Name: 모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 학습하세요 모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환(HDX)과 하향식 질량 분석법을 결합한 단백질 고차 구조 분석 기법입니다. 이 방법은 다양한 단백질 형태와 상태의 구조적 차이를 단일 측정으로 효율적으로 특성화합니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC 21974069)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자는 또한 세포 분석 연구소, 심천 베이 연구소, 중국으로부터 지원을 받았다; 생물 의학 기능성 재료의 강소 협력 혁신 센터; 중국 난징 사범 대학의 생물 의학 재료의 장쑤성 핵심 실험실.

<ol><li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methods+in+characterization+of+the+higher+order+structure+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).</li>
<li>Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformer-specific+hydrogen+exchange+analysis+of+Abeta%281-42%29+oligomers+by+top-down+electron+capture+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+small+soluble+Abeta%281-40%29+oligomers+studied+by+top-down+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).</li>
<li>Pan, J., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+structural+analysis+of+posttranslationally+modified+proteins+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance-MS+with+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+and+electron+capture+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation.</a> Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).</li>
<li>Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformer-specific+characterization+of+nonnative+protein+states+using+hydrogen+exchange+and+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United.+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).</li>
<li>Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+enzyme+structure+and+activity+by+kinetic+capillary+electrophoresis-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).</li>
<li>Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+during+proteoform+separation+enables+characterization+of+conformational+differences+between+coexisting+protein+states%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states.</a> Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).</li>
<li>Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+%CE%B2-lactoglobulin%3A+binding+properties%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function.</a> Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).</li>
<li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+Tanford+transition+of+bovine+%CE%B2-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin.</a> Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).</li>
<li>Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+structural+differences+between+variants+A+and+B+of+bovine+beta-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin.</a> Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+capillary+isoelectric+focusing+mass+spectrometry+analysis+of+peptides%2C+proteins%2C+and+monoclonal+antibodies+with+a+flow-through+microvial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).</li>
<li>Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+acetate-coated+fused-silica+capillaries+for+the+separation+of+proteins+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).</li>
<li>Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deducing+disulfide+patterns+of+cysteine-rich+proteins+using+signature+fragments+produced+by+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).</li>
<li>Sutera, S. P., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+Poiseuille%27s+law%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">The history of Poiseuille's law.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).</li>
<li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li>
<li>Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electrospray+ionization+mass+spectrometry+as+a+tool+for+characterization+of+small+soluble+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates.</a> Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).</li>
<li>Fellers, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProSight+Lite%3A+graphical+software+to+analyze+top-down+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data.</a> Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MASH+Suite+Pro%3A+A+comprehensive+software+tool+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).</li>
<li>Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+%CE%B2-lactoglobulin+A%2C+B+and+C+variants+of+bovine+whey+using+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).</li>
<li>Wang, G., Kaltashov, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+characterization+of+the+higher+order+structure+of+disulfide-containing+proteins+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+and+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).</li>
<li>Nicolardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+electrochemical+reduction+of+disulfide+bonds%3A+improved+FTICR-CID+and+-ETD+coverage+of+oxytocin+and+hepcidin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).</li>
<li>Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+analysis+of+disulfide-linked+proteins+using+photoinduced+radical+reactions+and+ET-DDC%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173(2019).</li>
<li>Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+characterization+of+proteins+with+intact+disulfide+bonds+using+activated-ion+electron+transfer+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).</li>
<li>Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+in+a+micro+flow-through+vial+of+a+junction-at-the-tip+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).</li>
</ol>

D. D. Y. Chen은 Flow-through microvial CE-MS 인터페이스를 상용화하고 있는 생명분자를 위한 건강 연구소(Knowledge for Health Institute for Biomolecules)의 설립자 중 한 명입니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.

