단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광
2021년 5월 16일
표적단백질(즉,열시프트 분석, TSA)의 용융 온도의 변화를 모니터링하는 것은 수백 개의 화합물의 단편 라이브러리를 선별하는 효율적인 방법입니다. 당사는 본질적인 트립토판 형광 및 단편 스크리닝을 위한 가벼운 백 산란을 모니터링하기 위한 로봇 보조 나노 차분 스캐닝 플루오리미터(나노 DSF)를 구현하는 TSA 프로토콜을 제시합니다.
이 프로토콜은 조각화된 기본 리드 검색 캠페인에 유용한 것으로, 유망한 조각을 열 후보로 선택하는 추가 도구입니다. 단편 스크리닝을 위한 나노 DSO는 표지되지 않은 단백질 샘플의 제한된 양을 사용하며 거의 모든 단백질 표적에 일상적으로 사용될 수 있습니다. 이 메서드는 모든 리간드 컬렉션을 스크리니스트하는 데 사용할 수 있습니다.
또는 다른 메서드에서 열을 확인 합니다. 영하 20도 또는 영하 80도 냉동고에서 조각판을 꺼내 벤치 탑 셰이커에 부드러운 흔들림으로 실온에서 해동하십시오. 30초 동안 500배 G로 플레이트를 원심분리하여 우물 측면에 달라붙는 방울을 수집합니다.
다중 채널 파이펫을 사용하여 단백질 스톡 용액의 MRC 2웰 결정화 플레이트및 파이펫 15 마이크로리터를 각 서브에 넣습니다. 모기에 단편 및 단백질 플레이트 정의를 확인하려면 나노 디스펜서를 켜고 움직이는 구성 요소 주위에 장애물이 없는지 확인하십시오. 그래픽 사용자 인터페이스를 열고, 설치 탭을 클릭하고 데크 구성 에서 화합물이 공급되는 플레이트의 종류와 단백질이 전송되는 플레이트의 종류가 사용 가능한 플레이트 목록에 이미 존재하는지 확인합니다.
그렇지 않은 경우 옵션 과 플레이트를 클릭하고 속성 유형에 대한 올바른 값을 작성하여 새 플레이트 정의를 만듭니다. 설치 탭에서 데크 구성 아래에 플레이트 위치를 지정합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 1위및 MRC 2웰 플레이트에 대한 Grainier U 하단 플레이트를 선택하여 2위를 지정하고 프로토콜을 저장합니다.
조각판을 1개 에 배치하고 단백질 플레이트를 데크 2위치에 놓습니다. 프로토콜 탭에서 파일을 클릭하고 조각을 분배하기 위해 이전 단계에서 저장된 프로토콜을 선택합니다. 분전할 조각의 부피를 0.3 마이크로리터로 정의합니다.
열 1과 12가 조각을 포함하지 않는 일반적인 플레이트의 경우 조각이 포함되어 있지 않고 시작 위치를 열 2로 정의하고 끝 위치는 열(11)으로 정의합니다. 일부 플레이트에서는 열 2개 또는 11개가 비어 있는 경우 열을 3개와 10개를 시작 및 끝 값으로 사용합니다. 프로그램을 시작하려면 실행을 클릭합니다.
약 2분이 걸리는 디스펜싱 후 로봇의 단백질과 조각판을 제거하고 접착제 밀봉 필름으로 밀봉합니다. 단백질 플레이트를 500배 G에서 30초 동안 간략하게 원심분리하여 다음 단계로 진행하기 전에 우물 측면에 달라붙는 방울을 수집합니다. 단편의 첨가로 인해 발생할 수 있는 강수량에 대한 단백질 플레이트의 우물을 육안으로 검사합니다.
많은 우물에서 강수량이 관찰되면 조각의 농도를 줄이고 실험을 반복하십시오. 프로메테우스 기기를 켭다. 터치 스크린에서 오픈 서랍을 눌러 계측기의 모세관 적재 모듈에 액세스합니다.
로딩 모듈에서 마그네틱 스트립을 제거하고 에탄올로 미러를 청소하여 먼지 입자를 제거합니다. 단백질 단편 플레이트에서 모세 혈관으로 용액을 전달하려면 단백질 플레이트와 모세 혈관을 계측기 옆에 배치하여 모세관 적재 모듈에 쉽게 접근할 수 있습니다. 한쪽 끝에 그것을 들고 있는 한 모세관을 취하고 시료를 전송하기 위하여 모세관의 다른 쪽 끝으로 단백질 판에 있는 용액을 터치합니다.
