Name: 미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 배우세요 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드 생성 프로토콜을 활용한 미토콘드리아 질환 모델링 방법입니다. 비용이 많이 드는 바이오리액터 없이도 미토콘드리아 생체에너지학적 특성을 평가할 수 있습니다.

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기술 지원을 위해 미리암 뷔닝에게 감사드립니다. 우리는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG)(PR1527/5-1 ~A.P.), 스파크 및 베를린 보건연구소(BIH)(BIH 유효성 검사 기금 A.P.), 유나이티드 미의 지원을 인정합니다. 토콘드리아 질병 재단 (UMDF) (A.P.에 리 증후군 국제 컨소시엄 보조금), 대학 병원 뒤셀도르프 (Forschungskommission UKD 에 A.P.), 독일 연방 교육 및 연구부 (BMBF) (e: 바이오 젊은 조사관은 A.P.에 AZ 031L0211을 부여합니다. C.R.R.의 실험실에서 의 작업은 DFG에 의해 지원되었다 (FOR 2795 "스트레스아래 시냅스", Ro 2327/13-1).

<ol><li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monogenic+mitochondrial+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li>
<li>Carelli, V., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA%3A+impacting+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems.</a> Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).</li>
<li>Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%3A+hope+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases: hope for the future.</a> Cell. 181 (1), 168-188 (2020).</li>
<li>Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development+for+the+therapy+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Drug development for the therapy of mitochondrial diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).</li>
<li>Tyynismaa, H., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+mitochondrial+DNA+defects+and+their+relevance+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease.</a> EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rescue+in+pluripotent+cells+from+patients+with+mtDNA+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease.</a> Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).</li>
<li>Galera-Monge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+calcium+dysregulation+in+Leigh+syndrome+induced+pluripotent+stem+cell+derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191(2020).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alleviation+of+neuronal+energy+deficiency+by+mTOR+inhibition+as+a+treatment+for+mitochondria-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration.</a> Elife. 5, 13378(2016).</li>
<li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+neural+progenitors+are+an+effective+drug+discovery+model+for+neurological+mtDNA+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li>
<li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+induced+pluripotent+stem+cell-based+drug+discovery+for+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease.</a> Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).</li>
<li>Chiaradia, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+for+the+study+of+human+neurobiology+at+the+interface+of+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo.</a> Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health%2C+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li>
<li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+of+MELAS+neural+cells+reveal+hyperactive+Notch+signaling+that+impacts+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment.</a> Cell Death and Disease. 11 (3), 182(2020).</li>
<li>Romero-Morales, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+cerebral+organoids+model+features+of+Leigh+Syndrome+and+reveal+abnormal+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+manifestations+of+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+%26+Behavioral+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease.</a> Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).</li>
<li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li>
<li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li>
<li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).</li>
<li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function%3A+from+animal+models+to+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemestry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).</li>
<li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li>
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저자는 경쟁 금융 또는 비 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 재현 가능한 생성과 미토콘드리아 질환 모델링에 대한 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 이전에 게시된 work20에 따라 수정됩니다. 본 프로토콜의 한 가지 주요 장점은 각 오르가노이드의 수동 포함을 비계 매트릭스에 포함시키지 않는다는 것입니다. 실제로, 매트릭스 용액은 단순히 세포 배양 배지에 용해된다. 더욱이, 고가의 생물반응기를 채용할 필요가 없으며, 오르가노이드는 인큐베이터 내부의 궤도 셰이커에 배치된 표준 조직 배양 6웰 플레이트에서 배양될 수 있기 때문이다. 이 절차는 또한 다양한 개별 라인에서 파생된 다른 오르가노이드를 함유하는 여러 플레이트의 병렬 재배를 가능하게 하여 실험의 처리량을 증가시키고 다른 오르가노이드의 성장 프로필에서 나타나는 잠재적 차이의 모니터링을 가능하게 한다. 우리는 일관된 결과로, 미토콘드리아 질병에 의해 영향을 받은 건강한 통제 및 개별에서 파생된 다른 iPSCs를 사용하여 이 프로토콜을 시험...

