Name: 간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 배우세요 3D 스페로이드 모델을 활용한 간세포 암에서 종양-기질 상호 작용 연구 방법입니다. 매달린 액적법으로 다세포 공배양을 구현하여 종양 미세환경의 이형성을 재현하고 약물 스크리닝에 활용할 수 있습니다.

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MYWZ는 영국의 공식 개발 지원 "ODA"와 뉴턴 기금의 일환으로 2020 년 비즈니스, 에너지 및 산업 전략 국무장관과 뉴턴 상에 의해 투자됩니다. SS는 암 연구 UK 고급 임상과학자 펠로우십 C53575/A29959에 의해 지원됩니다. SS, FO 및 HR은 헌터의 일환으로 자금을 지원, 암 연구 영국, 폰다지오네 AIRC, 펀다시온 Cientifica 드 라 아소시아시온 콘트라 엘 암 사이의 파트너십을 통해 자금.

1. 셀 준비
<ol><li>클래스 II 라미나르 흐름 미생물 안전 캐비닛에서 멸균 조건하에서 모든 실험을 수행 (재료의 표 참조).<ol>
<li>후드를 켜고 공기 흐름의 안정화를 허용합니다.</li>
		<li>이전 사용자의 가능한 오염을 제거하기 위해 70 % 에탄올로 내부 후드 표면을 철저히 분사하십시오.</li>
		<li>500mL 유리 비커에 소독제 용액의 5%를 준비합니다. 용액 내부에 셀 상수 또는 셀 이물질을 버리십시오.</li>
		<li>70%의 에탄올로 모든 마이크로피펫과 팁 박스를 철저히 청소하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM) 고혈당 매체를 10% 열 비활성화 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린/연쇄절제술(페니실린 100단위/mL), 100μg/mL의 성렙토미신 및 LM-mL로 보충하여 신선한 세포 배양 매체를 준비하십시오. LX2 간 염기 세포주의 경우 FBS 보충제의 농도를 2%로 줄입니다.</li>
	<li>실험을 시작하기 전에 따뜻한 문화 매체.</li>
	<li>Huh7 및 Hep3B HCC 종양 세포주 및 COS7 및 LX2 섬유아세포 세포주를 액체 질소의 저장 랙에서 가져 가라. 냉동 보존 된 세포를 급속히 해동합니다.</li>
	<li>신선한 배양 배지의 2mL로 해동 된 세포를 희석. 원심 분리기 세포는 실온에서 4 분 동안 200 x g 에서. 상체를 버리고 신선한 따뜻한 문화 매체의 1 mL에서 셀 펠릿을 다시 중단하십시오.</li>
	<li>T75 세포 배양플라스크의 종자 세포. 세포 배양인큐베이터에서 세포배양비배기에서 세포를 37°C에서 37°C에서 95% 가습된 조건에서 세포가 60%-70%의 합류에 도달할 때까지 배양한다.</li>
</ol>2. 셀 컬렉션
<ol><li>인산염 완충식염(PBS)으로 세포를 세 번 흡인배양 배지 및 세척한다.</li>
	<li>T75 플라스크의 바닥에서 부착 셀을 분리하기 위해 미리 따뜻워진 1x 트립신 2mL을 추가합니다. 인큐베이터에서 37°C에서 4분 동안 배양합니다.</li>
	<li>완전한 문화 매체의 4mL를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 실온에서 4 분 동안 200 x g 에서 세포 현탁액 및 원심 분리기 세포를 수집합니다. 상체를 버리고 4 mL 신선한 배양 배지에서 세포를 다시 중단하십시오.</li>
</ol>3. 셀 카운트
<ol><li>원심분리기 관에 있는 세포의 균질한 분포를 지키기 위하여 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이.</li>
	<li>10 μL 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션 10 μL을 Trypan blue 10 μL과 혼합합니다. 혼합물을 4번 위아래로 부드럽게 피펫하여 염료로 외부 셀 표면의 완전한 염색을 보장합니다.</li>
	<li>혈종계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.<ol>
<li>먼저, 스테인드 셀 서스펜션을 적재하기 전에 혈류계 계수 영역에 커버슬립을 놓습니다.</li>
		<li>세포 현탁액이 포함된 파이펫 팁을 혈종계의 V 홈에 넣습니다. 팁 콘텐츠를 계산 슬라이드로 부드럽게 추방합니다.</li>
		<li>슬러리를 두어 세포 계수의 현미경 단계에서 고정하기 전에 몇 분 동안 정착하십시오. 참고: 이중 계수를 방지하려면 큰 사각형의 양쪽에 있는 셀만 계산합니다.</li>
		<li>상단 또는 오른쪽 판결이 겹치는 셀에서 계산하고 아래쪽 또는 왼쪽 판결이 겹치는 것을 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>총 셀 수를 계산합니다. 참고: ml당 셀 번호 = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. 섬유아세포 조절 매체(CM) 컬렉션
<ol><li>배양 배지를 흡인하고 PBS로 LX2 세포를 세 번 세척합니다.</li>
	<li>T75 플라스크의 바닥에서 부착 셀을 분리하기 위해 미리 따뜻워진 1x 트립신 2mL을 추가합니다. 인큐베이터에서 플라스크를 37°C에서 4분 동안 배양합니다.</li>
	<li>완전한 문화 매체의 4mL를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 실온에서 4 분 동안 200 x g 에서 세포 현탁액 및 원심 분리기 세포를 수집합니다. 3단계별로 셀을 계산합니다.</li>
	<li>종자 1 x 106 LX2 셀에 10cm3 요리에 48 h 에서 37 °C.</li>
	<li>48 h 후 섬유 세포 CM을 수집합니다. 실온에서 4분 동안 200 x g 의 원심분리기는 부동 세포를 펠릿합니다. 멸균 필터는 20mL 주사기의 바닥에 고정 된 0.22 μm 필터를 사용하여 CM을 필터링합니다.</li>
	<li>상체 CM을 수집합니다. AliquotCM을 2mL 튜브로 수집하고 추가 적용을 위해 -80 °C에 저장하십시오. 참고: 용액은 -80°C에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 완벽한 스페로이드를 위한 세포 밀도 검증
