모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화
June 8th, 2021
여기에 제시된 것은 하향식 질량 분광법과 결합 된 모세관 전기 영동 기반 수소 / 중수소 교환 (HDX) 접근법을위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동시 차등 HDX 및 전기 영동 분리를 수행함으로써 서로 다른 상태의 단백질과 다른 단백질 형태를 포함하여 서로 다른 단백질 종 간의 고차 구조의 차이를 특성화합니다.
이 방법은 상이한 순응자 또는 변이체를 포함하는 공존하는 단백질 종의 분리와 그들의 고차 구조 차이의 온라인 특성화가 단일 CEMS 측정에서 완료될 수 있게 한다. 전기영동 효과를 활용하여 HDX 반응을 위한 거의 100% 지속 환경 및 하향식 MS 분석을 위해 HDX 동안 공존하는 단백질 종의 직교 분리를 제공합니다. 모세관 전기영동, 수소 중수소 교환 또는 CE HDX 설정의 사전 컨디셔닝으로 시작하십시오.
50 % 메탄올, 49 % 물 및 1 % 포름산의 혼합물에서 초음파를 사용하여 실온에서 적어도 30 분 동안 마이크로 바이알 CE-MS 계면을 통해 흐름을 청소하십시오. HPC 변형된 모세관을 모세관 전기 페레시스 또는 CE 장비에 장착합니다. 자동 샘플러를 사용하여 10분 동안 배경 전해질 용액 또는 BGE로 모세관을 헹구고 BGE로 채워 둡니다.
적절한 길이의 개질되지 않은 용융 실리카 모세관 튜빙을 개질제 용액을 위한 주입 튜빙으로서 사용한다. 유니온 및 적절한 슬리브를 사용하여 개질제 튜브를 무딘 온도의 가스 밀폐 유리 주사기에 연결하고 주입 펌프를 사용하여 적어도 10 분 동안 개질제 용액으로 튜브를 헹구십시오. 해당 용액으로 로드된 HPC 코딩된 CE 모세관 및 개질제 튜브의 콘센트를 청소된 CE-MS 인터페이스에 삽입합니다.
주입 펌프로 주사기를 전진시켜 개질제 용액이 인터페이스의 팁에 도달하도록하십시오. 조립된 CE-MS 계면을 질량 분광계의 나노전자 스프레이 이온화 소스 하우징 상에 장착한다. CE-MS 인터페이스에 3-5킬로볼트의 스프레이 전압을 적용합니다.
개질제 용액을 분당 0.1-10 마이크로리터의 유속으로 주입 펌프에 주입하고 CE-MS 인터페이스의 팁에서 안정적인 전기 스프레이를 보장합니다. BGE 및 자동 샘플러를 포함하는 샘플 바이알을 배치하고, 이는 나중에 블랭크 일렉트로페로그램 및 블랭크 질량 스펙트럼을 획득하는데 사용될 것이다. 주입 부피와 주입 파라미터 사이의 관계를 사용하여 주입 부피를 추정한다.
적절한 기간 동안 두 PSI에서 자동 샘플러를 사용하여 샘플 용액을 주입한다. 0-2 PSI 범위의 주입 압력에서 20 킬로볼트의 전기 영동 전압을 인가하여 CE 분리를 시작하고 일렉트로페로그램을 획득하십시오. 한편, 이온 전류 그래프가 시간의 함수로서 획득되는 크로마토그래피 모드에서 MS 데이터를 획득하고, 대응하는 MS 스캔은 단일 스펙트럼으로 자동 결합되지 않는다.
빈 일렉트로페로그램과 질량 스펙트럼을 참조로 저장합니다. 원하는 농도의 단백질 샘플 용액을 함유하는 샘플 바이알을 자동 샘플러에 넣고, 전기영동적으로 분리되고 중수소 표지된 단백질 종의 전기페로그램 및 MS1 스펙트럼을 획득한다. 동일한 실행 내에서 MS1 스펙트럼을 획득한 후 또는 후속 개별 실행에서 관심 종에 대해 탠덤 Ms.측정을 수행합니다.
각 측정 후, 모세관을 BGE로 20 PSI의 압력에서 적어도 10분 동안 플러시한다. CEMS 인터페이스와 모든 튜브를 청소하여 실험이 완료되면 보관하십시오. 직접 주입 모드에서 MS를 사용하여 HDX 엔드포인트 샘플의 데이터 세트를 획득합니다.
주입 압력이 낮기 때문에 CE 피크가 더 잘 분리되었지만 실험 시간과 지속 시간이 모두 증가했습니다. HDX 반응 시간이 길어질수록 단백질 분석물의 분해 수준이 높아졌습니다. 베타 면역글로불린 또는 베타 IG의 A 및 B 분산은 그들의 서열에서 단지 두 개의 아미노산 잔기에 의해서만 상이하며, EIC 유래 일렉트로페로그램에서 적절하게 분리된 두 개의 피크를 발생시켰다.