미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타냅니다1. 그(것)들은 산화 인산화 (OXPHOS)2, 호흡 사슬 조립, 미토콘드리아 역학 및 미토콘드리아 DNA 전사 또는 복제를 포함하여 다른 미토콘드리아 프로세스를 방해하는 유전 돌연변이에 기인합니다 3. 에너지 요구 사항이있는 조직은 특히 미토콘드리아 기능 장애4에 의해 영향을받습니다. 따라서 미토콘드리아 질환을 가진 환자는 일반적으로 조기 발병 신경 학적 증상을 개발합니다.
미토콘드리아 질환에 걸린 어린이에게는 현재 치료법이 없습니다5. 미토콘드리아 질환의 약물 개발을 위한 주요 장애물은 인간 질병 과정을 재구성하는 효과적인 모형의 부족입니다6. 현재 연구된 동물 모델 중 일부는 환자에서 존재하는 신경학적 결함을 나타내지 않는다7. 따라서 미토콘드리아 질환의 신경 병리학의 기본 메커니즘은 여전히 완전히 이해되지 않습니다.
최근 연구는 미토콘드리아 질환에 의해 영향을 받는 환자에서 iPSC를 생성 하 고 환자 특정 신경 세포를 얻기 위해 이러한 세포를 사용. 예를 들어, 미토콘드리아 질환, 리 증후군과 관련된 유전적 결함은 세포 생체 에너지8,9, 단백질 합성10 및 칼슘 항상성9,11에서 수차를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 이 보고는 미토콘드리아 질병에서 생기는 신경 손상에 중요한 기계론단서를 제공했습니다, 이 불치병을 위한 약 발견을 위한 도로를 포장12.
그러나 2차원(2D) 문화는 3D 기관의 건축복잡성및 지역조직에 대한 조사를 가능하게 하지 않는다13. 이를 위해 환자별 iPSCs14 에서 추출한 3D 뇌 오르가노이드를 사용하면 연구원이 추가적인 중요한 정보를 얻을 수 있으며 이로 인해 미토콘드리아 질환이 신경계의 개발 및 기능에 미치는 영향을 해부하는 데 도움이 될 수 있습니다15. 미토콘드리아 질환을 조사하기 위해 iPSC 유래 뇌 오르가노이드를 사용하는 연구는 미토콘드리아 질환의 신경 발달 성분을 밝히기 시작했다. 
미토콘드리아 질환, 미토콘드리아 뇌병증, 젖산증 및 뇌졸중과 같은 에피소드 증후군(MELAS)과 관련된 돌연변이를 운반하는 척수 오르가노이드는 결함이 있는 신경 발생 및 지연된 운동 뉴런 분화를 보였다16. 미토콘드리아 질환, 리 증후군 환자에서 유래한 피질 오르간노이드는 크기 감소, 신경 상피 싹 생성의 결함 및 피질 아키텍처의 손실을 보였다17. 리 증후군 환자에서 뇌 오르가노이드는 질병 결함이 미토콘드리아 대사에 투입 할 수없는 신경 전구 세포의 수준에서 시작 것으로 나타났다, 비정상적인 신경 분지 및 형태 발생을 일으키는 18. 따라서, 신경 전조자는 미토콘드리아 질환에 대한 세포 치료 표적을 나타낼 수 있으며, 미토콘드리아 기능을 촉진하는 전략은 신경계의 기능적 발달을 지원할 수 있다.
뇌 오르가노이드의 사용은 미토콘드리아 질환의 신경 발달 성분을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미토콘드리아 질환은 주로 조기 발병 신경 변성5로 간주됩니다. 그러나, 신경 발달 결점은 또한 발달 지연 및 인지 장애를 포함하여 미토콘드리아 질병에 의해 영향을 받은 환자에서 존재합니다19. 환자 별 뇌 오르가노이드는 이러한 측면을 해결하고 미토콘드리아 질환이 인간의 뇌 발달에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 설명합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 또한 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 헌팅턴병4와 같은 다른 일반적인 신경 질환에서 병역적 역할을 할 수 있습니다. 따라서 뇌 오르가노이드를 사용하여 신경 발달에 미토콘드리아 결함의 영향을 해명하는 것도 이러한 질병의 연구에 도움이 될 수 있습니다. 이 논문은 미토콘드리아 질환의 질병 모델링을 수행하는 데 사용할 수있는 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Designer</td><td>Serif (Europe) Ltd</td><td></td><td>레이아웃 소프트웨어; 벡터 그래픽 편집기</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 기니피</td>그 <td>Sigma Aldrich</td><td>SAB4600033-250UL</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31571</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1397-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta;-Tubulin III (TUJ-1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>아르곤 레이저</td><td>Melles Griot</td><td></td> 다른 <td>레이저, 예를 들어, 다이오드 레이저를 방출하는 488도 괜찮습니다,</td></tr><tr><td>너무 Ascorbic</td><td>acid Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>B-27 with Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>3% in PBS, store solution at -20 &deg; C</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-0811</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Cell Star 세포 배양 6 웰 플레이트</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>화학적으로 정의 된 지질 농축</td><td>11905031</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨 포칼 레이저 스캐닝 현미경 C1</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>모듈 식 컨 포칼 현미경 </td></tr><tr><td>시스템 Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) 기저막 매트릭스, 페놀 무적색, LDEV 무함유</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>매트릭스 구성 요소</td></tr><tr><td>CyQUANT 세포 증식 분석 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2660-100ML</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP180C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP192C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP182C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DS-Q1Mc 카메라</td><td>Nikon 현미경 솔루션</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 90i 직립 광시야 현미경</td><td>Nikon 현미경 솔루션</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 600FN 정립 현미경</td><td>Nikon 현미경 솔루션</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ts2 도립 현미경</td><td>Nikon Microsope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-C1 Silver 버전 3.91</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>컨포칼 현미경용 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>370-86-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-291</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow MEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>브랜드</td><td>747715</td><td>Inverted</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>헬륨-네온 레이저</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>다른 모든 레이저, 예를 들어 594를 방출하는 다이오드 레이저는 괜찮습니다., 너무</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>HERACell 240i CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Image J 1.53c</td><td>Wayne Rasband National Institute of Health</td><td></td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 교체용</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>레이저(407nm)</td><td>Coherent</td><td></td><td>다른 레이저(예: 407을 방출하는 다이오드 레이저)도 괜찮습니다</td></tr>.