<ol><li>배양 배지를 흡인하고 PBS로 HCC 세포주를 세 번 세척합니다.</li>
	<li>T75 플라스크의 바닥에서 부착 셀을 분리하기 위해 미리 따뜻워진 1x 트립신 2mL을 추가합니다. 인큐베이터에서 37°C에서 4분 동안 배양합니다.</li>
	<li>완전한 문화 매체의 4mL를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 실온에서 4 분 동안 200 x g 에서 세포 현탁액 및 원심 분리기 세포를 수집합니다.</li>
	<li>3단계별로 셀을 계산합니다.</li>
	<li>피펫은 페트리 접시의 10cm3 뚜껑의 내부 표면에 있는 20μL에서 종양 세포주(12000, 6000, 3000, 1500, 1500, 1000, 750, 500, 250 및 125 세포)로부터 의 다른 밀도.</li>
	<li>접시 바닥에 멸균 PBS 10mL를 추가하여 스페로이드 형성 과정을 위한 습한 조건을 제공합니다.</li>
	<li>10cm3 접시의 뚜껑을 반전하여 세포 현탁액을 포함한 미디어가 습한 환경에 걸려 있게 합니다. 매달려 있는 물방울을 3일 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>원래 물방울을 매달아 3 일 후 반전 현미경을 사용하여 50 배율에서 스페로이드의 이미지를 가져 가라.</li>
</ol>6. 이종경 종양/기질 스페로이드
<ol><li>1500 개의 Huh7 HCC 세포를 1500 COS7 포유류 섬유아 세포 (1:1 비율)로 중단하여 구체를 형성하기 위해 매달려 있는 물방울에 있습니다. 접시 바닥에 멸균 PBS 10mL를 추가하여 스페로이드에 습한 조건을 제공합니다.</li>
	<li>10cm3 접시의 뚜껑을 반전하여 세포 현탁액을 포함한 미디어가 습한 환경에 걸려 있게 합니다. 매달려 있는 물방울을 3일 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>3일째부터 10일째까지 반전된 현미경을 사용하여 스페로이드의 이미지를 찍습니다.<ol>
<li>현미경 단계에 10cm3 접시를 넣습니다. 모든 스페로이드에 대해 현미경의 배율을 50배로 조정합니다.</li>
		<li>연결된 컴퓨터에서 현미경 소프트웨어를 열고 모든 스페로이드의 선명한 이미지를 갖도록 초점을 조정합니다. 현미경 소프트웨어의 캡처 도구를 사용하여 획득 된 사진을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. LX2 CM의 호모티픽 헵3B 스페로이드
<ol><li>구체를 형성하기 위해 매달려 있는 물방울에서 3000 Hep3B HCC 세포를 일시 중단합니다. 접시 바닥에 멸균 PBS 10mL를 추가하여 스페로이드에 습한 조건을 제공합니다.</li>
	<li>10cm3 접시의 뚜껑을 반전하여 세포 현탁액을 포함한 미디어가 습한 환경에 걸려 있게 합니다. 매달려 있는 물방울을 3일 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>Hep3B 스페로이드를 LX2 세포에서 신선한 CM의 20 μL로 전달하여 물방울을 매달아 놓습니다. 참고: 분리형 이송 과정에서 멸균 오토클레이브 되지 않은 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 형성된 스페로이드에 대한 중단이나 부상을 방지하십시오. 이것은 또한 주요 단일 스페로이드에 연결되지 않은 상태로 남아있는 잔류 세포를 제거하기위한 것입니다.<ol>
<li>전송 프로세스에 자동 20 μL 파이펫을 사용합니다. 파이펫 볼륨을 2μL로 조정합니다. 파이펫 끝을 파이펫에 부착합니다.</li>
		<li>스페로이드가 형성된 10cm3 접시의 뚜껑을 반전시다. 가벼운 현미경의 단계에서 뚜껑을 고정합니다. 현미경의 미세 한 초점을 조정 하여 각 스페로이드를 볼 수 있도록 합니다.</li>
		<li>플런저 버튼을 눌러 마이크로 파이프에서 공기를 조심스럽게 비웁웁트. 스페로이드를 포함한 액적에 파이펫 팁을 삽입하여 전달합니다. 팁으로 건드리지 않고 스페로이드에 매우 가까이 가십시오.</li>
		<li>플런저 버튼의 압력을 부드럽게 풀어 2 μL 미디어에서 스페로이드를 마이크로피펫 팁으로 흡입할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>새로운 미디어/컨디셔닝 된 미디어 / 치료를 갖는 새로운 10cm3 접시에 매달려새로운 물방울로 스페로이드를 전송합니다. 참고: 모든 스페로이드가 가벼운 현미경을 사용하여 새로운 10cm3 접시로 성공적으로 전달되는지 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LX2 CM에서 배양의 7일째까지 전송일(3일)부터 반전된 현미경을 사용하여 50배배율로 스페로이드의 이미지를 찍습니다.</li>
</ol>8. 스페로이드 볼륨 계산
<ol><li>일치하는 스페로이드의 이미지를 매일 캡처할 수 있도록 각 스페로이드에 고유한 숫자 식별자를 할당합니다.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 성장하는 스페로이드의 이미지를 분석합니다.<ol>
<li>소프트웨어 패키지 내에서 각 스페로이드 이미지를 엽니다. 프리핸드 선택 도구를 사용하여 각 스페로이드를 간략하게 설명합니다. 분석 드롭다운 버튼에서 측정 설정 및 영역을 선택합니다. 확인을 누릅니다.</li>
		<li>각 스페로이드 주위에 원을 수동으로 그립니다. 구가 동그라미를 치면 Ctrl + M 을 눌러 프로그램이 픽셀에서 스페로이드 영역을 계산할 수 있도록 합니다. 스페로이드 영역을 체적으로 변환합니다. 참고: 스페로이드mm3 =0.09403 × <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>이미지 캡처 첫날의 볼륨에 비해 스페로이드 볼륨의 변화를 계산합니다. 참고: 이는 스페로이드 볼륨을 시동 볼륨으로 정상화하고 시작 크기의 자연적인 변화를 감안할 때 정확도를 향상시키는 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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FO는 Fibrofind 제한의 이사 및 주주입니다.

