세포 신호를 분석하는 통합 툴킷: 힘, 동작, 형태학 및 형광

부착 된 세포는 주변의 힘을 발휘하고, 그 힘은 녹색으로 여기에 표시된 기판에 발휘하는 세포와 붉은 색으로 표시된 힘 세포가 이웃에 발휘하는 것을 포함한다. 이러한 힘은 단층 응력 현미경 검사법이라는 기술을 사용하여 세포 단층에서 측정될 수 있다. 간단히 말해서, 이 기술은 작은 형광 구슬을 포함하는 하이드로겔과 유리에 붙어있는 큰 형광 구슬을 준비하는 것을 포함합니다.

이 하이드로겔에서, 하나는 세포를 보고 결합하거나 어떤 상태 하나가 힘을 측정하고자하는 것을 배양. 힘의 측정은 세포 단층을 이미징하고 세포의 전달된 빛 이미지, 작고 큰 구슬의 형광 광 이미지를 촬영해야합니다. 이러한 각 이미지는 동일한 보컬 평면에서 획득됩니다.

이러한 이미지는 셀이 하이드로겔에서 부착되고 분리될 때 획득됩니다. 그리고 이 두 이미지 집합을 비교하면 이러한 모든 힘을 정량화하는 데 필요한 데이터를 제공합니다. 이것이 바로 AcTrM과 AnViM이 플레이하는 곳입니다.

셀을 플레이트한 후 원하는 인스턴스에서 동일한 위치에서 이미지를 수집한 다음 해당 프로토콜이 AcTrM으로 프로그래밍된 다음 이 데이터를 분석하고 결과를 시각화하기 위해 AnViM의 목적입니다. 다음 몇 분 안에, 우리는 합류 세포 단층에 대한 이미지를 획득하는 과정을 안내할 것입니다. 작업 단계 0은 사용자가 획득 유형을 선택하라는 메시지를 표시합니다.

새로운 실험을 시작하기 위한 새로운 인수 또는 이전 실험을 재개하기 위한 지속적인 인수. 새로 수집을 클릭하여 위치 목록을 만듭니다. 작업 단계 1에는 다음 단계의 모든 단계가 나열됩니다.

그리고 이러한 작업은 여기에 단계 위치 목록 창에서 수행됩니다. 마이크로 관리자에서 라이브를 클릭하여 수동으로 조정할 샘플을 시각화합니다. 라이브 뷰에서, 우리는 단계를 볼 수 있습니다.

여기에 분명하다. 이제 구슬을 보아야 합니다. 여기서, 구슬은 형광으로 시각화될 수 있다.

따라서 상단 구슬에 적합한 채널을 선택합니다. 또한 몇 가지 하단 구슬을 볼 수 있는 것이 중요 하므로 하단 구슬에 대 한 채널을 살펴보겠습니다. 여기서 보는 것은 아래 구슬의 흐릿한 이미지이며, 하단 구슬이 있다는 것을 알 수 있는 한 이 이미지에서 볼 수 있는 것은 완전히 괜찮습니다.

위치 목록을 클릭합니다. 위치 목록을 만드는 방법입니다. 이전 비디오에서 설명한 위치 목록을 만든 후 다차원 획득 창을 사용하여 2단계에서 나열된 단계를 따릅니다.

우리가 오랜 시간 경과를 수행 할 것을 가정 해 봅시다. 여기, 나는 우리가 촬영하려는 이미지의 수를 나타낼 거야. 첫 번째 채널은 위상 채널이 될 것입니다.

다음 하나는 상단 구슬의 될 것입니다 그리고 그 후 하나는 하단 구슬 될 것입니다. 다차원 획득 창에서 닫을 클릭하고 AcTrM 2 단계에서 확인을 클릭합니다. 출력은 다차원 획득 창에서 식별된 디렉터리에 저장됩니다.

작업 단계 3실험에 복구가 필요한지 묻습니다. 대답은 일반적으로 '예'입니다. 여기에 iTACS는 우리가 세련된 복구를 수행 할 수 있습니까?

