Name: 코히어런트 라만 산란 이미징을 사용하여 피부 내 제약 화합물 시각화 및 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 학습하세요 코히어런트 라만 산란 이미징을 활용한 피부 내 제약 화합물 시각화 및 정량화 방법을 인간과 마우스 피부 조직을 사용하여 재현 가능한 약물 전달 경로 분석 기술을 익히세요.

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저자들은 에반스 그룹의 Fotis Iliopoulos 박사와 Daniel Greenfield 박사에게이 원고에 대한 토론과 교정에 감사드립니다. 또한 저자는 LEO Pharma의 지원을 인정하고 싶습니다. 그림 2는 BioRender.com 로 작성되었습니다.

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<li>Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Franz+cell+diffusion+testing+andquantitative+confocal+Raman+spectroscopy%3A+In+vitro-in+vivo+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation.</a> Pharmaceutics. 12 (9), 887(2020).</li>
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<li>Bodenlenz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+flow+microperfusion+as+a+dermal+pharmacokinetic+approach+to+evaluate+topical+bioequivalence%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence.</a> Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).</li>
<li>Eirefelt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+dermal+pharmacokinetics+and+pharmacodymanic+effect+of+soft+topical+PDE4+inhibitors%3AOpen+flow+microperfusion+and+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies.</a> Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).</li>
<li>Stagni, G., O'Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iontophoretic+current+and+intradermal+microdialysis+recovery+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).</li>
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<li>Kuzma, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+local+bioavailability+of+metronidazole+from+topical+formulations+using+dermal+microdialysis%3A+Preliminary+study+in+a+Yucatan+mini-pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741(2021).</li>
<li>Begley, R., Harvey, A., Byer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.Coherent+anti-Stokes+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy.</a> Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).</li>
<li>Evans, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+tissue+in+vivo+with+video-rate+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).</li>
<li>Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li>
<li>Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantification+of+pharmacokinetics+in+skin+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning.</a> Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).</li>
<li>Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+skin+permeability+of+drugs+in+mice+and+human+cadaver+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin.</a> Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).</li>
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<li>Barbero, A. M., Frasch, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+frozen+human+epidermis+storage+duration+and+cryoprotectant+on+barrier+function+using+two+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).</li>
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<li>Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+R+packages%3A%27Non-Compart%27+and+%27ncar%27+for+noncompartmental+analysis+%28NCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+and+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA).</a> Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).</li>
</ol>

CLE는 여러 현미경 제조업체에 허가된 CARS 현미경 특허에 대한 발명가입니다. 다른 모든 저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

국소 BA / BE의 평가는 단일 방법이 생체 내 cPK를 완전히 특성화 할 수 없기 때문에 다각적 인 접근이 필요한 연구 영역입니다. 이 프로토콜은 일관된 라만 이미징을 기반으로 국소 의약품의 BA / BE를 평가하기위한 방법론을 제시합니다. 간과 될 수있는 첫 번째 포인트 중 하나는 특히 정량적 전송 SRS 이미징의 경우 피부 샘플이 얼마나 얇아야하는지입니다. 피부가 너무 두꺼우면(즉, 빛이 쉽게 통과할 수 없는 경우), SRS 검출기에 의해 측정된 신호가 거의 또는 전혀 존재하지 않으며, 따라서 불량한 농도 데이터를 제공할 것이다. 이러한 조직 샘플을 적절하게 준비하려면 실험을 만들거나 중단 할 수 있으므로주의를 기울여야합니다. 누드 마우스 귀의 관점에서, PBS로 헹구고 귀에 남아있는 먼지를 제거하기 위해 건조시키는 것 외에, 거의 준비가 필요하지 않습니다.
마우스 귀는 전형적으로 수백 μm의 두께이며, 이는 SRS 전송에 최적이다. 인간 ...