항상 장갑을 착용하고 장갑의 불순물이 측정에 영향을 미치기 때문에 중간에 모세관을 만지지 않도록하십시오. 모세관을 홀더의 지정된 위치에 배치하여 제대로 정렬되고 중앙에 배치하고 이러한 단계를 반복하여 로딩 모듈의 모든 위치를 채웁니다. 마지막에, 모세 혈관 의 상단에 자기 스트립을 배치장소에 그들을 잡고 나노 DSF 실험을 시작하기 위해 닫기 서랍을 누릅니다.
프로메테우스 응용 프로그램 PR을 엽니다. ThermControl 및 새 세션 시작을 클릭하여 새 프로젝트를 만듭니다. 먼저, 샘플의 형광을 감지하기 위해 발견 스캔을 수행합니다. 레이저의 흥분 력을 조정하여 샘플의 형광 신호를 변경합니다.
열 성하를 위해, 녹는 스캔 탭을 클릭, 20섭씨, 최종 온도95섭씨, 온도 경사를 분당 섭씨 1도로 설정합니다. 그런 다음 측정 시작을 클릭합니다. 외식, 운동성 또는 암에서 높게 발현되는 변속 온도의 주파수 분포는 모노폴라 스핀들 키나아제 1의 조절테트라트리코파티드 반복 도메인, 및 SARS-CoV-2 3c-3c-like protease를 도시한다.
음수 값은 조각이 있는 상태에서 용융 온도가 감소했음을 나타내며, 양수 값은 용융 온도의 증가를 나타냅니다. Nsp5의 경우 모든 조각은 안정화 효과가 있는 반면 Hec1및 Mps1의 경우 안정화 및 안정화 타격이 모두 관찰됩니다. 이것은 조각 라이브러리를 선별하는 저렴하고 빠른 방법입니다.
NMR 또는 X 선 결정학과 같은 다른 방법은 조각의 정확한 결합을 보여줄 수 있으며 INX 발견을 통해도 사용할 수 있습니다. 코로나바이러스 프로테아제의 결과는 COVID-19에 대하여 약으로 발전할 수 있는 새로운 화합물을 제안하는 것을 도왔습니다.
개요
본 논문은 단백질 열 안정성을 모니터링하기 위해 나노 차동 주사 형광 분석법(nano-DSF)을 이용한 고효율 프래그먼트 스크리닝 프로토콜을 상세히 설명합니다. 이 방법은 단백질 용융 온도(Tm)의 변화를 관찰함으로써 프래그먼트 결합물을 효율적으로 식별할 수 있게 하며, 광범위한 단백질 표적에 적용 가능합니다. 본 프로토콜은 시료 준비를 위해 나노리터 로봇 분주기를 활용하며, 데이터 수집 및 분석에 대한 단계별 지침을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 단백질 생화학
- 구조 생물학
- 신약 개발
배경
- 열 변위 분석(TSA)은 다양한 조건에서 녹는점의 변화를 측정하여 단백질 안정성을 평가합니다.
- nano-DSF는 고유 트립토판 형광을 모니터링하여 단백질의 언폴딩(unfolding)을 감지하는 무표지 기술입니다.
- 단편 기반 리드 화합물 발견은 표적 단백질에 결합하여 이를 안정화하거나 불안정하게 만드는 소분자를 식별하는 것에 기반합니다.
- 효율적인 스크리닝 방법은 초기 단계의 신약 개발 캠페인에 필수적입니다.
연구 목적
- nano-DSF를 이용한 프래그먼트 스크리닝을 위한 견고하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다.
- 고속 대량 샘플 준비를 위한 나노리터 로봇 디스펜서의 사용법을 시연합니다.
- 신약 개발과 관련된 여러 단백질 표적에 이 방법을 적용하는 사례를 보여줍니다.
사용된 방법
- 로봇 시스템을 이용한 해동, 원심분리 및 분주를 포함한 단백질 및 단편 플레이트 준비.
- nano-DSF 분석을 위해 단백질-단편 혼합물을 모세관으로 전이.
- 고유 트립토판 형광 및 빛의 후방 산란을 통한 응집 모니터링으로 열 변성 측정.
- Prometheus 기기를 이용한 데이터 수집 및 이후 Tm 이동 분석.
주요 결과
- nano-DSF를 이용하여 DSi-Poised 프래그먼트 라이브러리(768개 화합물)의 스크리닝을 성공적으로 수행하였습니다.
- Hec1, Mps1 및 SARS-CoV-2 3C-like protease를 포함한 다양한 단백질 표적에 대해 안정화 및 불안정화 프래그먼트 히트가 모두 확인되었습니다.