이 첫 번째 부분은 정제 된 회복에 매우 가까워질 것이지만, 하단 부분은 재배치의 더 높은 정확도에 더 가까워질 것입니다. 제한된 시야를 사용하여 복구가 수행될 경우 이 옵션이 제공되지만 이 실험에서는 해당 옵션을 선택하지 않습니다. 이 시점에서 참조 이미지 집합의 수집이 완료되고 마이크로 관리자를 닫을 수 있습니다.

이미지 수집의 경우 AcTrM이 시작됩니다. 배율을 선택하고 데이터 폴더가 포함된 디렉터리를 선택합니다. 위치를 지정하는 데 사용되는 채널과 함께 플레이트 위치를 재배치하기 위한 선택 사항을 선택합니다.

현재 카메라에서 볼 수 있는 것과 저장된 이미지와 일치하는 인터페이스가 제공됩니다. 겹치면 이미지가 검은색과 함께 빨간색과 녹색색을 표시하고 수동 조정을 수행할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 히트 수락, 그리고 인수가 진행됩니다.

이제 피지를 시작할 수 있습니다. 사전 처리라는 MSM 드롭다운 메뉴에서 첫 번째 옵션을 선택합니다. 그런 다음 tnimgs 폴더를 포함하는 폴더를 선택합니다.

다음으로 어떤 채널이 어떤 이미지와 일치하는지 정의해야 합니다. 이 예에서, 채널 0은 세포의 위상 대비 영상인 전송된 광 화상이다. 하단 비드 이미지는 채널 2이고 상단 비드 이미지는 채널 1입니다.

그리고, 그것은 세포가 교차하는 곳과 이미지의 어느 면을 묻는 것입니다. 이 경우 셀은 오른쪽 가장자리를 향해 전진하는 단층이므로 오른쪽을 선택 해제하고 계속합니다. 모노레이어에서 멀리 떨어진 상단 구슬의 작은 영역은 여기에 표시된 것보다 희소하고 더 큰 것처럼 보이는 하단 구슬 이미지와 동일한 목적을 제공합니다.

이제 비드가 눈에 띄게 보이도록 밝기와 대비를 바꿀 것인지 묻습니다. 따라서 메뉴의 슬라이더 막대를 사용하여 조정하고 구슬이 눈에 띄게 나타나면 확인을 클릭합니다. 그리고 지금, 우리는 위치 수정을 할 수 있습니다. 어떤 변화가있는 경우, 그것은 그것을 제거합니다.

그리고 완료되면 분석 폴더를 만듭니다. 분석 폴더 내에서 위치 폴더, P0을 만들고 이전 전처리 메뉴에서 선택한 항목이 교차된 모서리, 픽셀 크기 및 위상 대비 및 기타 이미지와 같은 분석 선택에 저장됩니다. 단층 응력 현미경 검사법 또는 MSM 드롭다운 메뉴에서 MSM 젤 변형을 선택합니다.

여기에서 비드 배포에 적합한 옵션을 선택합니다. 데이터가 처리되고 있으므로 위치 폴더에 새 변위 폴더가 나타난 것을 볼 수 있습니다. 이것은 모든 출력 파일이 저장되는 곳입니다.

이는 분석이 완료했음을 나타냅니다. 우리는 세포-ECM 접합 및 세포 세포 접합및 또한 단층의 개별 세포의 세포 골격을 통해 발휘되는 힘을 계산하는 방법을 살펴볼 것입니다. 이를 위해 세 번째 옵션을 선택합니다.

그리고 하나는 tnimgs와 분석 폴더를 포함하는 디렉토리를 선택할 것입니다, 이는 하나는 이러한 디렉터리 대신 예제 디렉터리를 선택한다는 것을 의미합니다. 히트 선택, 그것은 당신을 물어 볼 것이다, 이 젤의 전단 계수는 무엇입니까? 전단 계수는 1250이며 이 예에서 하이드로겔의 두께는 118 미크론이다.

예상 소음 수준은 여기에서 제공됩니다. 그런 다음 변위가 0 플래그라는 의미가 있으며 이 경우 확인되지 않습니다. 확인을 선택하고 견인력을 계산하는 구현은 이 버전의 AnViM에서 구현되는 방법입니다.