국소 약물 제품 적용 후 cPK를 평가하기위한 방법론은 고전적인 시험관 내 투과 시험 (IVPT) 연구 1,2,3,4,5 및 테이프 스트리핑 6,7,8에서 개방 유동 미세 관류 또는 피부 미세 투석과 같은 추가 방법론으로 확장되었습니다 9,10,11, 12,13,14. 관심있는 질병에 따라 치료 작용의 잠재적으로 다양한 국소 부위가 있습니다. 따라서 API가 의도 된 로컬 작업 사이트에 도달하는 속도와 범위를 평가하기위한 해당 방법론이있을 수 있습니다. 앞서 언급한 각각의 방법론에는 장점이 있지만, 가장 큰 단점은 마이크로스케일 cPK 정보가 부족하다는 것입니다(즉, API가 어디로 가고 어떻게 퍼졌는지 시각화할 수 없음).
국소 BA와 BE를 추정하기 위해 관심있는 비침습적 방법론 중 하나는 CRI이며, 이는 CARS 및 SRS 현미경의 두 가지 이미징 양식으로 나눌 수 있습니다. 이러한 일관된 라만 방법은 비선형 라만 효과를 통해 분자의 화학적으로 특이적인 이미징을 가능하게합니다. CRI에서는 두 개의 레이저 펄스 트레인이 샘플 내에서 집중되고 스캔됩니다. 레이저 주파수 사이의 에너지 차이는 관심있는 화학 구조에 특정한 진동 모드를 목표로 설정됩니다. CRI 과정은 비선형적이기 때문에, 신호는 현미경 초점에서만 생성되어, 조직의 입체 약동학적 단층 촬영 이미징을 허용한다. cPK의 맥락에서, CARS는 지질이 풍부한 피부 구조물(15)의 위치와 같은 조직 구조 정보를 획득하는데 사용되어 왔다. 대조적으로, SRS는 그 신호가 농도에 따라 선형이기 때문에 분자 농도를 정량화하는 데 활용되었습니다. 생체외 피부 표본의 경우, 에피 방향(16 )에서 CARS를 수행하고 전송 모드(17)에서 SRS를 수행하는 것이 유리하다. 따라서, 얇은 조직 샘플은 SRS 신호 검출 및 정량화를 허용할 것이다.
모델 조직으로서, 누드 마우스 귀는 사소한 단점과 함께 몇 가지 장점을 제시합니다. 한 가지 장점은 조직이 이미 두께가 ~ 200-300 μm이고 추가 샘플 준비가 필요하지 않다는 것입니다. 또한, 몇몇 피부 층화는 하나의 시야(예를 들어, 각질층, 피지선(SGs), 지방세포, 및 피하 지방)16,18을 통해 축방향으로 초점을 맞추는 것에 의해 보여진다. 이것은 인간 피부 샘플로 이동하기 전에 피부 투과 경로 및 국소 BA 추정치의 예비 전임상 추정을 허용한다. 그러나, 누드 마우스 모델은 피부 구조(19)의 차이로 인한 생체내 시나리오로의 외삽의 어려움과 같은 한계를 제시한다. 