Name: 산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 학습하세요 화학발광 기반 분석법을 이용하여 산화 질소 및 그 대사산물을 고감도로 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 생물학적 샘플에서 미량의 산화 질소 변화를 정밀 측정하여 질병 진행과 치료 효과를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 원고에보고 된 프로토콜은 매사추세츠 종합 병원의 마취학과 인 워렌 자폴 (Warren Zapol) 박사의 중환자 치료 마취 연구 연구소의 이전 동료들의 축적 된 기여로 가능했습니다. 우리는 나카가와 아키토 박사, 프란체스코 자덱, 엠마누엘레 바세나, 정 레이, 나가사카 야스코, 에스테르 스파그놀리, 엠마누엘레 레조아글리 박사의 공헌을 인정합니다.

L.B.는 용혈 및 산화 질소에 대한 그의 연구에 대한 수석 연구원으로 K23 HL128882 / NHLBI NIH로부터 급여 지원을받습니다. LB는 George Mason University의 Mercatus Center와 iNO Therapeutics LLC의 "COVID-19 연구를위한 빠른 보조금"으로부터 보조금을받습니다. B.Y.는 NHLBI / #R21HL130956 및 DOD / 제네바 재단 (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244)의 보조금으로 지원됩니다. B.Y.는 MGH에서 산화 질소의 전기 생성에 관한 특허를 받았습니다.
L.B.와 B.Y.는 2021년 6월 7일에 출원된 COVID-19 질병 PCT 출원번호: PCT/US2021/036269에서 NO 전달에 대한 특허 출원을 제출했습니다. RWC는 자원이 부족한 환경에 위치한 어린이의 결핵에 대한 분산 진단을 목표로하는 기술 개발의 수석 연구원으로 Unitaid로부터 급여 지원을받습니다.

높은 민감도로 인해, NO 및 관련 화합물의 결정을 위한 화학발광 기반 분석은NO2-오염의 위험이 높다. 실험에 사용된 각각의 시약 (특히 NO2-차단 용액) 및 희석제 (ddH2O 포함)는 배경 신호에 대해 보정하기위해 그의NO2-함량에 대해 시험되어야 한다. 아질산염은 10분 전혈에서 반감기가 매우 반응하며NO3-를 빠르게 생성한다. 따라서 혈액 수집과 원심분리 또는NO2-차단 사이에 경과하는 시간은 사전 분석 오류를 일으킬 수 있으므로 최소화해야합니다15. 혈장 샘플을 이용한 분석에서, 바람직하게는 헤파린 튜브에 혈액을 수집하고, 250 mg의 NEM을 10 mL의 인산완충 식염수(PBS)에 용해시킴으로써 생성된 200 nM NEM의 40 μL로 티올기를 봉쇄한 후 4...

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 mL - 액체</td></tr><tr><td>소포제 B 에멀젼</td><td>Sigma</td><td>A5757</td><td>250 mL - 액체</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x) 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>염산 37% (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 mL - 액체</td></tr><tr><td>요오드</td><td>SAFC</td><td>207772</td><td>100 g - 고체</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>수은 (II) 염화물 ACS 시약> 99.5%</td><td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - 고체 (물에 용해)</td></tr><tr><td>Mili-Q 정수 시스템</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>모델 705 RN 50 &mu; L 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>마이크로리터 주사기</td></tr><tr><td>모델 802 N 25 &mu; L 주사기</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>마이크로리터 주사기</td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td>25 g - 결정질</td></tr><tr><td>질산화물 분석기 + 번들 소프트웨어 - 퍼지 용기</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>화학발광 검출기</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 mL</td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS 시약; 99%</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g - 분말</td></tr><tr><td>Potassium Iodide ACS 시약> 99%</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g - 고체</td></tr><tr><td>Potassium Nitrite cryst. 분석용 EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td>105067</td><td>250g - 결정질</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>기계식 균질화기</td></tr><tr><td>RV3 2단 로터리 베인 펌프</td><td>Edwards</td><td>A65201906</td><td>진공 펌프 - 분석기와 함께 번들</td></tr> 헤<tr><td>파린 나트륨 - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 USP 단위</td></tr> 수<tr><td>산화나트륨 무수 ACS 시약 &지; 97 %</td> <td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - 펠릿</td></tr><tr><td>질산 나트륨 ACS 시약 &ge; 99 %</td> <td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - 분말</td></tr><tr><td>아질산 나트륨 &ge; 99 %</td> <td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g - 결정질</td></tr><tr><td>설파 닐 아미드 &ge; 98 %</td> <td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - 고체</td></tr><tr><td>바나듐 (III) 염화물</td><td>시그마</td><td>112393</td><td>25 g - 고체 -주의 (발열성)</td></tr><tr><td>Whatman 1 여과지</td><td>시그마</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