CE 모세관의 내벽을 코팅하는 목적은 CE 공정13 동안 전기삼투 유동 및 단백질 흡수의 최소화를 포함한다. 전기 삼투 흐름은 중성 또는 반대 하전을 띤 종을 검출기로 구동하는 능력 때문에 소분자의 기존 CE 분석에 유리하지만, 용액에서 유사한 크기와 순 전하를 가진 단백질 종의 분리 효율을 손상시킵니다. 모세관을 HPC로 코팅하면 모세관의 내벽에 있는 실라놀기에 의해 유발되는 전기삼투 유동이 최소화됩니다. 또한, 이러한 실라놀 그룹을 마스킹하면 단백질과의 상호 작용이 줄어들어 모세관 내 단백질의 느린 이동 또는 완전한 보존을 피할 수 있습니다.
전기영동 동안, BGE로부터의 분석물과 양이온 및 음이온 둘 모두는 전기영동 이동을 겪는다. MS와 결합시, CE 모세관의 음전압 측에서 BGE의 저장소는 상이한 조성을 갖는 CE-MS 계면으로 대체된다. 특정 유량으로 양전압 측에서 저장소로부터 모세관에 신선한 BGE를 지속적으로 주입하는 압력...

서로 다른 형태적, 결합 또는 변형 상태에서 단백질 종을 구별하고 구조적 차이를 특성화하는 것은 분자 인식에서 효소 촉매에 이르기까지 생물학적 사건에 관여하는 이들 종 간의 전이 경로를 모니터링하고 이러한 사건의 기초가되는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 종래의 생물물리학적 기술은 용액 중의 불충분한 분해능 및 동적 정보의 손실과 같은 한계로 인해 완전한 해결책을 제공하지 못한다. 질량 분광법 (HDX MS)과 결합 된 수소 / 중수소 교환은 단백질의 불안정한 수소 원자와 의도적으로 도입 된 2H2O용액의 2H 사이의 교환을 통해 중수소 (2H)로 단백질의 구조적 및 형태적 특징을 표시하는 기술입니다. 수소 결합에 관여하거나 단백질 내부의 용매로부터 격리되는 양성자는 쉽게 교환되지 않는다1. 따라서, 교환 가능한 부위에서의 환율이 고차 구조에서의 그의 관여에 크게 의존함에 따라, 단백질 구조는 1H와 2H 사이의 상이한 원자 질량에 기초하여 2H-흡수의 범위와 속도를조사하는 MS에 의해 높은 공간 분해능에서 드러날 수 있다. 최근 수십 년 동안 HDX MS는 단백질 형태 및 역학2를 연구하는 데 매우 성공적인 기술이되었습니다.
HDX MS의 고전적인 상향식 접근법에서, 상이한 형태적, 결합 또는 변형 상태에 있는 단백질 종의 앙상블은 손상되지 않은 단백질 수준에서 분리되지 않고 단백질 분해되어, 생성된 단백질 분해 단편을 복잡한 중수소 내용물로 분석함으로써 개별 종을 특성화하는 것을 불가능하게 만든다. 대조적으로, 하향식 접근법에서, 상이한 중수소 내용물을 혼입시킨 상이한 단백질 상태 또는 프로테오폼은 MS 스캔에서 무손상 단백질 질량의 다중 분포를 야기한다. 이것은 개별 종들이 적절한 질량 필터 (예 : 사중극자)를 사용하여 각 질량 분포에 상응하는 이온의 질량 선택과 후속 탠덤 MS 분석3,4,5,6에서 그들의 형태 차이의 특성화에 의해 분리 될 수있게한다. 그러나, 이 전략에서 단백질 상태 또는 프로테오폼을 분리하는 효율은 그들의 상응하는 질량 분포에서의 차이의 정도에 의해 제한된다.
모세관 전기영동(CE)은 용액 상에서 그들의 상이한 전하 및 유체역학적 크기에 기초하여 단백질 종을 고효율로 분리하는 수단(7)을 제공한다. CE와 HDX를 결합하면 용액 단계에서 단백질 상태 또는 단백질 형태를 추가로 분리할 수 있습니다. 또한, CE 모세관의 작은 부피는 배경 전해질 용액 (BGE), 즉 실행 버퍼로서 완전히 중수소화 된 용액의 활용을 허용하여 모세관을 단백질 샘플을위한 HDX 반응기로 렌더링합니다. 전기영동 과정에서 단백질과 양성자성 시약 사이의 전기영동 이동성의 차이로 인해, CE 동안 HDX를 수행하면 잔류하지 않은 내용물로 단백질 분석물에 대해 거의 완전한 중수소화 환경이 조성되어 HDX 데이터를 사용한 구조 분석의 민감도가 향상됩니다. 이와 같이, 우리는 상태 또는 프로테오폼 특이적 방식으로 단백질 고차 구조를 특성화하기 위해 하향식 MS와 결합된 CE 기반 차등 HDX 접근법을 개발하였다8.
이 백서에서는 재료 준비, 실험 절차 및 데이터 분석 단계를 자세히 설명하여이 접근법에 대한 프로토콜을 설명합니다. 메서드 성능 또는 데이터 품질에 영향을 줄 수 있는 요소는 간단한 메모에 나열되어 있습니다. 여기에 제시된 대표적인 결과는 우유9에 존재하는 주요 유청 단백질인 소 β-락토글로불린(β-lg)의 상이한 단백질과 천연 변이체의 혼합물의 차등 HDX 데이터를 포함한다. 우리는 CE 기반 HDX 및 그 형태에 대한 변형 특이적 특성화 동안 β-lg의 두 가지 풍부한 변형, 즉 A 및 B10,11의 분리 효율, 재현성 및 2H라벨링 성능을 입증합니다.