이제 세포 세포 또는 사이토셀레탈 힘에 대한 계산을 할 준비가 되었습니다. 그리고 첫 번째 질문은 단층 이면에 있는 것입니까? 이 특별한 경우에, 우리는 전진 단층이 있고 프레임의 오른쪽에 있는 셀 영역이 없습니다.

그래서 대답은 단층이 혼잡하지 않다는 것입니다, 그래서 우리는 아니오를 말할 것입니다. 이제 가장 큰 비셀 개체 주위에 다각형을 그려야 합니다. 우리는 세분화에 적합한 방법을 선택합니다.

여기서는 3번과 4번 의 방법으로 세포의 색을 표시해 달라고 요청하고 있으므로, 여기서 세포는 검은색이므로 검은색을 선택하게 됩니다. 이러한 다른 방법에서 생성되는 분할은 셀 단층및 셀 영역이 없는 일부 흰색 영역에 있는 일부 구멍으로 끝납니다. 여기에서 우리는 선택하고 반점을 자동으로 채우고 OK.So 모든 반점이 단층과 셀 영역으로 채워지지 않습니다.

그런 다음 셀룰러 모노레이어에서 기계적 응력을 계산합니다. 우리는 이미 세포 영역이 없는 세포 영역에서 세포를 분할한 1부를 수행했기 때문에 개별 세포와 이미지의 분할인 2부로 이 단계를 시작합니다. 하나는 개별 셀에 대한 세분화를 선택할 것입니다.

그리고 여기에 위치 디렉토리를 선택하도록 요청하고 있습니다. 그리고 이러한 매개 변수에 대한 몇 가지 더 많은 정보가 여기에 제공됩니다. 그런 다음 가장 작은 정상 셀 주위에 다각형을 그려 달라고 요청합니다.

따라서 여기에 그리는 것은 영역을 계산하는 데 사용되며 이보다 작은 것은 셀로 정의되지 않는다고 규정할 것입니다. 그리고 다음으로 가장 큰 세포를 요구합니다. 그래서 우리는 가장 큰 정상 셀 주위에 다각형을 그립니다, 그리고 어느 것이 더 밝습니까?

세포-세포 인터페이스가 더 밝습니까, 아니면 세포 중심이 더 밝습니까? 따라서 이 경우 셀 셀 인터페이스가 밝기 때문에 셀 셀 인터페이스를 선택합니다. 따라서 계산이 완료되었음을 나타냅니다.

먼저 셀 강도에 대한 맵을 선택해 보겠습니다. 먼저 iTACS는 사용자에게 P0 폴더라고도 하는 위치 디렉토리를 선택하도록 요청합니다. 완료되면 선택 선택을 클릭합니다.

그런 다음 사용자는 iTACS가 세포 분열을 감지하거나 세포 형광을 정량화하기를 원하는지 묻습니다. 이 경우, 우리는 세포 내부에 형광 단백질이 없기 때문에 세포 분열을 감지하기로 선택합니다. 다음 슬라이드를 사용하면 사용자가 인접 영역의 크기를 정의할 수 있으며, 이는 AnViM이 개별 셀의 특성뿐만 아니라 이웃 영역의 특성을 보는 곳에서 수행하는 고유한 분석입니다.

여기서 사용자는 인접한 셀 영역의 폭을 선택할 수 있습니다. 이 경우 60픽셀로 인접 영역을 정의합니다. 첫 번째 확인란은 iTACS가 세포의 특성을 수집할 것인지 묻고, 그래, 이 확인란은 iTACS가 이웃의 속성을 수집할 것인지 묻습니다.

이러한 확인란 아래에 iTACS는 사용자가 각 확인란에 대한 자세한 내용을 원하는 경우 확인란에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 이는 분석이 완료했음을 나타냅니다. 다시 말하지만 iTACS는 사용자에게 위치 디렉터리를 선택하도록 요청합니다.

그런 다음 사용자는 힘 데이터를 매핑하고, 힘 데이터의 이미지를 만들고, 속도 데이터를 매핑하고, 속도 데이터의 이미지를 만들 수 있습니다. 이미지를 만드는 데는 시간이 걸리므로 지금 이미지를 선택하거나 나중에 기다릴 수 있습니다. 따라서 사용자에게 선택 사항을 선택하거나 선택할 수 있는 옵션이 제공됩니다.