<tr><td>Map2</td><td>Synaptic Systems</td><td>No.</td><td>188004 1:1000</td></tr><tr><td>Maxisafe 2030i</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stemcell Technology</td><td>85850</td><td>iPSC 중간</td></tr><tr><td>멀티퓨지 X3R 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>10325804</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza</td><td># LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>일회용 바늘 (23G x 1" TW)</td><td>Neoject</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Oligomycin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td>슬라이드에 소수성 장벽을 그립니다.</td></tr><tr><td>Papain 해리 시스템 키트</td><td>Worthington</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>PBS에서 4%, 저장 용액 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 7mL</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>3mL까지 졸업</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&nbsp; &infin;/0.17 WD 1.0</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>건식 현미경 대물렌즈</td></tr><tr><td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &infin;/0.17 WD 0.13</td><td>Nikon 현미경 솔루션</td><td></td><td>오일 이멀젼 현미경 대물렌즈</td></tr><tr><td>폴리스티렌 페트리 접시 (100mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664161</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 라운드 바닥 튜브와 셀 스트레이너 캡 (5mL)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Glass Antifade Moutant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>정성 여과지</td><td>VWR</td><td>516-0813</td><td></td></tr><tr><td>락 억제제</td><td>Merck</td><td>SCM075</td><td></td></tr><tr><td>로테논</td><td>시그마</td><td>83-794</td><td></td></tr><tr><td>S100&beta;</td><td>Abcam</td><td>Ab11178</td><td>1:600</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Heinz Herenz Hamburq</td><td>1110918</td><td></td></tr><tr><td>SMI312</td><td>Biolegend</td><td>837904</td><td>1:500</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Merck/Sigma</td><td>31437-1kg-M</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 인산이 수소</td><td>Applichem</td><td>131965</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>SOX2</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-17320</td><td>1 : 100</td></tr><tr><td>StemPro Accutase 세포 해리 시약</td><td>Gibco / StemPro</td><td>A1110501</td><td>시약</td></tr><tr><td>A 슈퍼 접착제 젤</td><td>UHU</td><td>63261</td><td>접착 젤</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>일회용 주사기(1mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td></td></tr><tr><td>TB2 Thermoblock</td><td>Biometra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 24 Well</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 6 Well</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta3</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-007</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 후드</td><td>ThermoFisher</td><td>51032711</td><td></td></tr><tr><td>TOM20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-11415</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Merck</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>생산 종료, 다른 조정 가능한 마이크로톰도 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td><td>Wilkinson Sword</td><td>70517470</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Benchkote</td><td>Merck/Sigma</td><td>28418852</td><td></td></tr><tr><td>Wnt Antagonist I</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>3378738</td><td></td></tr><tr><td>XF 96 세포외 플럭스 분석기</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100737-101</td><td></td></tr><tr><td>XF Assay DMEM Medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103680-100</td><td></td></tr><tr><td>XF Calibrant Solution</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak (96-well microplate)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr></tbody></table>