<table><tbody><tr><td>암모늄 아세테이트</td><td>피셔 화학</td><td>A/3446/50</td><td>&ge; 99%</td></tr><tr><td>CESI 8000 플러스 모세관 전기영동 시스템</td><td>Sciex, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5406000097</td><td></td></tr><tr><td>원심 필터</td><td>Merck</td><td>UFC201024</td><td>10 kDa 컷오프</td></tr><tr><td>중수소 산화물</td><td>에너지 화학 E090001</td><td></td><td>99.9 %</td></tr><tr><td>D 포름산</td><td>Acros 유기물</td><td>&nbsp; </td><td></td>270480250</tr><tr><td>용융 실리카 유리 모세관</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td>ID 50&mu; m, OD 360&mu; m</td></tr><tr><td>가스 크로마토 그래</td>피, <td>애질런</td>트 <td>GC6890N</td><td></td></tr><tr><td>염산</td>, <td>시그마 알드리치</td>, <td>258148</td><td></td></tr><tr><td>히드 록시 프로필 셀룰로오스</td>, <td>알라딘</td><td>H113415</td><td>MW 100000</td></tr><tr><td>자석 교반기</td><td>DLAB</td><td>8030101212</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 화학 A456-4</td><td></td><td>MS 등급</td></tr><tr><td>마이크로 볼륨 UV-Vis 분광 광도계</td><td>DeNovix</td><td>84677JK7731</td><td></td></tr><tr><td>미오글로빈</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus 제약 분석 CE 시스템</td><td>Beckman Coulter, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive UHMR 질량 분석기</td><td>Thermo Fisher Scientific, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나트륨&nbsp; 수산화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>유비퀴틴</td><td>시그마 Aldrich</td><td>U6253</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>SCIENTZ</td><td>SB-5200</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-락토글로불린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L0130</td><td></td></tr></tbody></table>