실험적인 세포주가 증가하는 맥락은 그들의 유전자 발현 단면도, 통로 분석 및 기능기준에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 유방암 세포에서, 다른 종양 유발 경로 사이의 협착은 암세포가 3D conformation27에서 성장하는 경우에만 유지된다. 3D 흑색종 및 유방암 스페로이드에서 조절유전자는 단층 세포에서는 아니지만, 생체 내 인간 종양28,29와 더 관련이 있다. 예를 들어, 유방 상피 세포 및 종양 대응에서 β1 내테그린 수준은 2D format29에서 자라난 수준보다 낮았다. 더욱이, 3D 구조물에 있는 섬유아세포는 plastic30에 배양된 것과 비교된 형태학 및 속도의 관점에서 명백하게 이동하는 경향이 있습니다. 또한, 성장 기판의 기계적 강성은 상피 세포에서 세포외 신호 조절 키나아제(ERK)/로의 조절을 완화하여 정상 상피 세포의 악성 변환을 장려하는 특정 경로를 활성화한다31. 이러한 요인은 3D 배양이 인간 질병에 더 많이 부합하기 때문에 기존의 2D 배양에서 3D 스페로이드 모델로의 전환을 선호합니다.
현재 연구는 3D 종양 스페로이드 모델을 생산하기 위해 기존의 실험실 도구와 공급을 사용했다. 형성 된 스페로이드는 섬유 아세포에서 나오는 확산 신호에 반응, 그들의 크게 증가 성장에 의해 표시. 이 모델은 다세포 종양 스페로이드 범주에 속한다. 3D 종양 스페로이드의 세 가지 다른 범주가 있다, 종양을 포함 하 여 32, 조직 유래 종양 spheres33,34, 그리고 organotypic 다세포 spheroids35. 다세포 종양 스페로이드에서 종양 세포는 배양 용기의 바닥을 만지지 않고 구체를 형성하기 위해 함께 집계할 수 있도록 낮은 접착 조건에서 일시 중단됩니다(36). 회전 시스템, 액체 오버레이 기술 및 코팅되지 않은 초저 부착 U 자형 플레이트37에 이르기까지 이 앵커리지 독립적 인 기술을 제공하기 위해 몇 가지 접근 법이 사용되었습니다. HCC에서, 대부분의 시험관 내 스페로이드 배양은 초저 부착 24- 또는 96웰 플레이트를 사용하여 둥근 스페로이드18,19,20,21,22를 형성한다. 그러나 이 기술은 비용 효율적이지 않으며 우발적인 세포 플라스틱 접촉을 배제하지 않습니다. 다른 시스템은 간 미세 조직을 생산하기 위해 트랜스 웰스23 또는 간 슬라이스12를 사용합니다. 번역 작업에 인간의 조직을 사용 하 여 금 표준 하지만 항상 사용할 수 또는 많은 연구 그룹에 의해 액세스할 수. 현재접근법은 매달려 있는 물방울 이론의 혜택을 받았다. 세포 현탁액은 종양 스페로이드가 접근 가능한 액체 공기 인터페이스에서 형성되도록 첨가되어 단일 둥근 구체38을 형성한다. 이 기술을 사용하는 장점은 세포 플라스틱 접촉의 부족과 종양과 섬유 아세포 세포 사이의 자동 크림과 파라크린 크로스토크를 연구하는 용이성입니다. 이 모델은 HCC 개발39로부터 간을 보호하는 비 구레나키말 TREM2의 중요성을 해독하는 또 다른 연구에서 더 검증되었다39. 이 작품은 Hep3B와 PLC/PRF5 스페로이드의 부피가 Wnt 의존식 방식으로 TREM2 과발형 LX2 CM에 비해 제어 LX2 CM에서 더 높았다는 것을 보여주었습니다39.
현재 연구에서, 섬유 아 세포는 이 공동 배양의 증식 충격을 조사하기 위하여 스페로이드 대형 의 앞에 종양 세포와 혼합되었습니다. 그 외는 종양으로 기질 세포 이주를 연구하기 위하여 종양 스페로이드를 형성한 후에 종양 세포 현탁액을 가진 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포를 추가했습니다40,41. 현재 이종경 스페로이드 모델은 이전에 보고된 모델과 생체 내 종양의 본래와 유사한 성장 패턴을 보였다. 스페로이드는 영양분고및 괴사 코어42의 확대로 인해 성장 단계가 지연된 후 기하급수적인 성장을 보여줍니다. 스페로이드 형성을 돕기 위해 성장 인자와 미토겐을 추가하는 대신, 이 연구는 섬유아세포와 직접 접촉하거나 섬유아세포 CM에 있는 그들의 분비에서 이 성장 요인을 함으로써 더 생리적인 접근을 이용했습니다. LX2 세포가 TGFβ1 또는 PDGF43로 치료함으로써 더 활성화될 수 있다는 점을 언급하는 것이 필수적입니다. LX2 세포는 상이한 실험 설정을 위한 매체를 제거하기 전에 48h에 대해 10 ng/mL TGFβ1로 처리되었다. LX2 세포는 PBS로 세 번 세척(어떤 직접 TGFβ1 효과를 배제하기 위해), 다음 CM을 수집하기 전에 또 다른 24h에 대한 신선한 미디어를 첨가하였다. TGFβ1-자극LX2로부터 수집된 CM은 제어 LX2로부터 CM보다 더 높은 속도로 Hep3B 스페로이드의 성장을 유도하였다(데이터는 도시되지 않음). 이 유연한 시스템은 다른 암 세포 플러스 /마이너스 섬유 아세포뿐만 아니라 환자 유래 라인의 공동 배양에 빌려 줄 수 있습니다. 또한 생체 내 연구에 대한 투약을 알리기 위해 번역 약물 발견 파이프라인에 신속하게 채택되고 삽입될 수 있는 약물에 대한 중간 처리량 검사 분석 방법을 제공할 수 있습니다.
현재 연구의 한계는 새로 분리 된 HCC 종양 세포 및 암 관련 섬유아세포보다는 스페로이드 형성에서 불멸의 세포주를 사용하는 것입니다. 또 다른 제한은 다른 비 섬유아세포 세포주에서 CM보다는 LX2에서 CM 사이 및 신선한 매체에서 종동 Hep3B 스페로이드의 성장을 비교하는 것입니다. 후자의 제한은 섬유아세포에 대한 관심 유전자의 유전자 변형에 의해 해결될 수 있으며, 이어서 야생형에서 유전자 조작된 섬유아세포에 동종포성 구형에 CM을 적용하여 해결할 수 있다.