누드 마우스 귀는 예비 결과를 얻는 훌륭한 모델이지만, 인간 피부 모델은 황금 표준입니다. 생체내 투과 동역학 20,21,22를 정확하게 재분석하기 위한 동결된 인간 피부의 적합성 및 적용성에 대한 다양한 논평이 있었지만, 동결된 인간 피부의 사용은 시험관내 API 투과 동역학의 평가를 위한 수용된 방법이다23,24,25 . 이 프로토콜은 마우스와 인간의 피부의 다양한 피부층을 시각화하면서 지질이 풍부하고 지질이 부족한 구조 내의 API 농도를 정량화합니다.
CRI는 조직 내 화합물을 구체적으로 시각화하기 위해 수많은 분야에서 활용되어 왔지만 국소적으로 적용된 의약품의 cPK를 조사하는 데는 한계가 있었습니다. CRI를 사용하여 국소 제품의 국소 BA / BE를 평가하려면 먼저 정확한 비교를 위해 표준화 된 프로토콜을 마련해야합니다. 피부로의 약물 전달을 위해 CRI를 사용한 이전의 노력은 데이터 내에서 가변성을 입증하였다. 이것은 CRI의 비교적 새로운 응용 프로그램이므로 신뢰할 수있는 결과18,26,27을 얻으려면 프로토콜을 수립하는 것이 중요합니다. 이 접근법은 라만 스펙트럼의 생물학적 침묵 영역에서 하나의 특정 파형만을 표적으로 삼는다. 그러나 대부분의 API와 비활성 성분은 지문 영역 내에서 라만 이동을 가지고 있습니다. 이것은 이전에 지문 영역의 조직에서 발생하는 고유 한 신호로 인해 문제를 제기했습니다. 최근의 레이저 및 계산 발전은 이러한 장벽을 제거했으며, 이는 또한 여기에 제시된 접근법(28)과 함께 활용 될 수 있습니다. 여기에 제시된이 접근법은 침묵 영역 (2,000-2,300 cm-1)에서 라만 시프트가있는 API의 정량화를 허용합니다. 이는 약물의 물리화학적 특성에 한정되지 않으며, 이는 앞서 언급한 일부 cPK 모니터링 방법론(29)의 경우일 수 있다.
이 프로토콜은 두꺼운 인간 피부 샘플이 두꺼운 샘플에 의한 광산란으로 인해 약물 제품 적용 후 최소한의 신호를 생성하기 때문에 다양한 제제에 대한 피부 두께의 샘플 대 샘플 변동성을 줄여야합니다. 이 원고의 목표는 재현 가능한 이미징 표준을 보장하는 조직 준비 방법론을 제시하는 것입니다. 또한, CRI 시스템은 잠재적인 오류 소스를 줄이고 신호 대 잡음을 최소화하기 위해 설명된 대로 설정됩니다. 그러나이 논문은 CRI 현미경의 지침 원칙 및 기술적 장점에 대해 논의하지 않을 것입니다 이것은 이전에 다루었 기 때문에30. 마지막으로, 실험의 성공 또는 실패를 결정하기 위해 결과를 해석 할 수 있도록 광범위한 데이터 분석 절차를 탐구합니다.