미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

미토콘드리아 질환은 신진 대사의 태아 오류의 가장 큰 클래스를 나타내며 현재 불치입니다. 이 질병은 그 근본적인 기계장치가 해명될 남아 있는 신경 발달 결함을 일으키는 원인이 됩니다. 주요 장애물은 환자에서 볼 수있는 초기 발병 신경 장애를 재구성 하는 효과적인 모델의 부족. 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)의 기술의 발전은 신경계의 발달 및 조직에 대한 질병의 영향을 조사하는 데 사용될 수 있는 3차원(3D) 뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다. 연구원은, 이 저자를 포함하여, 최근에 미토콘드리아 무질서를 모형하기 위하여 인간 적인 두뇌 오르가노이드를 소개했습니다. 이 논문은 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드의 견고한 생성과 미토콘드리아 생물 학적 프로파일링 및 이미징 분석에서의 사용에 대한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 실험은 신진 대사 및 발달 기능 장애를 조사하기 위하여 두뇌 organoids의 사용을 허용할 것입니다 미토콘드리아 질병의 신경 병리를 해부하기 위하여 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 둥근 오르가노이드의 견고한 생성을 용이하게 한다 (그림 1A). 생성된 오르가노이드는 축산(SMI312) 및 원원수(microtubule-관련 단백질 2(MAP2)에 특이적인 단백질 마커를 사용하여 시각화될 수 있는 성숙한 뉴런 (도 1B)을 함유하고 있다. 성숙한 오르가노이드는 뉴런 세포(MAP2 양성) 뿐만 아니라 신경세포(예를 들어, 성상세포 마커 S100칼슘 결합 단백질 B(S100ß)에 대한 양성) 을 함유하고 있다(도 1B).
공초점 현미경을 사용하여 슬라이스 된 뇌 오르가노이드를 분석함으로써, 상이한 세포 유형 및 세포 구조의 상세한 분포 및 조직을 식별하고 모니터...

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

이 프로토콜은 미토콘드리아 질환을 연구하기 위해 뇌 오르가노이드를 사용하는 것을 목표로합니다. 그것은 그들의 미토콘드리아 속성의 평가에 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하기 위해 개발되었다. 이 방법은 고가의 생물 반응기와 시간이 많이 소요되는 포함 절차를 필요로하지 않습니다.따라서 구현하기 쉽고 고급스입니다. 이 프로토콜은 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하고 미토콘드리아 특성을 테스트 할 수 있게합니다. 이것은 치료할 수 없는 미토콘드리아 질병을 위한 내정간섭 표적의 확인으로 이끌어 낼 수 있습니다.우선, 코팅된 6웰 플레이트의 iPSC 배지에서 피더가 없는 조건에서 인간 iPSC를 배양하고 가습화된 조직 배양 배양인인 배양기를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지한다. iPSC를 효소 없는 분리 배지를 사용하여 80%의 결합으로 통과하여 1대 4에서 12까지 의 비율로 측정합니다. 세포 생존을 증가시키기 위하여는, 각 분할 후에 10 개의 micromolar rho 관련 단백질 키나아제 또는 ROCK 억제제를 추가합니다.0일차면 80%의 iPSC를 분리합니다. 피질 분화 매체 1 또는 CDM1을 준비하고 세포에 추가하기 전에 실온에서 미리 데워보도록 하십시오. 죽은 세포와 파편을 제거하기 위해 PBS와 iPSC를 포함하는 우물을 세척합니다.500 마이크로리터의 미리 따뜻해지는 시약 A를 각 웰에 넣고 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 현미경으로 확인하여 세포 분리를 보장하십시오. iPSC 배지 1밀리리터를 추가하여 시약 A를 희석하여 활동을 중화시합니다.1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 세포를 위아래로 배관하여 세포를 해리하고 셀 서스펜션을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. iPSCs를 실온에서 5분 동안 125회 G로 부드럽게 원심분리한 다음, 셀 펠릿을 방해하지 않도록 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다. 단일 셀 현탁액을 얻고 세포 수를 계산하기 위해 CDM1의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 중단합니다.CDM1내 100마이크로리터당 9, 000iPSC, 마이크로몰러 WNT 카테닌 억제제 또는 IWR-1 3개, 마이크로몰러 SB-431542로 파종 배지를 준비한다. 잘 100 마이크로리터의 파종 매체를 96웰 V 하단 플레이트에 추가합니다. 플레이트를 가습 조직 배양 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지하십시오.신경구를 생성하기 위하여는, 첫날에, 정의된 매끄러운 테두리