생체 내에서 산화질소(NO) 활성은 그의 직접적인 효과, NO autoxidation으로부터 생성된 그의 유도체의 작용, 및 니트로화 화합물의 효과의 조합된 결과이다. NO 대사산물을 측정하는 것은 혈관 수준과 다른 조직, 특히 외인성 NO가 투여되는 실험 환경에서 NO 활성을 연구하는 데 필수적입니다. 오존 기반 화학발광 분석은 유체(플라즈마, 조직 균질물, 세포 배양물 포함) 및 가스 혼합물(예: 내뿜는 호흡) 모두에서 NO 및 NO 대사산물의 정밀한 측정을 가능하게 합니다. NO는 오존과 반응하여 흥분 상태에서 이산화질소를 생성합니다. 결과적으로 발광은 광검출 및 샘플의 NO 함량을 반영하는 전기 신호의 생성을 허용합니다. 동일한 샘플로부터의 분취량은 특정 NO 대사산물, 예컨대 질산염, 아질산염, S-니트로소티올, 및 철-니트로실 착물을 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 무세포 헤모글로빈에 의해 소비된 NO는 또한 화학발광 분석으로 정량화된다. 이러한 모든 기술에 대한 그림이 제공됩니다.

무세포 Hb 분석법에 의한 NO 소비는 공지된 농도의 무세포 oxyHb를 함유하는 샘플에서 사용되었다(도 4). 옥시Hb의 하나의 헴이 화학량론적으로 분석에서 하나의 NO 분자를 방출함에 따라, 정제된 무세포 oxyHb는 검정에 대한 검량선을 구축하는데 사용된다(보충 도 3).
심장 수술 중 심폐 우회술(CPB)에서 벗어나는 환자에서 무세포 Hb(비색 분석법으로 측정됨)와 NO 소비 사이의 용량-반응 관계가 도 5에 도시되어 있다. CPB 후 Hb-Fe2+-O2 상태(도 5, 적색)에서 헴 그룹의 농도가 더 높다고 가정할 수 있는데, 이로부터 무세포 Hb의 헴 그룹 중 소수만이 NO를 소비하는 CPB 동안 NO를 투여받은 환자에 비해 (도 5, 적색<s...

여기에서는 고감도의 화학 발광 기반 분석을 사용하여 산화 질소 및 이의 생물학적 관련 유도체를 검출하기위한 프로토콜을 제시합니다.