간암에서 세계적인 부각 그리고 사망은 간 질병 및 암의 대부분의 그밖 모형에 대한 처리에 있는 어드밴스에 있는 어드밴스에 도 불구하고, 증가하는 것을 계속했습니다. 2018년, 간암은 대장암과 위암을 능가하여 전 세계적으로 암 관련 사망의 두 번째로 흔한 원인이 되었습니다1. 2020년에는 9,00,000건 이상의 새로운 진단이 있었으며, 전 세계 전체 암 사례의 4.7%를 차지했습니다1. 이것은 특히 실망스럽습니다, HCC의 발달을 위한 중요한 위험 요소가, 간암의 일반적인 양식, 잘 특징이다주어진 2. 간경변은 HCC 의 발달을 위한 일반적인 위험 요소입니다, 와 함께 80% 케이스의 확립된 간경변2의 배경에 개발. 간경변으로 진행되는 만성 간질환은 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 알코올 관련 간 질환(ARLD), 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) -비만 및 제2형 당뇨병(T2DM)2,3에 기인한다. HCC를 위한 현재 관리 프로토콜은 단계 의존적이고 가장 빈약한 결과가 있는 향상된 암을 가진 사람들을 위해 제한됩니다4. 키나아제 억제제를 사용하여 상당한 어드밴스가 있었고, 최근에는 면역 종양학 치료법이 현실적으로 진행성 간암 환자 중 소수에만 혜택을 주어 있습니다5. 더욱이, NAFLD 환자에서 발생하는 HCC가 가장 빠르게 성장하는 근본 원인인 서방 국가에서 새로 진단된 HCC 사례의 50% 이상을 차지하는 것으로, 프로그램된 사망 1(PD1) 체크포인트 억제제 치료에 더 저항할 수 있다는 우려가 있다.
임상 시험및 그들의 끝점에 있는 중요한 개선을 포함하여 HCC를 가진 환자를 위한 임상 시험에 있는 대규모 투자가 있었습니다7. 실패의 10 년 후에, 이 투자는 환자를 위한 기회를 바꾸기 시작했습니다. 그러나, 현실은 응답자의 전반적인 비율이 상대적으로 가난한 남아 있다는 것입니다, 환자가 임상 시험에 모집하는 것은 수시로 진료소에서 돌보는 사람들을 대표하는 수시로 가난하게. 위험은 진보가 비용이 많이 들고 많은 사람들이 아닌 소수의 사람들에게 이익이 된다는 것입니다. 단일 사용 또는 조합에 대한 더 많은 후보 치료가 등장함에 따라 전임상 모델이 생체 내 반응을 더 예측하는 것이 필수적입니다. 이들은 인간 HCC 이질성 및 병리학적 복잡성을 더 잘 반영하는 환자 반응에서 보인 가변성에 기여하는 추가 요인을 통합하는 모형일 확률이 높습니다8. HCC의 생체 내 병리학 적 조건을 재현하는 시스템은 종양 진화, 성장 및 진행의 생물학을 이해하는 데 도움이됩니다. 만성 간 질환과 HCC의 기존 실험 모델은 일반적으로 생체 내 동물 기반 모델(검토 된 in9), 체외 배양 10 및 ex vivo11,12 모델의 세 가지 주요 범주에 속합니다. 동물 기반 접근은 HCC를 포함하여 만성 간 질병을 공부하기 위하여 광범위하게 이용됩니다; 그러나, 유전적 가변성, 높은 운영 비용 및 종 간의 다른 면역 계통은 그러한 모델을 적용하기 위한 주요 한계 중 하나입니다9. 일부 ex vivo 모델은 다른 체외 세포주 모델에 비해 인간 조직에 초점을 맞추기위한 훌륭한 도구를 제공하지만, 조직 가용성 및 제한된 실험 시간 과정은 대규모로 활용을 방해합니다.
다른 한편으로는, 체외 세포주 모형은 새로운 인간 조직의 일정한 공급을 가질 필요가 적은으로, 제한된 자원으로 일하는 과학자를 위한 좋은 선택권 남아 있습니다10. 이러한 모델은 또한 생체 내 모델에서 더 복잡한 진행하기 전에 약물 선택의 표적 검증을 돕기 위해 첫 번째 화면으로 사용할 수있는 도구를 제공합니다. 최근 기존의 2D 단층 배양을 3D 배양으로 개조하여 이들 체외 모델의 효능을 향상시켰습니다13,14.
체외 모델내 3D는 인간의 정상 및 병리학 적 조건에서 볼 수있는 중요한 기능을 재구성 할 수 있습니다. 생리학적 조건하에서, 신호 전달은 세포 간 상호 작용 및 다른 결합 조직 분자, 즉 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질과의 상호 작용을 통해 시작되어 3D 상호 작용 네트워크를 형성합니다15,16. 종양은 악성 변환 도중 3D 구형 형태로 발전하며, 산소와 영양소는 비종양/종양 상호 단계에서 쉽게 풍부합니다. 동시에, 저산소 조건은 종양 코어에 우세합니다. 영양 가용성에 있는 이질성은 종양 발생을 통제하는 공간적으로 구별되는 신호 및 신진 대사 통로의 활성화귀착됩니다. 이러한 조건은 기존의 2D 단층 배양14에서 제대로 재구성되지 못하며, 이 배양소는 생리학적으로 무관한 방식으로 딱딱한 배양 플라스틱으로 자랍니다. 암세포는 또한 다른 비-빈약한 세포, ECM의 1차 공급원, 성장 및 종양 미세 환경 내의 침략 신호와 통신한다. 2D 배양과 달리, 체외 모델의 3D는 이 종양-기질 상호작용을 연구하기에 더 적합한 플랫폼을 제공할 수 있다17.
3D 모델은 HCC 분야에서 널리 사용되고 있으며, 마이크로 조직이 형성되는 방식이 다양18,19,20,21,22,23이다. 이러한 모델의 대부분은 스페로이드 형성 과정에서 초저결합 판18,19,20,21,22 또는 트랜스 웰23을 사용했다. 설명된 프로토콜은 체외 3D 종양 스페로이드 모델에서 플라스틱이 없고 비용 효율적인 대체물방울 기술을 소개합니다. 이것은 3D 형식으로 종양 세포의 증식에 섬유 아세포의 paracrine 및 autocrine 역할을 평가하는 것을 용이하게 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1x Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59429C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender.com</td><td>Online</td><td></td></tr><tr><td>Class II laminar flow BioMAT2 후드</td><td>Medair Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td><td>Biosera</td><td>M-D1107</td><td></td></tr><tr><td>Excel 소프트웨어</td><td>Microsoft Office 365</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad 프리즘 소프트웨어</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청 (FBS)</td><td>생명 기술</td><td>105000064</td><td></td></tr><tr><td>이미지 J 소프트웨어</td><td>피지</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G7513-100ml</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(100 unit/ml 페니실린 및 100 &mu; g/ml 스트렙토마이신)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100ml</td><td></td></tr><tr><td>페트리 디쉬 90mm, 트리플 벤티드</td><td>Greiner</td><td>633175</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Virkon&trade; 광범위한 소독제, 5kg 버킷</td><td>Rely+On&trade;</td><td>SCI-129999</td><td></td></tr><tr><td>Ziess 도립 현미경</td><td>Ziess</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