<table><tbody><tr><td>Tissue Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclavable Biohazard Bags</td><td>FisherBrand</td><td>22-044562</td><td>텍스트에서 언급 한대로: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562& 검색 유형 = RAPID & matchedCatNo=22044562</td></tr><tr><td>세포 배양 완충액: Dulbecco의 인산염 완충 염 용액 1x</td><td>Corning</td><td>MT21030CV</td><td>텍스트에서 참조: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& 검색 유형= RAPID& matchedCatNo=21-030-cv</td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>Exel International</td><td>14-840-00</td><td>텍스트에서 참조된 대로: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true</td></tr><tr><td>고정밀 45&deg; 앵글 브로드 포인트 핀셋 / 집게</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-132</td><td>텍스트에서 언급 한대로 : forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=</td></tr><tr><td>Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼, 1-Ply</td><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science</td><td>06-666</td><td>본문에 언급된 바와 같이: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666</td></tr><tr><td>Parafilm M Laboratory Wrapping Film</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td>본문에 언급된 바와 같이: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412</td></tr><tr><td>Petri Dish (35 mm x 10 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875711YZ</td><td>본문에 언급된 바와 같이: 작은 페트리 접시 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true</td></tr><tr><td>페트리 접시 (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875713A</td><td>본문에 언급된 바와 같이: 큰 페트리 접시 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true</td></tr><tr><td>외과용 가위</td><td>Roboz</td><td>NC9411473</td><td>텍스트에서 언급 한대로: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& 검색 유형 = RAPID & matchedCatNo=RS-5915SC</td></tr><tr><td>Laser/microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter</td><td>Semrock</td><td></td><td>텍스트에서 언급 : CARS 필터 - CH2 진동 (645nm / 60nm 필터)</td></tr><tr><td>컨트롤 박스 IX2-UCB</td><td>올림푸스</td><td></td><td>텍스트에서 언급 : 컨트롤 박스</td></tr><tr><td>D700 / 30m</td><td>Chroma</td><td></td><td>텍스트에서 언급 : CARS 필터 - 중수소 대역 < > https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m</td></tr><tr><td>DeepSee Insight</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>텍스트에서 언급 : Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser</td></tr><tr><td>Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>본문에서 언급 : power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td></tr><tr><td>Fluoview 소프트웨어</td><td>올림푸스</td><td></td><td>본문에서 언급 : 현미경 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>서리 낀 현미경 슬라이드</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>본문에서 언급 : microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446</td></tr><tr><td>FV1000</td><td>올림푸스</td><td></td><td>텍스트에서 언급 : 현미경</td></tr><tr><td>배양 챔버</td><td>Tokai Hit</td><td>GM-800</td><td>텍스트에서 언급 : 인큐베이션 챔버</td></tr><tr><td>통합 구 광 다이오드 전력 센서</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>텍스트에서 언급 : photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td></tr><tr><td>전원 공급 장치 FV31-PSU</td><td>올림푸스</td><td></td><td>본문에서 언급 된 바와 같이: Power Supply</td></tr><tr><td>Precision 4063, 80MHz 이중 채널 함수 발생기</td><td>BK 정밀도</td><td></td><td>본문에서 언급 된대로 : 함수 발생기</td></tr><tr><td>ProScan &ndash; 정밀 현미경 자동화</td><td>이전 과학 기기</td><td></td><td>텍스트에서 참조: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation</td></tr><tr><td>SecureSeal Imaging Spacers</td><td>Grace Biolabs</td><td>654004</td><td>텍스트에서 참조: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/</td></tr><tr><td>SRS 탐지 키트</td><td>APE</td><td></td><td>텍스트에서 언급된 대로: SRS 검출기</td></tr><tr><td>UPLSAPO 20X NA:0.75</td><td>Olympus</td><td></td><td>텍스트에서 언급된 대로: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/</td></tr><tr><td>Lipid/Drug Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 35mm 접시, No. 0 코팅되지 않은 커버 슬립, 14mm 유리 직경</td><td>MatTek Corporation</td><td>NC9711297</td><td>텍스트에 언급 된 바와 같이 : 유리 바닥 접시 https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297</td></tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>텍스트에 언급 된 바와 같이: 코튼 팁 애플리케이터</td></tr><tr><td>Distriman 포지티브 변위 피펫</td><td>Gilson</td><td></td><td>본문에서 언급 한 바와 같이 : Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=</td></tr><tr><td>Distriman Postive Displacement Pipette Tips</td><td>Gilson</td><td></td><td>본문에서 언급 된 바와 같이: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true</td></tr><tr><td>Data Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>오픈 소스</td><td></td><td>텍스트에서 참조: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>Jupyter-Lab</td><td>오픈 소스</td><td></td><td>텍스트에서 참조: JupyterLab https://jupyter.org/</td></tr> <tr><td>Rstudio</td><td>오픈 소스</td><td></td><td>텍스트에서 참조: Rstudio https://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