여기서 iTACS는 사용자에게 인접 영역의 크기를 다시 결정하도록 요청하며, 당사의 경우 60픽셀인 텐즈를 매핑하기 위해 결정한 것과 동일한 크기를 사용할 수 있습니다. 그리고 다시, 사용자는 셀뿐만 아니라 이웃 지역의 속성을 수집하도록 요청받습니다. 이는 분석이 완료했음을 나타냅니다.

단층 응력 현미경 검사법 또는 MSM 드롭다운 메뉴에서 결과를 추적하는 데이터를 선택합니다. 먼저 iTACS는 사용자에게 P0 폴더라고도 하는 위치 디렉토리를 선택하도록 요청합니다. 완료되면 선택 선택을 클릭합니다.

여기서 iTACS는 사용자가 iTACS에서 데이터 추적을 시작하기를 원하는 프레임 번호를 묻습니다. 프레임 번호 2에서 추적을 시작하는 것은 매우 안전합니다. 여기서 iTACS는 사용자에게 동시에 채울 최대 플롯 수를 표시하도록 요청합니다.

그리고 본질적으로, 이것은 데이터 추적을 신속하게 하는 방법입니다. 완료되면 확인을 클릭하고 추적 중에 변수를 선택하는 옵션은 히트 맵생성 옵션과 유사한 방식으로 표시됩니다. 공통 관심 속성은 창 상단의 텍스트 상자에 제공됩니다.

그러나 변수를 사용자 지정하려면 텍스트 상자의 모든 항목을 삭제하고 아래에 나열된 특정 속성을 선택하기만 하면 됩니다. 단층 응력 현미경 검사법 또는 MSM 드롭다운 메뉴에서 결과 플롯을 선택합니다. 그 후 iTACS는 사용자가 끊어지지 않은 트랙이 있는 셀로 플롯을 제한하려는지 사용자에게 묻습니다.

플롯을 끊지 않은 트랙으로 제한하지 않으려면 아니요.하지만 끊어지지 않은 트랙이 있는 셀에 플롯을 제한하려면 예 여기 iTACS를 클릭하여 사용자가 프로그램을 플롯할 변수 수를 묻습니다. iTACS는 최대 3개의 변수를 플로팅할 수 있으며, 이 경우 두 변수만 플롯하여 이러한 요소 간의 관계를 확인할 수 있습니다. 단층 응력 현미경 검사법 또는 MSM 드롭다운 메뉴에서 결과 그림을 선택합니다.

위치 디렉토리가 있고 완료되면 선택 선택을 클릭합니다. iTACS는 시작 프레임을 선택하도록 요청합니다. 여기서, 우리는 프레임 번호 2를 선택했습니다.

히트 맵을 만드는 옵션은 개별 셀의 시간 트랙을 플로팅하는 옵션과 유사한 방식으로 제공됩니다. 그것으로, 우리는 열지도를 만드는 방법을 결론을 내립니다. 여기서 세포 수1에 대한 세포골격 긴장의 세포 속도의 시간 추적을 나타냅니다.

속성은 공유 수직 축에 표시되고 가로 축은 프레임이 15분 간격으로 획득되는 시간 인스턴스 번호를 나타냅니다. 두 번째 출력은 실험에 1시간 동안 열맵배열입니다. 여기에 표시된 특성에는 스프레드 영역, 방향, 원형, 속도, 움직임 방향, 최대 장력 방향, 세포골격 긴장, 기판 견인 및 개별 세포의 장력 성 역방향이 포함됩니다.

그래서 이것은 실험의 한 세트를 엿볼 수 있습니다. AnViM 및 AcTrM이 사용자가 실험을 재현적으로 수행하는 데 도움이 될 수 있으며 이러한 연락처가 원고에 나열되는 몇 가지 다른 실험 상황이 있습니다. iTACS의 주요 기능 중 일부는 실험 프로토콜의 자동화, 자동화된 데이터 분석 및 엔지니어링 배경이 필요하지 않습니다.