코히어런트 라만 산란 이미징을 사용하여 피부 내 제약 화합물 시각화 및 정량화

이 방법론은 일관된 라만 이미징을 사용하여 국소 적용 약물 제품을 정량화하는 재현 가능하고 정확한 방법을 허용한다는 점에서 중요합니다. 다른 방법론은 부피가 큰 피부 약동학 정보를 제공하는 반면,이 방법론은 약물의 투과 경로와 같은 벌크 및 마이크로 스케일 피부 약동학 정보를 제공 할 수 있습니다. 시각화 및 정량화 및 투과 경로를 통해 특정 경로를 염두에두고 의약품을 개발하여 목표 부위에 도달 할 수 있습니다.

조직 준비는이 방법론에서 가장 어려운 부분이 될 것입니다. 조직은 피부를 통해 읽을 수 있도록 충분히 얇아야합니다. 누드 마우스 귀 피부 조직의 준비를 시작하려면 안락사 된 누드 마우스를 획득하고 포셉 및 미세 외과 용 가위를 사용하여 마우스의 귀를 제거하십시오.

그런 다음 한쪽 귀를 60 밀리미터 x 15 밀리미터 크기의 대형 페트리 접시에 넣으십시오. 다음으로, PBS로 마우스 귀를 두 번 헹구고 작업 와이퍼로 매번 귀를 두드려 말립니다. 24 시간 이내에 사용하는 경우 PBS에 귀를 섭씨 2 ~ 8도에서 35mm x 10 밀리미터 페트리 접시의 작은 접시에 넣으십시오.

수확 24 시간 후에 사용하려면 PBS가없는 페트리 접시에 귀를 넣은 다음 접시를 파라 필름으로 덮어 섭씨 영하 20 도의 냉동실에 보관하십시오. 생물학적 후드 아래에서 작업하는 동안 인간의 피부 조직을 각질층 측면이 아래를 향하게하는 큰 페트리 접시에 넣어 피하 지방에 접근 할 수 있도록하십시오. 그런 다음 포셉과 미세 외과 용 가위를 사용하여 피하 지방을 제거하십시오.

가위로 피하 지방을 더 이상 제거 할 수 없으면, 피부에 45도 각도로 10 개의 블레이드 일회용 메스를 사용하여 포셉으로 피부를 가만히 유지하면서 나머지 피하 지방을 제거하십시오. 지방이 제거되면 인간의 피부를 한 센티미터 단위로 한 센티미터 조각으로 나눕니다. 지질 이미징의 경우, 마우스 귀의 앞쪽 부분을 35밀리미터, 숫자 제로 디쉬의 유리 바닥을 향하도록 배치합니다.

인간의 피부를 위해, 각질층이 아래로 향하도록 피부를 배치하여 피상적 인 층에서 더 깊은 층으로 약물 정량화를 허용하십시오. 조직이 유리 바닥에 집중되면 면봉 팁 어플리케이터를 사용하여 피부가 평평하고 유리 바닥 접시의 커버 슬립 표면과 완전히 접촉했는지 확인하십시오. 이미징하는 동안 어떤 움직임도 방지하려면 와셔를 피부 위에 놓고 자극된 라만 산란 또는 SRS 전송 감지를 위해 와셔의 중앙 구멍을 통해 조직이 보이도록 하십시오.

미리 결정된 제형 용량을 피부에 피펫한 다음, 장갑을 낀 손가락을 사용하여 제형을 시계 방향으로 30초 동안 문지릅니다. 제형이 투과하기 위해 할당된 시간이 경과한 후, 제형 측면이 유리 바닥 디쉬를 향하도록 피부를 배치하기 전에 과량의 제형을 제거한다. 다음으로, 현미경 제어 또는 MC 소프트웨어를 켜서 실험 설정을 진행한다.

아이피스를 통해 보면 조정 노브로 축 방향 초점을 조정하여 조직이 초점 내에 있는지 확인합니다. 완료되면 펌프와 스토크스 빔의 차단을 모두 해제하고 ALG1 및 ALG2 채널이 활성화되어 있는지 확인합니다. SRS 광 다이오드가 콘덴서 위에 위치하는지 확인한 다음 MC 소프트웨어에서 초점 x2를 클릭하여 CARS 및 SRS 채널의 스킨을 시각화합니다.

다중 영역 시간 경과 또는 MATL 모듈에서 보기 탭으로 이동하여 등록된 지점 목록을 클릭하여 이미징 목록을 표시합니다. 각질층이 확인되면 축방향 초점 또는 Z-초점을 스크롤하여 특정 조직 계층화를 확인합니다. 특정 깊이는 지질 튜닝 콘트라스트를 사용한 라이브 이미징 중에 결정된 바와 같이 각질층, 피지선, 지방세포 또는 피하 지방과 같은 피부 내에 추가될 수 있다.

그러나 전체 깊이 스택을 취해야 하는 경우 XY 위치를 추가할 수 있으며 상대 Z 위치는 무시할 수 있습니다. 각 피부 계층화에 대한 특정 깊이를 이미징하는 경우 레지스터 포인트를 선택하여 MATL 큐에 추가합니다. 전체 깊이 스택의 경우 획득 매개변수 창에서 깊이 선택과 함께 각 XY 위치에 대한 점 등록을 클릭합니다.