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

이 프로토콜을 통해 연구원은 현장에서 전담 인력을 고용하는 지침이나 비용없이 산화 질소 대사 산물 측정을 위해 화학 발광 검출기를 능숙하게 사용할 수 있습니다. Chemiluminescence-based assay는 주어진 생물학적 샘플에서 산화 질소 및 그 대사 산물의 수준의 변화를 최소화하는 가장 민감한 방법입니다. 흡입 된 산화 질소는 다양한 질병에 사용되는 치료 가스입니다.질병 진행과 회복이 산화 질소 대사 산물 수준과 정확하게 관련되는 것이 중요합니다. 항균제 인 흡입 된 산화 질소는 기도 전염병 환자를 치료할 때 약속을 보여줍니다. 화학 발광 방법은 산화 질소 복용량과 그 대사 산물을 미생물 학적 및 병리 생리학 적 변화와 상호 연관시키는 것에 대한 통찰력을 제공합니다.DETA-NONOate 용액을 제조하기 위해, pH 7.4의 PBS 중의 10밀리몰 수산화나트륨 610마이크로리터에 DETA-NONOate 10밀리그램을 첨가하여 100밀리몰의 DETA-NONOate를 생성하고 얼음 위에 보관한다. 계속하려면 산소 라인을 화학 발광 검출기에 연결하고 텍스트에 제공된 제조업체의 지시에 따라 압력으로 산소 탱크를 엽니 다. 그런 다음 강도장 유전체 필터 라인을 화학 발광 검출기에 연결하십시오.화학발광 검출기 인터페이스에서 액상 분석을위한 검출 프로그램을 실행하여 산소 공급이 적절하고 검출기가 샘플링을 시작하여 밀리볼트 단위의 신호로 감지를 나타내며 그렇지 않으면 음성 진단 신호를 프롬프트합니다. 퍼지 용기를 준비하려면 바늘 밸브를 오른쪽으로 완전히 조이고 입구 및 출구 정지 콕을 닫아 세 포트 모두에서 퍼지 용기를 닫으십시오. 퍼지 용기에서 캡을 제거하십시오.샘플을 주입하는 데 사용되는 주사기 바늘이 안정하고 원하는 기준선의 존재를 검증하면서 유체 컬럼에 도달할 수 있도록 계획된 분석에 특이적인 충분한 양의 시약을 반응 챔버에 첨가한다. 퍼지 가스 흐름을 시작하려면 불활성 가스 탱크에 두 단계 조절기가 장착되어 있는지 확인하고 불활성 가스 탱크를 용기의 가스 입구와 연결하십시오. 그런 다음 퍼지 용기의 출구를 열고 평방 인치당 하나 ~ 다섯 파운드의 조절기에서 출구 압력으로 가스를 엽니 다.그런 다음 퍼지 용기의 입구를 열고 퍼지 용기의 바늘 밸브를 천천히 열어 가스의 유입을 허용하고 퍼지 용기 내에서 버블 링을 확인합니다. 가스 흐름을 조정하려면 주변 공기를 샘플링하는 강렬 필드 유전체 필터 라인으로 화학 발광 검출기에 의해 측정 된 세포 압력을 기록하십시오. 퍼지 용기에 캡을 재배치하고 인텐트 필드 유전체 필터 라인을 퍼지 용기에 연결합니다.바늘 밸브를 사용하여 주변 공기에 기록 된 화학 발광 검출기 수준에서 동일한 세포 압력에 도달하십시오. 화학발광 신호 수집 프로그램을 시작하려면 화학발광 검출기의 직렬 포트를 수집 프로그램이 설치된 컴퓨터의 직렬 포트에 연결하십시오. 그런 다음 분석 프로그램을 실행하십시오.획득을 클릭 한 다음 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택하고 파일 이름을 입력 한 다음 저장을 클릭하십시오. 샘플 주입을 준비하는 동안 최소 및/또는 최대 버튼을 클릭한 다음 원하는 값을 입력하여 대상 기준선을 제어하도록 화면의 전압 스케일을 조정합니다. 샘플 주입을 수행하려면 각 샘플을 회수하기 전에 탈이온수 및 증류수로 주사기를 적어도 두 번 이상 헹구고 작업 닦아내기에서 방해받지 않는 물 분출을 보장하십시오.그런 다음, 주사기와 튜브를 모두 가까운 거리로 유지하면서 시료 튜브에 주사기를 삽입하고 플런저를 원하는 부피로 끌어 올리면서 기포 또는 균질화되지 않은 고체 부품이 갇히지 않도록하십시오. 작업 와이퍼로 주사기의 끝을 청소하고 주사기를 주입 포트의 세터 캡에 삽입하십시오. 주사기의 팁이 액상 내에 있는지 확인한 후 샘플을 반응 챔버에 주입하십시오.소프트웨어 프로그램에서 주입을 표시하려면 샘플 이름 아래의 회색 상자를 클릭하여 샘플 이름을 입력 한 다음 마크 인젝션을 클릭하고 주입이 신호의 상향 또는 무세포 헤모글로빈 분석에 의한 산화 질소 소비의 하향 변화를 유발하는지 확인하십시오. 무세포 헤모글로빈과 산화질소 소비 사이의 용량 반응 관계는 심폐 바이패스 후 화학발광을 통해 측정하였다. 산화질소를 소거한 상태에서 고농도의 헴기가 있다고 가정할 수 있다.심폐 우회 중에 산화 질소를받는 환자의 경우, 대신 헴 그룹의 대다수가 감소하고 산화 질소를 섭취하지 않습니다. 무세포 헤모글로빈 농도의 측정은 심폐 우회 후 12시간 이내에 혈장으로부터 느리게 제거됨을 나타내었다. 그러나 산화 질소 소비는 15 분에서 최고조에 달했으며 무세포 헤모글로빈의 제거를 반영하지 않았습니다.무세포 헤모글로빈에 의한 산화질소 소비의 선형 회귀 곡선은 심폐 우회 후 기준선 4시간 및 12시간에서 더 감소된 헤모글로빈과는 대조적으로 15분에 산화된 산화질소 및 산화질소 소비 헤모글로빈의 유병률을 나타내었다. 산화질소 가스 투여가 산화질소 소비에 미치는 영향을 모니터링하였다. 환자가 수술 후 산화질소 가스로 치료되었을 때, 심폐 우회술 후 유리 헤모글로빈의 관찰된 증가는 산화질소 소비의 어떠한 증가와도 결합되지 않았다.결과는 외인성 산화 질소가 유리 헤모글로빈의 대부분을 감소시키고 산화 질소 소거를 예방한다는 것을 나타냈다. 실험은 모든 조건이 동일하게 유지되는 경우에만 유효합니다. 액체 수준의 높이가 반응 컬럼을 초과하면 새로운 교정을 중단하고 수행해야합니다.

chemiluminescence-based-assays-for-detection-nitric-oxide-its

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기 우리는 세포의 반응 산소 종의 존재를 테스트하고 평가하는 간단한 방법을 제안합니다.