간암의 주된 형태인 고급 간세포 암(HCC)을 위한 잘 용인되고 널리 효과적인 치료법의 공격성과 부족은 암 관련 사망의 두 번째로 흔한 원인으로 그 순위를 합리화합니다. 전임상 모델은 임상 개발을 위한 최고의 치료 후보를 선택하고 개인화된 약의 전달을 돕기 위하여 인간 조건을 재구성하기 위하여 적응될 필요가 있습니다. 3차원(3D) 셀룰러 스페로이드 모델은 2차원(2D) 단층 배양에 대한 새로운 체외 대안으로서 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 개별 세포가 매달려 있는 물방울에서 유지될 때 집계하는 능력을 이용하고, 표준 단층층 보다는 생체 내 환경을 더 대표하는 3D 종양 스페로이드 모형을 기술합니다. 더욱이, 3D 스페로이드는 균질성 또는 이질성 세포를 결합하여 생성될 수 있고, 생체 내세포 이질성을 더 반사하여 잠재적으로 진행 및 치료 반응에 영향을 미칠 수 있는 환경 상호 작용의 연구를 가능하게 한다. 현재 연구는 표준 10cm3 페트리 접시의 뚜껑에 세포 현탁액을 고정하여 3D 동종 및 이성종양 스페로이드를 형성하기 위해 세포 밀도를 최적화했다. 종방향 분석은 이종성 종양/섬유아세포 스페로이드 대 동종경에 대한 성장 곡선을 생성하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 동종종양(Hep3B) 스페로이드에 대한 섬유아세포(COS7 세포) 및 간 심섬유세포(LX2)의 증식적 충격이 조사되었다. 3,000개의 세포(20μL 배지)의 파종 밀도는 성공적으로 Huh7/COS7 이종성 구형 구형을 산출하여 8일째까지 의 크기가 꾸준히 증가하고 성장 지체가 뒤따랐습니다. 이 발견은 LX2 (인간 간 질질 세포주) 조건된 매체 (CM)에서 배양된 Hep3B 균질 구체를 사용하여 확증되었다. LX2 CM은 대조종양 스페로이드에 비해 Hep3B 스페로이드의 증식을 촉발시켰다. 결론적으로, 이 프로토콜은 3D 종양 스페로이드가 종양-기질 상호 작용을 보다 포괄적으로 연구하기 위해 간단한, 경제적, 및 시험 관 내 도구로 사용될 수 있음을 보여주었습니다.

