모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화

이 방법은 상이한 순응자 또는 변이체를 포함하는 공존하는 단백질 종의 분리와 그들의 고차 구조 차이의 온라인 특성화가 단일 CEMS 측정에서 완료될 수 있게 한다. 전기영동 효과를 활용하여 HDX 반응을 위한 거의 100% 지속 환경 및 하향식 MS 분석을 위해 HDX 동안 공존하는 단백질 종의 직교 분리를 제공합니다. 모세관 전기영동, 수소 중수소 교환 또는 CE HDX 설정의 사전 컨디셔닝으로 시작하십시오.

50 % 메탄올, 49 % 물 및 1 % 포름산의 혼합물에서 초음파를 사용하여 실온에서 적어도 30 분 동안 마이크로 바이알 CE-MS 계면을 통해 흐름을 청소하십시오. HPC 변형된 모세관을 모세관 전기 페레시스 또는 CE 장비에 장착합니다. 자동 샘플러를 사용하여 10분 동안 배경 전해질 용액 또는 BGE로 모세관을 헹구고 BGE로 채워 둡니다.

적절한 길이의 개질되지 않은 용융 실리카 모세관 튜빙을 개질제 용액을 위한 주입 튜빙으로서 사용한다. 유니온 및 적절한 슬리브를 사용하여 개질제 튜브를 무딘 온도의 가스 밀폐 유리 주사기에 연결하고 주입 펌프를 사용하여 적어도 10 분 동안 개질제 용액으로 튜브를 헹구십시오. 해당 용액으로 로드된 HPC 코딩된 CE 모세관 및 개질제 튜브의 콘센트를 청소된 CE-MS 인터페이스에 삽입합니다.

주입 펌프로 주사기를 전진시켜 개질제 용액이 인터페이스의 팁에 도달하도록하십시오. 조립된 CE-MS 계면을 질량 분광계의 나노전자 스프레이 이온화 소스 하우징 상에 장착한다. CE-MS 인터페이스에 3-5킬로볼트의 스프레이 전압을 적용합니다.

개질제 용액을 분당 0.1-10 마이크로리터의 유속으로 주입 펌프에 주입하고 CE-MS 인터페이스의 팁에서 안정적인 전기 스프레이를 보장합니다. BGE 및 자동 샘플러를 포함하는 샘플 바이알을 배치하고, 이는 나중에 블랭크 일렉트로페로그램 및 블랭크 질량 스펙트럼을 획득하는데 사용될 것이다. 주입 부피와 주입 파라미터 사이의 관계를 사용하여 주입 부피를 추정한다.

적절한 기간 동안 두 PSI에서 자동 샘플러를 사용하여 샘플 용액을 주입한다. 0-2 PSI 범위의 주입 압력에서 20 킬로볼트의 전기 영동 전압을 인가하여 CE 분리를 시작하고 일렉트로페로그램을 획득하십시오. 한편, 이온 전류 그래프가 시간의 함수로서 획득되는 크로마토그래피 모드에서 MS 데이터를 획득하고, 대응하는 MS 스캔은 단일 스펙트럼으로 자동 결합되지 않는다.

빈 일렉트로페로그램과 질량 스펙트럼을 참조로 저장합니다. 원하는 농도의 단백질 샘플 용액을 함유하는 샘플 바이알을 자동 샘플러에 넣고, 전기영동적으로 분리되고 중수소 표지된 단백질 종의 전기페로그램 및 MS1 스펙트럼을 획득한다. 동일한 실행 내에서 MS1 스펙트럼을 획득한 후 또는 후속 개별 실행에서 관심 종에 대해 탠덤 Ms.측정을 수행합니다.

각 측정 후, 모세관을 BGE로 20 PSI의 압력에서 적어도 10분 동안 플러시한다. CEMS 인터페이스와 모든 튜브를 청소하여 실험이 완료되면 보관하십시오. 직접 주입 모드에서 MS를 사용하여 HDX 엔드포인트 샘플의 데이터 세트를 획득합니다.

주입 압력이 낮기 때문에 CE 피크가 더 잘 분리되었지만 실험 시간과 지속 시간이 모두 증가했습니다. HDX 반응 시간이 길어질수록 단백질 분석물의 분해 수준이 높아졌습니다. 베타 면역글로불린 또는 베타 IG의 A 및 B 분산은 그들의 서열에서 단지 두 개의 아미노산 잔기에 의해서만 상이하며, EIC 유래 일렉트로페로그램에서 적절하게 분리된 두 개의 피크를 발생시켰다.

차등 중수소 표지 분산은 이온의 뚜렷한 질량 분포를 가져왔다. C 이온보다 Z 이온의 상대적 풍부도에서 더 낮은 수가 CS 82와 CS 176 사이의 단편화 효율을 제한하는 베타 IG의 확인에서 독특한 이소화 결합으로 인해 관찰되었다. 베타 IGA 및 베타 IGB로부터 생성된 대부분의 단편 이온은 유사한 정도의 중수소 흡수를 나타낸다.

그러나, 베타 IGA로부터의 서열 변이 부위를 덮는 더 큰 세그먼트는 베타 IGB보다 상당히 더 큰 정도로 퇴화되었다. BGE의 pH는 시료의 등전점에 따라 조절되어 복합체를 유지하면서 단백질 응집을 방지하고 분리를 용이하게 한다.