암의 생산 및 반응 산소 종의 감지 (ROS)

질소 산화물 (NO)의 내생적인 생산은 생물 학적 기능의 다양한 조절. 그것은 어떠한 기반 시그널링의 장애 또는 dysregulation이 많은 사람이 질병에 연루되어 있는지 점점 더 분명 해지고 있습니다. 메소드는 더 이상 metabolites 인간 질병에 대한 소설 진단 또는 전조 생체 자료를 제공할 수 없습니다 관련된 계량합니다.

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

NADPH 산화 효소가 phagocytes에서 반응성 산소 종의 주요 소스 (ROS)입니다. 때문에 ROS의 임시 자연의, 그것은 생활 동물의 ROS 수준을 측정하고 모니터링하기가 어렵습니다. 생활 쥐 ROS의 일련 정량화하기위한 최소한 침입 방법 설명되어 있습니다.

다른 동물 모델에서 NADPH 산화 효소 활동의 Bioluminescence 영상

이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

이 프로토콜은 루테늄 복합체를 화학발광 발광원으로 사용하여 생체 내 이미징 중에 높은 신호 대 잡음비를 생성하는 새로운 수술 중 이미징 기술을 설명합니다. 수술 중 영상은 수술 절차가 수행되는 방식에 혁명을 일으킬 수 있는 확장 분야입니다.

생물학적 설정에서 생성 및 관측 화학 발광위한 새로운 기술

산화질소(NO)는 혈관 항상성에서 중요한 신호 분자입니다. NO in vivo 생산량은 직접 측정하기에 너무 낮습니다. 화학발광(Chemiluminescence)은 전구체와 산화 생성물인 아질산염 및 질산염을 측정하여 NO cycle에 대한 유용한 통찰력을 제공합니다. 신체 조직과 체액에서의 아질산염/질산염 측정에 대해 설명합니다.

화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

이 원고는 형광 현미경을 사용하여 단일 세포 NO• 변동을 실시간으로 모니터링하기 위해 유전적으로 인코딩된 산화질소(NO•) 프로브(geNOps)를 적용하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 개별 내피 세포 수준에서 Ca2+로 트리거된 NO• 형성은 geNOps와 화학적 Ca2+ 센서를 결합하여 시각화되었습니다.

유전자 인코딩 된 형광 산화 질소의 응용 프로그램 (• NO) 단일 세포에서 NO • 신호의 실시간 이미징을위한 프로브의 geNOps,

우리는 질산염과 아질산염의 수준을 측정하고 비교하기 위해 쥐 골격근 조직의 4 가지 근육 그룹의 균질화를위한 세 가지 다른 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 또한 조직 샘플 크기가 균질화 결과에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 다양한 샘플 가중치를 비교합니다.

질산염 및 아질산염 측정을 위한 쥐 골격근 균질액의 제조

적출된 적혈구의 단백질 활성화의 동적 변화를 포착하는 것은 추후 평가를 위해 급성 자극에 대한 동적 변화를 보존하는 것과 같은 방법론적 문제를 제기합니다. 제시된 프로토콜은 관련 단백질 변화의 보존 및 분석과 후속 검출을 가능하게 하는 샘플 준비 및 염색 기술을 설명합니다.

적혈구 단백질의 동적 변화에 대한 면역염색 기반 검출

이 프로토콜은 삼이오다이드 기반 화학발광 분석법을 이용해 위단 분비물(ALI)에서 분화된 기도 상피 배양에서 일산화질소(NO) 생성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

공기 액체 계면에서 분화된 마우스 기관 상피 세포 배양에서 질소 산화물 생성 측정

학습하세요 화학발광 기반 분석법을 이용하여 산화 질소 및 그 대사산물을 고감도로 검출하는 방법을. 이 프로토콜은 생물학적 샘플에서 미량의 산화 질소 변화를 정밀 측정하여 질병 진행과 치료 효과를 연구하는 데 활용됩니다.

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

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