다층 3D 포맷으로 배양된 세포는 종래의 2D 배양24,25보다 종양 미세 환경의 복잡성을 보다 정확하게 반영한다. 이전에는 스페로이드 형성을 시작하기 위해 다양한 미토겐과 성장 인자를 가진 스페로이드 배양 매체를 보완했습니다. 그러나 이 연구에서는 섬유아세포 또는 CM을 첨가하면 스페로이드 성장을 가속화하기 위한 필수 미토겐및 성장 인자를 제공합니다.
도 1은 Huh7 인간 HCC 세포가 3일 동안 20 μL 프레시 미디어에서 12,000세포에서 125세포로 시작하여 내림차순 파종 밀도로 시드된 파일럿 연구에서 얻은 데이터를 묘사한다. 12,000개의 세포의 파종 밀도는 비대칭 모양으로 스페로이드를 산출했으며, 이는 세포 파종 밀도의 절반후에도 수정되지 않았습니다. 그러나 3000개의 세포에서 생성된 스페로이드는 더 둥글게 나타났다(그림 1, 위쪽 행). 세포 농도의 추가 감소는 단일 구체 (125, 250, 500 세포 밀도 구체)를 형성하는 데 성공하지 도 일반 구형 모양 (1000 및 1500 세포 밀도 구체)을 형성하지 않았다. 많은 작은 구체가 500개의 종양 세포의 밀도로 형성되었다는 것을 언급할 가치가 있습니다. 그러나 작은 스페로이드는 50배율(그림 1, 위쪽 행)에서 하나만 캡처되었습니다. 동일한 최적화 된 프로토콜은 COS7 영장류 신장 섬유 아세포 세포주 (도 1, 중간 행)에 적용되었다. 20 μL 매달려 방울에서 125, 250 및 500 COS7 섬유아세포를 일시 중단하면 여러 개의 작은 스페로이드가있는 둥근 스페로이드가 발생했으며, 더 높은 세포 밀도 (1000, 1500 및 3000)는 단일 반라운드 스퍼로이드를 형성했습니다. Huh7 종양 스페로이드와 유사하게, 더 높은 세포 현탁액(6,000 및 12,000세포/sphere)은 불규칙한 세포 응재의 형성을 초래하고, 따라서 더 높은 세포 농도가 폐기되었다(도 1, 중간 행). Huh7/COS7 이종성 세포 현탁액(125, 250 및 500 세포/구)의 낮은 밀도는 여러 부동 또는 반 부착된 스페로이드로 단일 스페로이드를 생성하였다(그림 1, 하단 행). 1000-1500 세포 이종경 구체형은 반둥광이되었고, 3000세포(셀 타입당 1500)의 파종 밀도는 둥근 3D 스페로이드를 주었다. 앞에서 언급했듯이, 세포 밀도가 높을수록 잘 정의된 스페로이드가 아닌 골재의 형성이 발생했습니다(그림 1, 아래 줄). 결론적으로, 3000세포 밀도 스페로이드는 인간 HCC 종양과 유사하게 둥글게 되었고, 추가 실험을 위해 적응하였다. 세포 현탁액을 3일 동안 매달려 있는 물방울로 배양하는 것은 스페로이드 형성을 촉진하기에 충분했다.
현재 문맥에서 스페로이드 형성에 가장 적합한 세포 농도 및 시점을 최적화한 후, 종양과 섬유아세포 세포주를 공동 배양하는 데 미치는 증식적 영향은 세로적으로 평가되었다. 그림 2 및 도 3 은 3일부터 10일까지 모니터링된 Huh7/COS7 이종성 구형 구체(스페로이드 당 총 세포 수 3000개)를 보여줍니다. 동종항 허7 및 COS7 스페로이드 (각각 1500 세포)는 대조군으로 사용되었습니다. 4일째부터 이종성 스페로이드는 동종구 구형(그림 2)에 비해 이상적인 둥근 모양으로 성장했습니다. 이성구 스페로이드의 초기 부피는 각 동종 구형 스페로이드의 부피보다 컸다. 스페로이드의 성장은 스페로이드 볼륨의 정상적인 변동을 피하기 위해 스페로이드 형성 의 날에 초기 부피에 비해 볼륨의 변화로 계산되었다 (일 3, 도 3). 이종경 구페로이드는 당초 4일부터 7일까지 급속한 성장세를 보였고, 8일째에는 느린 성장단계가 나타났다(그림 2, 상층, 도 3). 스페로이드 볼륨은 9일과 10일에 감소, 아마도 영양소 또는 저산소 코어와 세포 죽음의 고갈을 반영.
대조적으로, 동종항 허7 및 COS7 스페로이드는 훨씬 느린 속도로 성장했습니다 (그림 2, 중간 및 하단 행; 그림 3). 동종경 스페로이드는 문화의 다섯 번째 날까지 상대적으로 정적 성장 곡선을 나타냈다 (스페로이드 형성 후 이틀). 6일부터 동종구 스페로이드는 이기종 구형 구형(그림 3)보다 훨씬 낮은 속도로 성장 곡선이 점진적으로 증가하기 시작했습니다. 결론적으로, 종양/섬유아세포 이성세포 구체형은 종양 세포와 섬유아세포의 직접적인 접촉이 종양 스페로이드의 크기를 증가시킨다는 것을 건의하는 동형성 구페로이드보다는 더 높은 비율로 증가합니다.
마지막으로, 상기 발견을 검증하고 간 관련 맥락에서 HCC 스페로이드의 증식에 대한 중간엽 세포의 파라크리니 크런을 연구하기 위해, 3일 된 호발성 Hep3B HCC 스페로이드는 LX2 간 질산 세포로부터 정기적인 신선한 매체 또는 CM에서 성장하였다(그림 4 및 도 5). 언뜻 보기에 3000 Hep3B 세포가 3 일 후에 완벽하게 둥근 스페로이드를 형성했습니다 (그림 4). Hep3B 스페로이드는 3일부터 7일까지 신선한 미디어에서 지속적인 증식을 보였다(그림 4, 상층). Hep3B 스페로이드가 LX2 CM에서 유지되었을 때 성장률이 향상되었습니다(그림 4, 하열). Hep3B 스페로이드 성장에서 이러한 미디어 의존적 전환은 4일째부터 끝까지 종양 스페로이드의 섬유아세포 구동 증식을 시사하는 통계적 유의를 나타냈다.
결론적으로, 본 연구는 HCC 종양 세포와 상이한 섬유아세포 세포주 사이의 교차토크를 악용하고 이 직간접적인 세포 상호작용의 확산 적 중요성을 조사하기 위해 기존의 3D 스페로이드 배양을 성공적으로 수정하였다(도 6). 형성된 스페로이드의 추가 특성화는 종양 세포가 주변 미세 환경과 상호 작용하는 방식을 향상시키기 위해 필요합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> 그림 1: 스페로이드 형성을 위한 최적의 세포 밀도의 최적화. 열은 다른 세포 파종 밀도를 나타내며, 행은 Huh7 세포(위쪽 행), COS7 셀(가운데 행), Huh7/COS7 이종 세포(아래 쪽 행)에서 형성된 구체를 나타냅니다. 이미지는 20μL 미디어에서 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 및 12000 세포(왼쪽에서 오른쪽으로)를 일시 중단한 후 형성된 스페로이드를 나타냅니다. 파일럿 연구에는 조건당 두 개의 스페로이드가 포함되었으며, 이미지는 50배배율, 스케일 바 = 200 μm로 촬영 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">되었습니다.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> 그림 2: 동종구 스페로이드 성장 대 이종성. 컬럼은 스페로이드 이미지가 촬영된 날을 나타내며, 행은 Huh7 셀(위쪽 행), COS7 셀(가운데 행), Huh7/COS7 셀(아래 줄)에서 형성된 스페로이드에 대한 대표적인 이미지를 표시합니다. 이미지는 왼쪽에서 오른쪽으로 다른 시간 점의 각 조건 (동종 Huh7, COS7, 또는 Huh7/COS7 이종성 구체)에서 3000 세포를 일시 중단 한 후 형성 된 스페로이드를 나타냅니다. 실험에는 조건당 10개의 스페로이드가 포함되어 있으며, 이미지는 50배배율, 스케일 바 = 200 μm로 촬영 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">하였다.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> 그림 3: 동종구 스페로이드 성장 대 이종성 분석. 그래프는 이종성 Huh7/COS7 스페로이드 대 동형 Huh7 및 COS7 스페로이드의 성장 곡선을 보여줍니다. 데이터는 ± 의미로 제시됩니다.m; n = 10 개의 독립적 인 스페로이드. ** p &lt; 0.01; p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> 그림 4: LX2 CM에서 호모티픽 헵3B 스페로이드의 성장. 열은 스페로이드 이미지가 캡처된 날을 나타내며, 행은 신선한 DMEM 문화 미디어(맨 위 행) 또는 LX2 CM(아래줄)에서 배양된 Hep3B 스페로이드의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 실험에는 조건당 7개의 스페로이드(신선한 미디어 또는 LX2 CM)가 포함되어 있으며, 이미지는 50배배율, 스케일 바 = 200 μm로 촬영 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">하였다.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> 도 5: 동종포형 Hep3B 스페로이드 성장의 종방향 분석. 그래프는 신선한 DMEM 배양 매체 또는 LX2 CM ±에서 Hep3B 스페로이드의 성장 곡선을 보여줍니다.m. n = 7 개의 독립적 인 스페로이드. p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> 도 6: 스페로이드 형성 과정의 회로도 표현. 셀 서스펜션은 10cm3 페트리 디쉬의 내부 뚜껑에 피펫됩니다. 뚜껑은 반전되어 동종 또는 이성구 구형 형성을 허용하기 위해 3 일 동안 보관됩니다. 스페로이드 이미지는 50배 배율로 촬영됩니다. 그림은 웹 기반 과학 그림 도구를 사용하여 만들어집니다(재료 표 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

관련 인간 질병을 충실하게 재구성하는 포괄적인 체외 모델은 부족합니다. 현재 연구는 인간 간세포 암에서 종양 기질 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수있는 체외 도구인 3차원 (3D) 종양 스페로이드 생성 및 문화를 제시합니다.