모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

용액 중에 공존하는 다중 단백질 상태의 형태적 이질성을 해결하는 것은 단백질 치료제의 특성화와 분자 인식에서 효소적 촉매에 이르기까지 생물학적 기능에 중요한 형태적 전이 경로의 결정에서 주요 장애물 중 하나로 남아 있다. 하향식 질량 분광법(MS) 분석과 결합된 수소/중수소 교환(HDX) 반응은 단백질 고차 구조 및 역학을 순응자 특유의 방식으로 특성화하는 수단을 제공합니다. 이 기술의 형태적 분해능은 무손상 단백질 수준에서 단백질 상태를 분리하고 HDX 반응 동안 잔류 비중수소화 양성자성 함량을 최소화하는 효율성에 크게 의존합니다. 
여기서는 형태 분해능을 향상시키는 것을 목표로 하는 HDX MS 접근법의 모세관 전기영동(CE) 기반 변이체를 설명한다. 이 접근법에서, 단백질은 모세관 전기영동 분리 동안 중수소화된 배경 전해질 용액(BGE)을 통해 이동하면서 HDX 반응을 겪는다. 용액 중에 공존하는 상이한 단백질 상태 또는 프로테오폼은 이들의 상이한 전하 대 크기 비율에 기초하여 효율적으로 분리될 수 있다. 단백질과 양성자성 용매 분자 사이의 전기영동 이동성의 차이는 잔류 비중수소화 용매를 최소화하여 HDX 공정 중에 거의 완전한 중수소화 환경을 초래합니다. 유동-관통 마이크로바이알 CE-MS 계면은 분무기의 출구에서 담금질 및 변성 개질제 용액과의 신속한 혼합에 이어 용출된 단백질 종의 효율적인 전기 분무 이온화를 허용한다. 온라인 하향식 MS 분석은 용출된 무손상 단백질 종의 글로벌 중수소 수준을 측정하고, 그 후 기상 단편의 중수소화를 측정합니다. 이 논문은 우유에 공존하는 천연 단백질 변이체를 포함한 시스템에 대한 차등 HDX에서 이러한 접근법을 보여줍니다.

BGE의 주입 압력을 변경하면 분리 효율과 이동 시간을 모두 조정할 수 있으며, 이는 분리되는 단백질의 HDX 반응 시간과 동일합니다 (그림 3). 주입 압력이 낮을수록 실험 기간의 비용으로 CE 피크가 더 잘 분리됩니다 (그림 3A). 이동/HDX 반응 시간이 길수록 단백질 분석물의 중수소 수준이 높아집니다(그림 3B-D). HDX 시간척도(분)에서 중수소 차이는 주로 빠르게 교환할 수 있는 사이트 대신 구조적으로 보호되는 사이트의 서로 다른 교환 범위를 반영해야 합니다. 두 단백질 종에 의해 보여지는 중수소 시간 기능의 추세에 따르면, 이동 시간 차이는 중수소 차이의 주요 원인이 될 것 같지 않다. 실제로, 홀로- 및 아포미오글로빈(Mb)8의 차등 CE-HDX에서,...

여기에 제시된 것은 하향식 질량 분광법과 결합 된 모세관 전기 영동 기반 수소 / 중수소 교환 (HDX) 접근법을위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동시 차등 HDX 및 전기 영동 분리를 수행함으로써 서로 다른 상태의 단백질과 다른 단백질 형태를 포함하여 서로 다른 단백질 종 간의 고차 구조의 차이를 특성화합니다.