그런 다음 MATL 모듈에서 반복 횟수를 하나로 설정하고 준비(Ready)를 클릭합니다. 재생 화살표가 회색에서 검은색으로 바뀌면 Play를 눌러 예비 지질 스택을 이미징하기 시작합니다. 이미징 사이클이 완료되면 펌프와 스토크스 빔을 모두 차단하고 레이저 그래픽 사용자 인터페이스의 파장을 목표 파수 또는 라만 진동에 따라 원하는 파장으로 변경하십시오.

수동 시간 지연 단계를 조정하면서 동일한 힘이 선험적으로 확립 된 지질 및 활성 제약 성분 또는 API를 이미지화하는 데 사용되도록하십시오. 총 사이클 반복 횟수를 선택하면 펌프 빔의 차단을 해제하고 Power가 포토다이오드를 사용하여 원하는 전력과 일치하는지 확인한 후 Play를 눌러 설정점의 자동 이미징을 시작합니다. 다음으로, 피지선 지질 이미지를 피지로 가져오고 채널 분할이라는 상자를 선택하여 파일을 CARS 및 SRS 채널로 분할하여 각 피부 계층화에 대한 데이터 분석을 수행합니다.

관심 영역 또는 ROI 관리자를 열려면 분석, 도구 및 ROI 관리자를 클릭합니다. C가 하나와 같도록 SRS 채널을 사용하여 이미지에서 피지선을 선택 해제하고 ROI 관리자에서 T 추가를 클릭하여 ROI 관리자에 표시를 추가합니다. 이미지 내의 각 피지선에 대해 이 과정을 반복합니다.

지질이 풍부한 영역을 마스킹하려면 각 ROI를 선택한 다음 추가, 결합 및 추가 탭을 클릭합니다. 지질이 부족한 영역을 마스크하려면 피지 메뉴의 사각형 도구를 사용하고 전체 이미지 주위에 사각형을 그립니다. ROI 관리자에 영역을 추가합니다.

ROI 관리자에서 지질이 풍부한 모든 영역을 선택하는 ROI 외에 새로 추가된 사각형 ROI를 클릭합니다. 자세히에서 XOR을 선택하여 지질 불량 영역의 마스크를 생성하고 ROI 관리자에 추가합니다. 이미지, 스택, 도구로 이동하여 이미지를 숫자 순서로 연결하고 탭을 순서대로 연결합니다.

또는 이미지를 피지로로드 한 다음 설치 페이지에서 비슷한 이름의 파일 그룹화라는 옵션을 선택하여 이미지를 가져옵니다. 연결된 이미지가 활성화된 상태에서 ROI 관리자로 이동하여 지질이 풍부한 영역을 선택하고 다중 측정을 선택하기 전에 자세히 탭을 클릭한 다음 결과 창이 나타날 때까지 기다립니다. 결과 창에서 데이터를 스프레드시트로 내보내고 지역이라는 제목의 열을 추가하여 지질이 풍부한 영역을 각 데이터 행에 추가합니다.

지질 밖에 있던 영역에 불량한 지질을 첨가한다. 데이터를 시각화하려면 스프레드시트를 저장하고 R 패키지인 ggplot2로 가져옵니다. 그런 다음 데이터를 이미지 수 대 평균 강도의 함수로 플롯하여 농도 시간 데이터를 추정합니다.

하나의 레이어를 호출하여 스프레드시트에서 가져온 강도 시간 데이터에 대해 RStudio에서 비구획 분석 또는 NCA를 실행합니다. 완료되면 플롯을 작성하고 Jmax 및 AUCflux-all 메트릭을 시각적으로 비교합니다. 또한 실험 조건에서 통계적 비교를 수행하십시오.

대표적인 분석은 각질층, 피지선, 지방세포, 누드 마우스 귀 피부로부터의 피하 지방, 및 인간 피부로부터의 각질층, 유두 진피 및 피지선을 묘사한다. 누드 마우스 귀 피부에서, 피지선의 제한된 조직 이동은 제형 적용 시점과 적용 후 120분에 동일한 조직 깊이의 땀샘으로 관찰되었다. 피부의 실질적인 조직 이동은 약물 적용 120 분 후에 거의 보이지 않는 피지선을 보여 주었고 원래의 프로토콜의 비효율성을 보여주었습니다.

여러 연구에서 강도 대 시간 프로파일은 초기 농도가 높았고 농도가 감소하여 약물이 조직으로 더 이상 흡수되지 않음을 나타냅니다. 반면에, 일부 연구는 나중에 실험 기간 동안 감소한 강도의 증가를 나타 냈으며, 이미징 전에 조직으로의 플럭스가 최대치에 도달하지 못했다는 것을 보여주었습니다. 동일한 API에 대한 두 제형의 농도-시간 프로파일의 NCA 분석은 에톡시에톡시에탄올이 피부층에 관계없이 겔 제형의 그것과 비교하여 확장된 API 투과를 제공한다는 것을 나타내었다.

동일한 제형 사이의 총 노출 분석은 피부의 더 깊은 층에서 유사한 관찰을 나타냈다. 인간 피부의 준비와 약물 적용 후 유리 바닥 접시에 적절한 피부 배치는 실험의 성공에 매우 중요합니다. 여기서 명확한 해결책은이 방법론의 적합성을 입증했습니다.

추가 연구에는 크림과 같은 시판 제형이 포함되어있어 제형이 API 침투 및 투과에 어떻게 영향을 미치는지 이해할 수 있습니다.