차등 중수소 표지 분산은 이온의 뚜렷한 질량 분포를 가져왔다. C 이온보다 Z 이온의 상대적 풍부도에서 더 낮은 수가 CS 82와 CS 176 사이의 단편화 효율을 제한하는 베타 IG의 확인에서 독특한 이소화 결합으로 인해 관찰되었다. 베타 IGA 및 베타 IGB로부터 생성된 대부분의 단편 이온은 유사한 정도의 중수소 흡수를 나타낸다.
그러나, 베타 IGA로부터의 서열 변이 부위를 덮는 더 큰 세그먼트는 베타 IGB보다 상당히 더 큰 정도로 퇴화되었다. BGE의 pH는 시료의 등전점에 따라 조절되어 복합체를 유지하면서 단백질 응집을 방지하고 분리를 용이하게 한다.
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개요
이 프로토콜은 모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환(HDX) 방법을 상향식 질량 분석법과 결합한 것을 설명합니다. 이를 통해 다양한 단백질 종류, 포함 상태 및 단백질 형태의 고차 구조 차이를 동시 차동 HDX 및 전기영동 분리를 통해 특성화할 수 있습니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 생화학
- 질량 분석법
- 단백질 화학
배경
- 모세관 전기영동(CE)은 생체 분자를 분리하는 강력한 기술입니다.
- 수소/중수소 교환(HDX)은 단백질 역학 및 구조에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 상향식 질량 분석법은 온전한 단백질 및 그 변이체의 분석을 가능하게 합니다.
- 이 방법은 단일 측정으로 여러 단백질 구조체를 분석할 수 있습니다.
연구 목적
- 단백질의 고차 구조를 분석하는 방법을 개발합니다.
- 공존하는 단백질 종류의 분리를 용이하게 합니다.
- 전기영동 분리를 통한 HDX 측정의 효율성을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 모세관 전기영동 설비의 전처리.
- 메탄올-물-포름산 혼합물에서 CE-MS 인터페이스의 초음파 처리.
- 배경 전해질 용액으로 모세관 세척.
- 전기영동 중 제어된 환경에서 HDX 반응 실행.
주요 결과
- 다른 단백질 구조체의 성공적인 분리.
- 단일 CEMS 측정에서 구조 차이의 특성화.
- 온라인 분석을 위한 방법의 효율성 입증.
- 단백질 종류의 역학에 대한 통찰력 제공.
결론
- CE HDX 방법은 단백질 구조 연구에 효과적입니다.
- 이 접근법은 다양한 단백질 종류 및 상태에 적용할 수 있습니다.
- 단백질 역학 분석을 위한 간소화된 과정을 제공합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Resolving conformational heterogeneity of protein therapeutics remains a critical challenge in biopharma R&D, particularly for characterizing higher-order structures and dynamics of coexisting protein states. This capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (CE-HDX) method enables conformer-specific analysis of protein structural differences in a single measurement, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By integrating electrophoretic separation with top-down MS, the approach enhances predictive confidence in protein behavior and informs go/no-go decisions during lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving conformational differences between protein variants and proteoforms.
- Operational Value: Supports functional target validation through conformer-specific higher-order structure characterization.
- Predictive Value: Improves confidence in target selection by revealing structural dynamics relevant to biological function.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares biologically relevant protein systems for downstream screening by separating and characterizing coexisting states.
- Quantitative Output: Provides global and fragment-level deuteration measurements enabling quantitative comparison of protein conformers.
- Reproducibility: Minimizes residual protic solvent during HDX, creating a near-complete deuterating environment for consistent results.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage conformational insights to preclinical validation by characterizing protein dynamics in solution.
- Mechanistic De-risking: Clarifies structure-function relationships in protein variants, reducing ambiguity in lead optimization.
- Biomarker Alignment: Supports identification of conformational biomarkers linked to functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification, where conformational resolution informs protein engineering and screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by separating and analyzing coexisting protein conformers under near-native conditions.
- Screening: Enables assay standardization by delivering reproducible, quantitative structural readouts for protein species.
- Analytics: Delivers global deuteration levels and fragment-specific uptake patterns that facilitate comparative analysis of protein states.
- Translational Research: Connects structural dynamics to functional outcomes, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for characterizing protein heterogeneity across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein behavior by resolving conformational heterogeneity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through automated CE-MS integration and minimized solvent artifacts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by reducing mechanistic uncertainty in protein targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein candidates based on structural stability and dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in capillary electrophoresis, mass spectrometry, and protein HDX principles.
- Depends on CE-MS interface compatibility, background electrolyte optimization, and modifier solution delivery.
- Necessitates cross-team standardization of HDX quenching, denaturing, and MS acquisition parameters.
- Involves adaptation considerations for varying protein size, charge, and solubility under electrophoretic conditions.
- Limited by analysis time at low infusion pressures, which improve separation but extend experiment duration.