generation-of-human-brain-organoids-for-mitochondrial-disease-modeling

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 유도 만능 줄기 세포에서 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 신경권이 어떻게 다른 세균층의 형성을 억제하는 신경외배엽층을 형성하는지 보여줍니다. 신경구는 3D 젤 매트릭스에 내장되어 신경 상피 새싹을 형성합니다. 오가노이드 배지로 배양하면 이러한 신경 상피 새싹은 특정 뇌 영역으로 분화되어 성숙한 뇌 오가노이드를 형성합니다.

인간 뇌 오가노이드를 생성하는 체외 방법

신경 상피 조직의 전례 없는 복잡성으로 인해 인간의 뇌 발달을 모델링하는 데 방해를 받았습니다. 여기에서는 인간 뇌 발달의 초기 사건을 묘사하고 체외에서 소두증을 모델링하기 위해 뇌 오가노이드의 강력한 생성 방법을 설명합니다.

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 연구는 1) 인간 에서독점적으로 인간 신경 유기 체 내 인간 교모세포종 개발 및 2) 뉴런 도파민성 연구를 위한 관련 및 정확한 모델로 두 개의 특정 인간 신경 오르가노이드를 도출하는 프로토콜을 소개하고 기술합니다. 3차원 오르가노이드를 생성하는 분화.

뇌암과 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 인간의 신경 오르가노이드

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

이 연구에서, 우리는 표준 피더가없는 hPSC 배양물을 사용하여 간단하면서도 견고한 피질 오가노이드 배양 시스템에 대한 상세한 기술을 제공합니다. 이것은 시험관 내에서 뇌 노화의 측면을 모델링하는 오가노이드를 생성하기위한 신속하고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜입니다.

체외에서 뇌 신경 노화를 모델링하기위한 피질 뇌 오가노이드의 강력하고 재현 가능한 생성

영장류 대뇌 오가노이드의 전기천공법은 영장류(병리)생리학적 신피질 발달에 가까운 모델 시스템에서 다양한 전구체 유형과 뉴런에 일시적인 유전자 변형을 도입하는 정확하고 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 이를 통해 신경 발달 및 진화 과정을 연구 할 수 있으며 질병 모델링에도 적용 할 수 있습니다.

유전자 변형을 위한 영장류 대뇌 오가노이드의 표적 미세주입 및 전기천공

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

뇌 오가노이드는 미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드(MELAS) 연구를 위한 귀중한 모델 역할을 하며 근본적인 병태생리학에 대한 통찰력을 제공하고 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공합니다. 질병 유발 유전자의 다양한 수준의 이형질을 가진 세포주에서 유래한 오가노이드는 상당한 표현형 차이를 나타냅니다.

뇌 오가노이드를 사용한 미토콘드리아 질환 모델링: 미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드에 초점

이 프로토콜 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.

미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

배우세요 인간 iPSC 유래 뇌 오르가노이드 생성 프로토콜을 활용한 미토콘드리아 질환 모델링 방법입니다. 비용이 많이 드는 바이오리액터 없이도 미토콘드리아 생체에너지학적 특성을 평가할 수 있습니다.

미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

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