간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

3D 종양 스페로이드는 체외암 연구를 위한 금본위제로 기존의 2D 단층 기술을 대체하였다. 이러한 모델은 종양 미세 환경의 이질성을 반영하고 공간 상호 작용의 착취를 허용하는 다중 세포 유형의 공동 배양을 허용합니다. 3D 스페로이드를 생성하는 행염물 방법을 사용하는 장점은 세포-플라스틱 상호작용의 부족과 종양 세포와 비종양 세포 간의 상호작용을 연구하는 용이성이다.

이 기술은 또한 종양-기질 상호 작용을 모델링하는 재현가능하고 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 3D 종양은 귀중한 전임상 모델이며 종종 약물 선별 도구로 사용됩니다. 이 방법은 종양 성장과 주변 미세 환경에 대한 다중 화합물의 약리학적 효과를 연구하기 위해 적용 될 수있다.

스페로이드 형성 과정은 사용자 친화적이며 기존의 세포 배양 실험실 장비가 필요합니다. 스페로이드는 벤치 탑 반전 광 현미경을 사용하여 이미지화될 수 있으며, 스페로이드 크기 및 형상의 분석은 널리 이용 가능한 온라인 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 시작하려면, 액체 질소에 있는 그들의 저장 랙에서 Huh7 및 Hep3B HCC HCC 종양 세포주 및 COS-7 및 LX2 섬유아세포 세포주를 제거하고 급속하게 해동합니다.

해동 후, 신선한 배양 배지의 두 밀리리터로 해동 된 세포를 희석. 세포를 원심분리합니다. 상체를 버리고 신선한 따뜻한 배양 배지의 1 밀리리터에 세포 펠릿을 다시 놓습니다.

그런 다음 T75 세포 배양소에서 세포를 씨앗과 세포가 60 ~70&인플루엔자에 도달할 때까지 세포 배양 인큐베이터에서 배양합니다. 세포 수집의 경우 배양 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 플라스크 바닥에서 부착 된 세포를 분리하려면 미리 따뜻해지는 트립신 2 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 배양하십시오.

4분 후, 완전한 배양 배지의 4밀리리터를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 세포 현탁액을 수집한 다음 세포를 원심분리하고 상체를 폐기한 후 신선한 배양 배지의 1밀리리터로 세포를 다시 분리한다. 마지막으로, 신선한 배양 매체의 3 밀리리터를 추가합니다. 세포를 계산하려면 셀 서스펜션을 부드럽게 소용돌이시다.

그런 다음 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션의 마이크로리터 10마이크로리터를 트라이판 블루 10 마이크로리터와 혼합하고 혼합물을 4번 위아래로 부드럽게 피펫하여 염료로 외부 셀 표면의 완전한 염색을 보장합니다. 다음으로, 혈종계 계수 영역에 덮개 슬립을 놓습니다. 그런 다음 커버슬립 의 가장자리 옆에 셀 혼합물이 들어있는 파이펫 팁을 놓고 팁 함량을 계산 슬라이드로 부드럽게 추방합니다.

슬러리가 정착할 때까지 몇 분 동안 기다린 후 현미경 스테이지의 혈류계를 수정하고 아래또는 왼쪽 판결이 겹치는 것을 피하면서 위또는 오른쪽 판결을 겹치는 세포를 계산합니다. 마지막으로 이 수식을 사용하여 총 셀 수를 계산합니다. 배양 배지를 흡입한 후 PBS로 LX2 세포를 세 번 세척합니다.

이전에 입증 된 바와 같이 트립신을 사용하여 세포를 분리하고 원심 분리. 이전에 입증 된 바와 같이 세포를 계산 한 후, 10 입방 센티미터 접시에 여섯 번째 LX2 세포에 10 번 씨앗과 37 섭씨에서 배양. 48 시간 후에 섬유 아세포 조절 된 배지 및 원심 분리기를 수집하여 부동 세포를 펠릿하십시오.

필터는 20 밀리리터 주사기에 부착된 0.22 미크론 필터를 사용하여 조건부 배지를 살균합니다. 그런 다음 미디어를 영하 80도의 저장을 위해 두 밀리리터 튜브로 알리쿼트합니다. 10 입방 센티미터 접시의 바닥에 멸균 PBS의 10 밀리리터를 추가하여 스페로이드에 습한 조건을 제공합니다.

그런 다음 1, 500 HuH7 HCC 세포를 1, 500 COS-7 포유류 섬유아세포 세포를 매달려 있는 물방울에서 구체를 형성한다. 세포 현탁액을 포함한 미디어가 습한 환경에 걸려 있게 하려면 접시 뚜껑을 반전시키면 됩니다. 3 일 후, 스페로이드의 이미지를 가지고, 반전 현미경의 무대에 접시를 넣어 다섯 배로 배율을 조정.