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

이 방법은 상이한 순응자 또는 변이체를 포함하는 공존하는 단백질 종의 분리와 그들의 고차 구조 차이의 온라인 특성화가 단일 CEMS 측정에서 완료될 수 있게 한다. 전기영동 효과를 활용하여 HDX 반응을 위한 거의 100% 지속 환경 및 하향식 MS 분석을 위해 HDX 동안 공존하는 단백질 종의 직교 분리를 제공합니다. 모세관 전기영동, 수소 중수소 교환 또는 CE HDX 설정의 사전 컨디셔닝으로 시작하십시오.50 % 메탄올, 49 % 물 및 1 % 포름산의 혼합물에서 초음파를 사용하여 실온에서 적어도 30 분 동안 마이크로 바이알 CE-MS 계면을 통해 흐름을 청소하십시오. HPC 변형된 모세관을 모세관 전기 페레시스 또는 CE 장비에 장착합니다. 자동 샘플러를 사용하여 10분 동안 배경 전해질 용액 또는 BGE로 모세관을 헹구고 BGE로 채워 둡니다.적절한 길이의 개질되지 않은 용융 실리카 모세관 튜빙을 개질제 용액을 위한 주입 튜빙으로서 사용한다. 유니온 및 적절한 슬리브를 사용하여 개질제 튜브를 무딘 온도의 가스 밀폐 유리 주사기에 연결하고 주입 펌프를 사용하여 적어도 10 분 동안 개질제 용액으로 튜브를 헹구십시오. 해당 용액으로 로드된 HPC 코딩된 CE 모세관 및 개질제 튜브의 콘센트를 청소된 CE-MS 인터페이스에 삽입합니다.주입 펌프로 주사기를 전진시켜 개질제 용액이 인터페이스의 팁에 도달하도록하십시오. 조립된 CE-MS 계면을 질량 분광계의 나노전자 스프레이 이온화 소스 하우징 상에 장착한다. CE-MS 인터페이스에 3-5킬로볼트의 스프레이 전압을 적용합니다.개질제 용액을 분당 0.1-10 마이크로리터의 유속으로 주입 펌프에 주입하고 CE-MS 인터페이스의 팁에서 안정적인 전기 스프레이를 보장합니다. BGE 및 자동 샘플러를 포함하는 샘플 바이알을 배치하고, 이는 나중에 블랭크 일렉트로페로그램 및 블랭크 질량 스펙트럼을 획득하는데 사용될 것이다. 주입 부피와 주입 파라미터 사이의 관계를 사용하여 주입 부피를 추정한다.적절한 기간 동안 두 PSI에서 자동 샘플러를 사용하여 샘플 용액을 주입한다. 0-2 PSI 범위의 주입 압력에서 20 킬로볼트의 전기 영동 전압을 인가하여 CE 분리를 시작하고 일렉트로페로그램을 획득하십시오. 한편, 이온 전류 그래프가 시간의 함수로서 획득되는 크로마토그래피 모드에서 MS 데이터를 획득하고, 대응하는 MS 스캔은 단일 스펙트럼으로 자동 결합되지 않는다.빈 일렉트로페로그램과 질량 스펙트럼을 참조로 저장합니다. 원하는 농도의 단백질 샘플 용액을 함유하는 샘플 바이알을 자동 샘플러에 넣고, 전기영동적으로 분리되고 중수소 표지된 단백질 종의 전기페로그램 및 MS1 스펙트럼을 획득한다. 동일한 실행 내에서 MS1 스펙트럼을 획득한 후 또는 후속 개별 실행에서 관심 종에 대해 탠덤 Ms.측정을 수행합니다.각 측정 후, 모세관을 BGE로 20 PSI의 압력에서 적어도 10분 동안 플러시한다. CEMS 인터페이스와 모든 튜브를 청소하여 실험이 완료되면 보관하십시오. 직접 주입 모드에서 MS를 사용하여 HDX 엔드포인트 샘플의 데이터 세트를 획득합니다.주입 압력이 낮기 때문에 CE 피크가 더 잘 분리되었지만 실험 시간과 지속 시간이 모두 증가했습니다. HDX 반응 시간이 길어질수록 단백질 분석물의 분해 수준이 높아졌습니다. 베타 면역글로불린 또는 베타 IG의 A 및 B 분산은 그들의 서열에서 단지 두 개의 아미노산 잔기에 의해서만 상이하며, EIC 유래 일렉트로페로그램에서 적절하게 분리된 두 개의 피크를 발생시켰다.차등 중수소 표지 분산은 이온의 뚜렷한 질량 분포를 가져왔다. C 이온보다 Z 이온의 상대적 풍부도에서 더 낮은 수가 CS 82와 CS 176 사이의 단편화 효율을 제한하는 베타 IG의 확인에서 독특한 이소화 결합으로 인해 관찰되었다. 베타 IGA 및 베타 IGB로부터 생성된 대부분의 단편 이온은 유사한 정도의 중수소 흡수를 나타낸다.그러나, 베타 IGA로부터의 서열 변이 부위를 덮는 더 큰 세그먼트는 베타 IGB보다 상당히 더 큰 정도로 퇴화되었다. BGE의 pH는 시료의 등전점에 따라 조절되어 복합체를 유지하면서 단백질 응집을 방지하고 분리를 용이하게 한다.

