼합된 풀링된 샘플을 허용한다13,14,15. 이를 극복하기 위해 우리는 이식된 폐와 천연 폐의 상태에 대한 보다 정확한 통찰력을 얻을 수 있는 폐문 영역을 클램핑하는 방법을 제시합니다. 또한 폐의 각 측면에서 기관지폐 기관지폐액을 수집하는 데 사용되는 PBS의 양은 농도로 측정되는 사이토카인 및 케모카인과 같은 수많은 용해성 인자를 포함하고 있기 때문에 고려하는 것이 중요합니다. 예상되는 폐활량에 주입 된 체액의 양을 정상화하면 비교에 도움이 될 수 있습니다. 오른쪽에 4개의 엽(葉)이 있고 왼쪽에 1개의 엽(葉)이 있으며, 쥐의 5개 엽(葉)은 각각 다른 부피와 표면적을 가지고 있다(16). Backer et al.의 폐엽 부피 측정에 대한 이전 연구에 따르면, 전체 폐의 총 부피 중 우엽의 부피는 63%(4400mm3)이고 좌엽의 부피는 37%(2500mm3)입니다. 따라서 기관지폐 기관지폐액을 수집하는 데 사용되는 PBS의 부피는 일회 호흡량(7.2mL/kg)의 두 배에 오른쪽 폐의 경우 63%, 왼쪽 폐의 경우 37%를 곱한 값으로 계산하는 것이 좋습니다. 이 접근 방식을 사용하면 체중 및 타이밍10,16과 같은 변수를 더 잘 제어할 수 있습니다.
전체적으로, 이 보고서에서 우리는 절차를 보다 효율적으로 만들고 각 실험에서 보다 정확하고 풍부한 데이터를 생성하는 능력을 높일 수 있는 쥐 폐 이식의 표준 실험 모델에 대한 몇 가지 수정 사항을 보여줄 것입니다.

<table><tbody><tr><td>12 게이지 혈관 카테터</td><td>BD</td><td>382277</td><td></td></tr><tr><td>14 게이지 혈관 카테터</td><td>B. Braun</td><td>4251717-02</td><td></td></tr><tr><td>16 게이지 혈관 카테터</td><td>B. Braun</td><td>4252586-02</td><td></td></tr><tr><td>18 게이지 혈관 카테터</td><td>B. Braun</td><td>4251679-02</td><td></td></tr><tr><td>20 게이지 혈관 카테터</td><td>B. Braun</td><td>4252527-02</td><td></td></tr><tr><td>4-0 실크 봉합사</td><td>외과 전문 공사</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>6-0 나일론 봉합</td>사 <td>AD 수술</td><td>S-N618R13</td><td></td></tr><tr><td>7-0 나일론 봉합사</td><td>AD 수술</td><td>S-N718SP13</td><td></td></tr><tr><td>8-0 나일론 봉합</td>사 <td>AD 외과</td><td>XXS-N807T6</td><td></td></tr><tr><td>베타딘 스프레이</td><td>Avrio Health L.P</td><td>UPC</td><td></td></tr> 367618160039 <tr><td>클리퍼</td><td>VWR</td><td>MSPP-023326</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 마이크로 해부 스프링 가위</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5668</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 - 미세 집게</td><td>미세 과학 도구</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>전기 소작</td><td>Macan</td><td>MV-7A</td><td></td></tr><tr><td>기관 내 삽관 키트</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE</td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>미세 과학 도구</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-mosquito hemostat</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-7112</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fresnius Medical Care</td><td>C504701</td><td></td></tr><tr><td>Insulin syringe</td><td>Life Technologies</td><td>B328446</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올 면봉</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Hikma Pharmaceuticals PLC</td><td>NDC 0413-9505-10</td><td></td></tr><tr><td>Dieffenbach Bulldog Clamp</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI14117</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더/집게, 곡선형</td><td>Micrins</td><td>MI1542</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더/집게, Straight</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Perfadex Plus(장기 보존 솔루션)</td><td>XVIVO Perfusion AB</td><td>REF# 19950</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent </td><td>SpO2 및 심장 박동을 확인하는 데 사용되는</td>Scientific <td>PS-MSTAT-RT</td></tr><tr><td>견인</td>기 <td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-6560</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>PP Pharmaceuticals LLC</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 소동물 마취 시스템</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-MVG-Module</td><td></td></tr><tr><td>Sterile&nbsp; 면 거즈 패드</td><td>Fisherbrand</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>수술 현미경</td><td>Leica</td><td>M500-N w/ OHS</td><td></td></tr><tr><td>주사기 5mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen 스프링 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Korn Pharmaceuticals Corp</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Yasargil 클램프</td><td>Aesculap, Inc</td><td>FT351T</td><td>기관지를 고정하는 데 사용</td></tr><tr><td>Yasargil 클램프</td><td>Aesculap, Inc</td><td>FT261T</td><td>hilum</td></tr><tr><td>Yasargil 클램프 어플리케이터</td><td>Aesculap, Inc</td><td>FT484T</td><td></td></tr></tbody></table>