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

3D 종양 스페로이드는 체외암 연구를 위한 금본위제로 기존의 2D 단층 기술을 대체하였다. 이러한 모델은 종양 미세 환경의 이질성을 반영하고 공간 상호 작용의 착취를 허용하는 다중 세포 유형의 공동 배양을 허용합니다. 3D 스페로이드를 생성하는 행염물 방법을 사용하는 장점은 세포-플라스틱 상호작용의 부족과 종양 세포와 비종양 세포 간의 상호작용을 연구하는 용이성이다.이 기술은 또한 종양-기질 상호 작용을 모델링하는 재현가능하고 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 3D 종양은 귀중한 전임상 모델이며 종종 약물 선별 도구로 사용됩니다. 이 방법은 종양 성장과 주변 미세 환경에 대한 다중 화합물의 약리학적 효과를 연구하기 위해 적용 될 수있다.스페로이드 형성 과정은 사용자 친화적이며 기존의 세포 배양 실험실 장비가 필요합니다. 스페로이드는 벤치 탑 반전 광 현미경을 사용하여 이미지화될 수 있으며, 스페로이드 크기 및 형상의 분석은 널리 이용 가능한 온라인 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 시작하려면, 액체 질소에 있는 그들의 저장 랙에서 Huh7 및 Hep3B HCC HCC 종양 세포주 및 COS-7 및 LX2 섬유아세포 세포주를 제거하고 급속하게 해동합니다.해동 후, 신선한 배양 배지의 두 밀리리터로 해동 된 세포를 희석. 세포를 원심분리합니다. 상체를 버리고 신선한 따뜻한 배양 배지의 1 밀리리터에 세포 펠릿을 다시 놓습니다.그런 다음 T75 세포 배양소에서 세포를 씨앗과 세포가 60 ~70&인플루엔자에 도달할 때까지 세포 배양 인큐베이터에서 배양합니다. 세포 수집의 경우 배양 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 플라스크 바닥에서 부착 된 세포를 분리하려면 미리 따뜻해지는 트립신 2 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 배양하십시오.4분 후, 완전한 배양 배지의 4밀리리터를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 세포 현탁액을 수집한 다음 세포를 원심분리하고 상체를 폐기한 후 신선한 배양 배지의 1밀리리터로 세포를 다시 분리한다. 마지막으로, 신선한 배양 매체의 3 밀리리터를 추가합니다. 세포를 계산하려면 셀 서스펜션을 부드럽게 소용돌이시다.그런 다음 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션의 마이크로리터 10마이크로리터를 트라이판 블루 10 마이크로리터와 혼합하고 혼합물을 4번 위아래로 부드럽게 피펫하여 염료로 외부 셀 표면의 완전한 염색을 보장합니다. 다음으로, 혈종계 계수 영역에 덮개 슬립을 놓습니다. 그런 다음 커버슬립 의 가장자리 옆에 셀 혼합물이 들어있는 파이펫 팁을 놓고 팁 함량을 계산 슬라이드로 부드럽게 추방합니다.슬러리가 정착할 때까지 몇 분 동안 기다린 후 현미경 스테이지의 혈류계를 수정하고 아래또는 왼쪽 판결이 겹치는 것을 피하면서 위또는 오른쪽 판결을 겹치는 세포를 계산합니다. 마지막으로 이 수식을 사용하여 총 셀 수를 계산합니다. 배양 배지를 흡입한 후 PBS로 LX2 세포를 세 번 세척합니다.이전에 입증 된 바와 같이 트립신을 사용하여 세포를 분리하고 원심 분리. 이전에 입증 된 바와 같이 세포를 계산 한 후, 10 입방 센티미터 접시에 여섯 번째 LX2 세포에 10 번 씨앗과 37 섭씨에서 배양. 48 시간 후에 섬유 아세포 조절 된 배지 및 원심 분리기를 수집하여 부동 세포를 펠릿하십시오.필터는 20 밀리리터 주사기에 부착된 0.22 미크론 필터를 사용하여 조건부 배지를 살균합니다. 그런 다음 미디어를 영하 80도의 저장을 위해 두 밀리리터 튜브로 알리쿼트합니다. 10 입방 센티미터 접시의 바닥에 멸균 PBS의 10 밀리리터를 추가하여 스페로이드에 습한 조건을 제공합니다.그런 다음 1, 500 HuH7 HCC 세포를 1, 500 COS-7 포유류 섬유아세포 세포를 매달려 있는 물방울에서 구체를 형성한다. 세포 현탁액을 포함한 미디어가 습한 환경에 걸려 있게 하려면 접시 뚜껑을 반전시키면 됩니다. 3 일 후, 스페로이드의 이미지를 가지고, 반전 현미경의 무대에 접시를 넣어 다섯 배로 배율을 조정.다음으로 연결된 컴퓨터에서 현미경 소프트웨어를 열고 모든 스페로이드의 선명한 이미지를 갖도록 초점을 조정합니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어의 스냅 도구를 사용하여 이미지를 획득하고 획득 한 사진을 저장합니다. 멸균 PBS 10 밀리리터를 10입방센티미터 접시 바닥에 넣습니다.그런 다음 3, 000 Hep3B HCC 세포를 매달려 있는 물방울에서 구체를 형성하고 접시뚜껑을 반전시켜 3일 동안 습한 환경에 물방울이 걸려 있게 한다. 다음으로, Hp3B 스페로이드를 LX2 세포에서 신선한 상태 미디어의 20 마이크로리터로 전달하여 물방울을 매달아 놓습니다. 그런 다음 스페로이드가 형성되는 접시의 뚜껑을 반전시키고 가벼운 현미경의 단계에서 뚜껑을 고정하십시오.현미경의 미세 한 초점을 조정 하여 이전에 설명 된 대로 각 스페로이드를 볼 수 있도록. 플런저 버튼을 눌러 마이크로피펫에서 공기를 조심스럽게 비우고, 스페로이드가 들어 있는 액적에 파이펫 팁을 삽입한다. 팁으로 건드리지 않고 스페로이드에 매우 가까이 가십시오.다음으로, 플런저 버튼의 압력을 부드럽게 방출하여 스페로이드를 마이크로피펫 팁으로 흡입하여 두 개의 마이크로리터의 매체를 허용합니다. 그런 다음 새로운 10 입방 센티미터 접시에 매달려 새로운 물방울로 스페로이드를 전송합니다. LX2 컨디셔닝 된 미디어에서 문화의 7 일까지 전송 일로부터 반전 된 현미경을 사용하여 5 배율로 스페로이드의 이미지를 가져 가라.성장하는 스페로이드의 이미지를 분석하려면 이미지 분석 소프트웨어에서 각 스페로이드 이미지를 열고 프리핸드 선택 도구를 사용하여 각 스페로이드를 간략하게 설명합니다. 그런 다음 분석 드롭다운 버튼에서 설정 된 측정을 선택하고 영역을 선택하고 확인을 누릅니다. 다음으로, 수동으로 각 스페로이드 주위에 원을 그리고 구가 동그라미를 하면 제어 M을 눌러 프로그램이 픽셀로 스페로이드 영역을 계산할 수 있도록 합니다. 그런 다음 이 수식을 사용하여 스페로이드 영역을 볼륨으로 변환합니다.마지막으로 이미지 캡처 첫날의 볼륨에 비해 스페로이드 볼륨의 변화를 계산합니다. 스페로이드 형성을 위한 세포 밀도를 최적화하는 동안, 12, 000 및 6, 000 세포의 높은 파종 밀도는 비대칭 모양으로 스페로이드를 산출하고, 3, 000 세포의 파종 밀도는 완벽한 둥근 3D 스페로이드를 주었다. 따라서, 3, 000 세포 밀도 스페로이드는 추가 실험을 위해 적응되었다.종양과 섬유아세포 세포주 공동 배양으로 인한 증식 적 영향에 대한 경도 평가는 4일째부터 이성화 구형이 동종피 구형에 비해 이상적인 둥근 모양으로 성장한 것으로 나타났습니다. 이종경 구형은 처음에 4일째부터 7일째까지 급속한 성장단계를 보였고, 8일째에는 더 느린 위상을 보였다. 그 때 구체성 부피는 그 때 9일과 10일에 감소했습니다, 가능하게 양분 또는 저산소 심및 세포 사멸의 고갈을 반영합니다.반면, 동종구 스페로이드는 5일째까지 비교적 정적 성장 곡선을 보였고, 그 뒤를 이어 6일째부터 성장 곡선이 점진적으로 증가했습니다. 이종경 스페로이드의 높은 성장 속도는 종양과 섬유아세포 사이의 직접적인 접촉이 종양 스페로이드의 크기를 증가시킨다는 것을 시사한다. 3일 된 동종포 형 Hep3B 스페로이드가 신선한 매체에서 재배되었을 때, 세포는 3 일 후에 완벽하게 둥근 스페로이드를 형성하고 7 일까지 계속 증식을 보였다.Spheroids가 LX2 조건부 매체에서 유지될 때 성장 속도는 향상되었습니다, 종양 스페로이드의 섬유아세포 구동 증식을 건의하. 멸균 BBS가 스페로이드 형성에 적합한 습한 상태를 유지하기 위해 접시의 바닥에 첨가되도록하는 것이 중요합니다. 또한 뚜껑을 반전시키면서 스페로이드와 물방울이 중단되지 않도록 주의하십시오.3D 종양 스페로이드는 면역화학 또는 면역형광과 같은 향후 응용 분야뿐만 아니라 전사 분석을 위한 RNA 추출을 위해 고정 또는 냉동 및 저장될 수 있다. 미리 표지된 세포를 가진 이종경 구체는 종양 마이크로 환경 내의 세포 세포 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하기 위하여 심화되고 추적될 수 있습니다.