capillary-electrophoresis-based-hydrogendeuterium-exchange-for

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

하향식 질량분석법을 사용한 단백질의 구조적 특성 분석을 위한 모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환

든 - TOF 질량 분석법을 성공적으로 단백질 키나제 Pak2 활성화에 아미드 수소 / 중수소 교환을 모니터 활용했다.

Pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - TOF 질량 분광법 분석

단백질의 입체 구조와 역학은 단백질 구조 및 기능 사이의 관계를 이해하기위한 열쇠이다. 고해상도 질량 분광법과 결합 수소 교환은 단백질의 형태 적 역학 연구뿐만 아니라 접촉 인터페이스 및 알로 스테 릭 효과를 포함하여 단백질 - 리간드와 단백질 - 단백질 상호 작용을 특성화하기 위해 다양한 방법이다.

수소 환율 질량 분석을 사용하여 단백질의 역학 분석

여기에서는 고체 분말 내 단백질에 대한 고체 상태 아미드 수소/중수소 교환 질량 분석법(ssHDX-MS) 및 고체 상태 광분해 라벨링 질량 분석법(ssPL-MS)에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 비정질 고체 상태의 단백질 형태 및 상호 작용에 대한 고분해능 정보를 제공하며, 이는 제형 설계에 유용할 수 있습니다.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

자세한 프로토콜 분리, 식별 및 모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS)를 사용 하 여 단백질 샘플에서 proteoforms의 특성에 대 한 설명 합니다. 프로토콜은 단순 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성화 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별에 사용할 수 있습니다.

모 세관 지역 전기 이동 법 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 대규모 하향식 단백질

Lanthipeptide 는 펩타이드 천연 제품의 생합성 중에 다단계 반응을 촉매합니다. 여기서, 우리는 펩타이드 천연 제품 생합성에 관여하는 다른 유사한 효소뿐만 아니라 란티페타이드 신디사이저의 형성 역학을 연구하기 위해 사용될 수 있는 연속, 상향식, 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS) 워크플로우를 설명합니다.

펩타이드 생합성 효소를 조사하기 위한 수소-신투륨 교환 질량 분광법(HDX-MS) 플랫폼

단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.

생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

여기에서 우리는 마이크로 및 밀리 역학 및 신경원 칼슘 센서 하류 조절 요소 길항제 변조기 칼슘 연관과 관련된 구조적 변경의 지학을 모니터링 갇힌 칼슘 화합물, DM-nitrophen과 조합 광열 빔 편향 기술의 응용을보고 .

광열 편향 빔에 의해 해결 단백질의 밀리 초 이하의 구조적 변화

이 논문은 schlieren 사진 및 질량 분석법을 사용하여 주변 이온화 소스의 기체 흐름을 시각화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

슐 리렌 사진의 사용과 주변 질량 분석의 시각화

학습하세요 모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환(HDX)과 하향식 질량 분석법을 결합한 단백질 고차 구조 분석 기법입니다. 이 방법은 다양한 단백질 형태와 상태의 구조적 차이를 단일 측정으로 효율적으로 특성화합니다.

모세관 전기영동 기반 수소/중수소 교환을 통한 하향식 질량 분석법을 통한 단백질의 형태적 특성화

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