온난 허혈/재관류 손상의 쥐 폐 이식 모델: 결과 개선을 위한 최적화

A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes

쥐 폐 이식에 대한 우리의 경험에서 우리는 개선해야 할 몇 가지 영역을 발견했습니다. 폐정맥(PV), 폐동맥(PA) 또는 기관지(Br)에 적합한 커프 크기를 선택하는 방법에 관한 기존 문헌의 정보는 다양하므로 쥐 폐 이식 중 적절한 커프 크기를 결정하는 것은 시행착오를 거쳐야 합니다. 혈관이나 기관지의 크기에 적합한 가장 작은 효과적인 커프를 사용하도록 커핑 기술을 표준화함으로써 이식 절차를 보다 안전하고 빠르며 성공적으로 만들 수 있습니다. PV, PA, Br의 직경은 쥐의 체중과 관련이 있기 때문에 체중 기반 가이드를 사용하여 적절한 크기를 선택하는 전략을 제시합니다. 폐 부피는 체중과도 관련이 있기 때문에 온열 허혈 동안 기증자 폐 팽창을 위한 적절한 공기량을 선택할 때와 기관지폐포 세척(BAL) 수액 수집 중에 주입할 적절한 양의 PBS에 대해서도 이 관계를 고려해야 합니다. 우리는 또한 4차 늑간 공간 해부, 상처 봉합 및 천연 엽과 이식된 엽 모두에서 샘플 수집 방법을 설명합니다.

폐부종을 측정하기 위해, 습윤 대 건식 중량비를 계산하였다. 기증자의 천연엽, 이식된 엽 및 수혜자의 천연엽을 프로토콜에 기재된 대로 수집하고, 습윤 중량에 대해 즉시 칭량하고, 60°C에서 48시간 동안 건조시킨 다음, 건조 중량에 대해 다시 칭량하였다. 증가된 습윤 대 건식 중량 비율은 폐부종을 나타냅니다. 우리의 결과는 이식된 엽이 기증자 또는 수혜자의 본래 엽에 비해 습윤 대 건조 중량 비율이 유의하게 증가했음을 나타냅니다(p=0.0050, n=6/그룹; 그림 11).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="3">커프의 혈관 카테터 크기</td>
		</tr><tr><td>쥐 체중 ...

여기에서는 결과를 개선하는 데 도움이 되는 쥐 폐 이식 모델에 대한 최적화를 제시합니다. 체중에 따른 커프스 사이즈 가이드, 4차 늑간 공간을 확인하기 위한 측정 전략, 상처 봉합 및 BAL(기관지폐포 세척) 체액 및 조직 수집 방법을 제공합니다.

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods ...

이 프로토콜은 방법론을 개선하고 신뢰할 수 있는 폐 이식을 하는 데 도움이 되는 4가지 주요 영역을 식별합니다. 첫 번째는 재현 가능한 커핑 기술입니다. 두 번째는 네 번째 늑간 공간, 상처의 철저한 봉합, 그리고 분석을 위해 샘플을 회수하고 얻는 방법을 정확하고 재현 가능하게 식별하는 것입니다.이러한 기술은 분자 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 개발하기 위해 신뢰할 수 있는 폐 이식 방법을 개발하는 데 도움이 됩니다. 심박수/산소 포화도 모니터링 장비를 켜고 보드를 섭씨 42도까지 예열하여 수술 장치 설정을 시작합니다. 또한 환기 및 마취 기계를 켜서 이소플루란 증발기를 예열하십시오.마취 주사기에 10ml의 액체 이소플루란을 채우고 주사기를 환기 및 마취 기계에 장착합니다. 그런 다음 높이와 초점을 기본 설정에 맞게 조정한 상태에서 수술용 현미경을 켜고 전기 소작 장치를 시작합니다. 마찬가지로 수술 도구를 준비하고 배치하십시오.표 1을 참조하여 쥐의 체중을 기준으로 커프를 만드는 데 사용할 혈관 카테터의 정확한 게이지 크기를 결정하십시오. 폐동맥, 기관지 및 폐정맥에 대한 커프를 준비한 후 수술 현미경으로 멸균 된 표면에 적절한 크기의 혈관 카테터를 놓습니다. 그런 다음 늑골 등 수술 칼날 번호 11을 사용하여 혈관 카테터를 90도 각도로 절단하여 커프 본체 상단에 너비와 높이가 1mm 인 2mm 길이의 커프 몸체를 형성합니다.수술을 위한 랩을 준비한 후 가위로 3-4cm 길이의 정중선 피부 절개, 목 중간 부위를 만들고 집게를 사용하여 피하 조직과 근육을 조심스럽게 절개합니다. 기관내 삽관의 경우 기관 주위에 4-0 실크 봉합사를 끼웁니다. 그런 다음 16게이지 혈관 카테터를 기관에 삽입하고 기관 주위에 봉합사를 이중 매듭으로 단단히 묶은 다음 단일 매듭으로 혈관 카테터를 제자리에 고정합니다.혈관 카테터를 인공 호흡기에 연결하여 쥐의 수술 마취면을 1-2 % 이소 플루 란으로 유지합니다. 가위를 사용하여 복강근 절개술을 정중선과 횡 절개를 결합한 것입니다. 그런 다음 하대정맥 또는 IVC를 통해 인슐린 주사기로 헤파린 킬로그램당 1, 000 단위를 주사하고 전신 순환을 위해 10분 동안 허용합니다.폐가 환기하는 동안 미세 해부 스프링 가위로 오른쪽 및 왼쪽 귓바퀴를 자른 다음 폐동맥을 통해 18 게이지 혈관 카테터를 도입하여 28cm의 물에 매달린 주사기에 20 밀리리터의 보존 용액으로 폐를 중력 플러시하고