a-three-dimensional-spheroid-model-to-investigate-tumor-stromal

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

종양 세포와 기질 섬유아세포의 이질적 상호작용에 기초한 새로운 3차원 스페로이드 모델이 확립된다. 여기에서, 우리는 spheroids의 대형을 구상하기 위하여 종양 세포 및 기질 섬유아세포, 시간 경과 화상 진찰 및 공초점 현미경 검사법의 공동 배양제시합니다. 이 3차원 모델은 종양-기질 상호 작용을 연구하고 암 치료제를 테스트하는 적절한 플랫폼을 제공합니다.

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

이 프로토콜은 섬유성 기질 구획을 동반한 3D 생체 모방 모델을 제공합니다. 생리학적으로 관련된 하이드로겔을 사용하여 기질 세포 외 매트릭스의 생체 물성 특성, 세포 상호 작용, 종양 성장 및 전이의 활성 중재자를 모방합니다.

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

다세포 3D 종양 스페로이드는 폐 선암 세포, 섬유아세포 및 단핵구로 준비한 후 이러한 스페로이드에서 암 관련 섬유아세포(CAF)를 분리했습니다. 분리된 CAF를 정상 섬유아세포와 비교하여 미토콘드리아 막횡단 전위, 활성 산소 종 및 효소 활성을 연구하여 미토콘드리아 건강을 평가했습니다.

3D 다세포 폐 종양 스페로이드에서 분리된 암 관련 섬유아세포의 미토콘드리아 건강 평가

암 전이를 연구하기 위해 이세포성 누화를 캡처하는 3D 암 모델이 매우 필요합니다. 우리의 연구는 침입 및 세포 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있는 골격 및 골격이 없는 환경에서 이종 다세포 기질-상피의 생성을 제시합니다.

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

이 프로토콜은 간별 세포 형태를 온전한 간 조직에서 시각화하고 모델링하기 위한 포괄적인 영상 파이프라인을 제공합니다. 이 접근법은 마우스 유전학을 이용한 형광 표 지, 현장 간 관류 기반 조직 준비, 그리고 광학 투명성을 달성하기 위한 수정된 iDISCO 조직 클리어링 방법을 결합합니다.

간 섬유증 마우스 모델에서 간 별형 세포 형태 매핑

배우세요 3D 스페로이드 모델을 활용한 간세포 암에서 종양-기질 상호 작용 연구 방법입니다. 매달린 액적법으로 다세포 공배양을 구현하여 종양 미세환경의 이형성을 재현하고 약물 스크리닝에 활용할 수 있습니다.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

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