다음으로 연결된 컴퓨터에서 현미경 소프트웨어를 열고 모든 스페로이드의 선명한 이미지를 갖도록 초점을 조정합니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어의 스냅 도구를 사용하여 이미지를 획득하고 획득 한 사진을 저장합니다. 멸균 PBS 10 밀리리터를 10입방센티미터 접시 바닥에 넣습니다.

그런 다음 3, 000 Hep3B HCC 세포를 매달려 있는 물방울에서 구체를 형성하고 접시뚜껑을 반전시켜 3일 동안 습한 환경에 물방울이 걸려 있게 한다. 다음으로, Hp3B 스페로이드를 LX2 세포에서 신선한 상태 미디어의 20 마이크로리터로 전달하여 물방울을 매달아 놓습니다. 그런 다음 스페로이드가 형성되는 접시의 뚜껑을 반전시키고 가벼운 현미경의 단계에서 뚜껑을 고정하십시오.

현미경의 미세 한 초점을 조정 하여 이전에 설명 된 대로 각 스페로이드를 볼 수 있도록. 플런저 버튼을 눌러 마이크로피펫에서 공기를 조심스럽게 비우고, 스페로이드가 들어 있는 액적에 파이펫 팁을 삽입한다. 팁으로 건드리지 않고 스페로이드에 매우 가까이 가십시오.

다음으로, 플런저 버튼의 압력을 부드럽게 방출하여 스페로이드를 마이크로피펫 팁으로 흡입하여 두 개의 마이크로리터의 매체를 허용합니다. 그런 다음 새로운 10 입방 센티미터 접시에 매달려 새로운 물방울로 스페로이드를 전송합니다. LX2 컨디셔닝 된 미디어에서 문화의 7 일까지 전송 일로부터 반전 된 현미경을 사용하여 5 배율로 스페로이드의 이미지를 가져 가라.

성장하는 스페로이드의 이미지를 분석하려면 이미지 분석 소프트웨어에서 각 스페로이드 이미지를 열고 프리핸드 선택 도구를 사용하여 각 스페로이드를 간략하게 설명합니다. 그런 다음 분석 드롭다운 버튼에서 설정 된 측정을 선택하고 영역을 선택하고 확인을 누릅니다. 다음으로, 수동으로 각 스페로이드 주위에 원을 그리고 구가 동그라미를 하면 제어 M을 눌러 프로그램이 픽셀로 스페로이드 영역을 계산할 수 있도록 합니다. 그런 다음 이 수식을 사용하여 스페로이드 영역을 볼륨으로 변환합니다.

마지막으로 이미지 캡처 첫날의 볼륨에 비해 스페로이드 볼륨의 변화를 계산합니다. 스페로이드 형성을 위한 세포 밀도를 최적화하는 동안, 12, 000 및 6, 000 세포의 높은 파종 밀도는 비대칭 모양으로 스페로이드를 산출하고, 3, 000 세포의 파종 밀도는 완벽한 둥근 3D 스페로이드를 주었다. 따라서, 3, 000 세포 밀도 스페로이드는 추가 실험을 위해 적응되었다.

종양과 섬유아세포 세포주 공동 배양으로 인한 증식 적 영향에 대한 경도 평가는 4일째부터 이성화 구형이 동종피 구형에 비해 이상적인 둥근 모양으로 성장한 것으로 나타났습니다. 이종경 구형은 처음에 4일째부터 7일째까지 급속한 성장단계를 보였고, 8일째에는 더 느린 위상을 보였다. 그 때 구체성 부피는 그 때 9일과 10일에 감소했습니다, 가능하게 양분 또는 저산소 심및 세포 사멸의 고갈을 반영합니다.

반면, 동종구 스페로이드는 5일째까지 비교적 정적 성장 곡선을 보였고, 그 뒤를 이어 6일째부터 성장 곡선이 점진적으로 증가했습니다. 이종경 스페로이드의 높은 성장 속도는 종양과 섬유아세포 사이의 직접적인 접촉이 종양 스페로이드의 크기를 증가시킨다는 것을 시사한다. 3일 된 동종포 형 Hep3B 스페로이드가 신선한 매체에서 재배되었을 때, 세포는 3 일 후에 완벽하게 둥근 스페로이드를 형성하고 7 일까지 계속 증식을 보였다.

Spheroids가 LX2 조건부 매체에서 유지될 때 성장 속도는 향상되었습니다, 종양 스페로이드의 섬유아세포 구동 증식을 건의하. 멸균 BBS가 스페로이드 형성에 적합한 습한 상태를 유지하기 위해 접시의 바닥에 첨가되도록하는 것이 중요합니다. 또한 뚜껑을 반전시키면서 스페로이드와 물방울이 중단되지 않도록 주의하십시오.

3D 종양 스페로이드는 면역화학 또는 면역형광과 같은 향후 응용 분야뿐만 아니라 전사 분석을 위한 RNA 추출을 위해 고정 또는 냉동 및 저장될 수 있다. 미리 표지된 세포를 가진 이종경 구체는 종양 마이크로 환경 내의 세포 세포 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하기 위하여 심화되고 추적될 수 있습니다.