a-rat-lung-transplantation-model-warm-ischemiareperfusion-injury

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Obliterative bronchiolitis는 폐 이식받는 사람의 장기 생존의 열쇠 장애와 강력한 잠복기 모델의 부족이다 obliterative bronchiolitis의 immunopathogenesis를 검토 걸로. 다른 고형 장기 이식과는 달리, vascularized 마우스 폐 이식이있다는 최근에 개발되었습니다. 여기 murine orthotopic 단일 폐 이식 후 당사 독자 개발한 obliterative bronchiolitis 모델을 보여줍니다.

Orthotopic 폐 이식의 Murine 모델에 Obliterative Bronchiolitis의 개발

이 연구의 목표는 쥐 정형 소 간 이식 모델을 수정하여 인간의 간 이식을 더 잘 나타내고 수령인 생존을 개선하는 것입니다. 제시된 방법은 기증자 간동맥을 수령인 간동맥에 연결하여 간 동맥 유입을 재확립합니다.

직교 간 이식의 쥐 모형에 있는 동맥 재연결 후에 감소된 합병증

이 논문은 간 이식 후 허혈 재관류 손상에 대한 기본 연구를 용이하게하기 위해 쥐에서 간 형 편 (간 허혈)의 동물 모델을 구축하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

쥐 간 이식 모형에 있는 혈역학적인 변경을 시뮬레이션하여 기관 허혈-재관류 상해

환기를 유지하고 저산소증을 피하면서 왼쪽 폐 허혈 재관류 (IR) 손상을 만드는 마우스 수술 모델.

Orotracheal 삽관 및 환기 폐 허혈 재관류 수술의 마우스 모델

여기에서 우리는 쥐 모델에서 정상 체온 상피 보존 후 이종 국소 이식된 심장의 평가 프로토콜을 제시합니다.

Normothermic Ex-Situ 관류 이종 심장 이식의 쥐 모델

여기에서는 쥐 EVLP 모델을 확립하는 데 필요한 단계를 설명하고 관류된 폐와 관련된 염증 프로파일을 보여줍니다. 목표는 쥐 EVLP 모델에 대한 지식과 경험을 전파하여 이 혁신적인 기술과 관련된 생물학적 반응을 통합적으로 이해할 수 있도록 하는 것입니다.

폐 이식의 중개 통찰력을 위한 Ex vivo Lung Perfusion Rat Model 구축

이 프로토콜은 마우스 모델에서 폐 허혈 재관류 손상을 연구하는 데 사용할 수 있는 실현 가능하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 좌폐 고막 클램핑 방법을 설명합니다.

Murine Left Pulmonary Hilar Clamp 폐 허혈 재관류 손상 모델

목표는 EVLP 전반에 걸쳐 4시간 동안 일관된 폐 기능을 유지할 수 있는 쥐에서 새로운 생체 외 폐 관류(EVLP) 모델을 개발하고 설치류 모델에 EVLP를 적용하기 위한 견고한 방법을 제공할 구현 세부 사항을 업계에 제공하는 것입니다.

순환기 사사 후 쥐 폐를 위한 새로운 생체 외 폐 관류 시스템 구축

이 프로토콜은 쥐의 정소성 좌측 폐 이식을 위한 개선된 기술을 설명하며, 수술의 어려움을 줄이고 생존율을 개선하는 데 중점을 둡니다.

쥐의 정소성 좌측 폐 이식

이 프로토콜은 보정된 열 스트레스에 대한 일시적인 노출을 통합하는 쥐 생체 외 폐 관류 모델을 제시하여 손상된 폐 이식편의 치료적 재조정을 위한 내인성 보호 메커니즘을 촉진합니다. 이 접근 방식은 확장 가능하고 재현 가능하며 폐 이식 성공을 개선하기 위한 비약물 치료법 개발을 지원합니다.

이식 전 손상된 폐 이식편의 재활을 위한 체외 폐 관류 중 열 전처리

학습하세요 쥐 폐 이식 수술의 표준화된 커핑 기법과 해부학적 랜드마크 식별 방법. 체중 기반 커프 선택과 재현 가능한 수술 절차를 통해 허혈-재관류 손상 및 분자 메커니즘 연구의 신뢰성을 높입니다.

온난 허혈/재관류 손상의 쥐 폐 이식 모델: 결과 개선을 위한 최적화

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