- SARS-CoV-2 protease의 경우, 테스트한 모든 프래그먼트가 불안정화 효과를 보여 향후 약물 개발 노력에 기초 자료를 제공하였습니다.
- 본 프로토콜은 신속하고 비용 효율적이며, 다양한 프래그먼트 라이브러리와 단백질 표적에 적용 가능하다는 것이 입증되었습니다.
결론
- nano-DSF는 최소량의 단백질만 필요하며 라벨링이 필요 없어 프래그먼트 기반 스크리닝에 매우 유용한 도구입니다.
- 설명된 프로토콜을 통해 프래그먼트 결합제를 효율적으로 고속 대량 식별할 수 있습니다.
- 이 접근 방식은 다른 프래그먼트 라이브러리와 장비에도 쉽게 적용 가능하여, 다양한 리드 화합물 발굴 캠페인을 지원할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
나노-차등 주사 형광광도법(nano-Differential Scanning Fluorimetry, nano-DSF)은 최소량의 단백질만으로도 조기 단계의 리드 화합물 식별을 위한 프래그먼트 라이브러리의 신속한 무표지 스크리닝을 가능하게 하며, 고처리량 워크플로우를 지원합니다. 이 접근 방식은 다양한 표적 단백질에 대한 정량적 열 안정성 데이터를 제공함으로써 프래그먼트 기반 약물 발견의 예측 신뢰도를 높여줍니다. nano-DSF를 발견 파이프라인에 통합하면 프래그먼트 히트의 선별 과정을 가속화하고, 후속 구조 및 기능 검증을 위한 기초 정보를 제공할 수 있습니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 단백질 열 안정성 변화를 통해 프래그먼트 결합을 직접적으로 평가할 수 있습니다.
- 안정화 및 불안정화 프래그먼트 효과를 구분하여 기능적 표적 검증을 지원합니다.
- 추후 기전 또는 구조 연구를 위한 프래그먼트 히트의 신속한 선별을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 생물물리학적 또는 구조적 워크플로우를 위해 검증된 단백질 단편 혼합물을 준비합니다.
- 강력한 히트 식별을 위해 정량적이고 재현 가능한 Tm 측정값을 제공합니다.
- 자동화된 시료 준비 및 분석을 통해 확장 가능한 고처리량 스크리닝을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 바이러스 프로테아제를 포함하여 질병 관련 단백질 표적과 프래그먼트 스크리닝 결과를 정렬합니다.
- 프래그먼트 식별부터 전임상 후보 물질 선정까지의 연속성을 제공합니다.
- 정량적 결합 데이터를 기반으로 프래그먼트 유래 리드 물질의 위험 조정된 진전을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
nano-DSF 프래그먼트 스크리닝은 초기 발견과 리드 화합물 식별의 접점에 위치하며, 생물물리학적 히트 검증과 후속 구조 규명을 연결하는 역할을 합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 가설 기반의 표적 결합 연구를 지원하기 위해 단백질-리간드 상호작용을 정량화합니다.
- 스크리닝(Screening): 신뢰할 수 있는 프래그먼트 평가를 위해 재현 가능하고 고속 처리 가능한 Tm shift 데이터를 제공합니다.
- 분석(Analytics): 여러 표적에 걸쳐 프래그먼트의 효과를 비교할 수 있는 명확하고 정량적인 판독값을 제공합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 프래그먼트 결합 데이터를 질환 관련 표적과 연결하여 전임상 단계의 우선순위 결정에 정보를 제공합니다.
- 기업 내 재사용(Enterprise Reuse): 유연한 프로토콜을 통해 발견 프로그램 전반의 다양한 프래그먼트 라이브러리와 단백질 시스템을 지원합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 프래그먼트 결합 및 타겟 검증에 대한 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 최소한의 단백질 요구량으로 프래그먼트 스크리닝을 표준화하고 효율화합니다.
- 전략적 가치: 추진 여부 결정(go/no-go decisions)을 가속화하고 실행 불가능한 프래그먼트에 투입되는 자원 소모를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 향후 개발을 위해 프래그먼트 유래 리드 화합물의 리스크 조정 우선순위 선정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 단백질 생화학 및 생물물리학적 분석 설정에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- nano-DSF 장비 및 자동 액체 핸들링 시스템의 이용이 가능해야 합니다.
- 신뢰할 수 있는 결과를 위해 일관된 단백질 품질과 농도가 요구됩니다.
- 본 프로토콜은 다양한 프래그먼트 라이브러리에 적용 가능하며 대부분의 표적 단백질과 호환됩니다.
- 상세한 결합 부위 특성 분석을 위해 보완적인 구조 분석법이 필요할 수 있습니다.