코히어런트 라만 산란 이미징을 사용하여 피부 내 제약 화합물 시각화 및 정량화

Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging

국소 제형 적용 후의 피부 약동학 (cPK)은 국소 생체 이용률 (BA)을 기계적으로 이해하기 위해 규제 및 약물 개발 과학자들에게 특히 관심이있는 연구 분야였습니다. 테이프 스트리핑, 진피 미세투석, 또는 진피 개방 유동 미세관류와 같은 반침습적 기술은 모두 매크로스케일 cPK를 정량화한다. 이러한 기술은 방대한 cPK 지식을 제공했지만 커뮤니티는 활성 제약 성분 (API) 침투 및 세포 수준에서의 투과에 대한 기계론적 이해가 부족합니다. 
마이크로 스케일 cPK를 다루기 위한 한 가지 비침습적 접근법은 외인성 라벨이나 화학적 변형 없이 내재적 분자 진동을 선택적으로 표적으로 하는 코히어런트 라만 산란 영상(CRI)이다. CRI에는 API 또는 비활성 성분의 민감하고 선택적인 정량화를 가능하게 하는 두 가지 주요 방법인 일관된 안티스토크스 라만 산란(CARS)과 자극된 라만 산란(SRS)이 있습니다. CARS는 일반적으로 구조적 피부 정보를 도출하거나 화학적 대조를 시각화하는 데 사용됩니다. 대조적으로, 분자 농도와 선형인 SRS 신호는 피부 층화 내의 API 또는 비활성 성분을 정량화하는 데 사용된다. 
마우스 조직이 CRI를 갖는 cPK에 대해 일반적으로 활용되었지만, 국소 BA 및 생물학적 동등성 (BE)은 궁극적으로 규제 승인 전에 인간 조직에서 평가되어야합니다. 이 논문은 국소 BA 및 BE의 평가에서 정량적 약동학적 CRI 연구에 사용되는 생체외 피부를 제조하고 이미지화하는 방법론을 제시한다. 이 방법론은 시간이 지남에 따라 인간과 마우스 피부 내에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 API 정량화를 가능하게합니다. 지질이 풍부하고 지질이 부족한 구획 내의 농도뿐만 아니라 시간에 따른 총 API 농도가 정량화됩니다. 이들은 마이크로 및 매크로 스케일 BA의 추정에 활용되며, 잠재적으로 BE입니다.

이미징은 실험 완료 시 조직이 축방향(<10μm) 또는 횡방향으로 유의하게 이동하지 않은 경우 성공적인 것으로 간주됩니다(그림 4). 이는 관심 있는 API에 대한 SRS 측정이 정량화가 계층별 초기 깊이를 나타내지 않는 경우 즉각적인 표시입니다. 이는 관심 있는 각 XY 위치에 대해 z-스택을 이미징하여 완화되며, 트레이드오프는 시간 해상도입니다. 냉동 피부가 이러한 연구에 사용되는 경우, API의 침투 및 투과는 신선한 피부에 비해 빠르며, 제형 적용과 이미징 시작 사이의 최소 시간이 필수적입니다. 또 다른 고려 사항은 실험에 사용 된 목표입니다. 60x 목표를 사용하는 경우 단일 시야각(FOV) 내에서 평평한 표면을 선택하는 것이 비교적 쉽습니다. 그러나, 20x 목표의 경우, 전망 필드가 훨씬 더 크고, 따라서, 조직 준비의 핵심 단계는 유리바닥 이미징 접시와 피부의 균일한 접촉을 보장하는 것이다. FOV 내의 원래 깊이와 비교하여 평평한 FOV와 유사한 깊이는 긍정적...

피부 내의 제약 화합물을 시각화하고 정량화하기 위한 일관된 라만 산란 영상화 방법론이 기재되어 있다. 이 논문은 피부 조직 제제 (인간 및 마우스) 및 국소 제형 적용, 시공간 농도 프로파일을 정량화하기위한 이미지 획득 및 국소 약물 전달을 평가하기위한 예비 약동학 분석에 대해 설명합니다.

Cutaneous pharmacokinetics (cPK) after topical formulation application has been a research area of particular interest for regulatory and drug development ...

이 방법론은 일관된 라만 이미징을 사용하여 국소 적용 약물 제품을 정량화하는 재현 가능하고 정확한 방법을 허용한다는 점에서 중요합니다. 다른 방법론은 부피가 큰 피부 약동학 정보를 제공하는 반면,이 방법론은 약물의 투과 경로와 같은 벌크 및 마이크로 스케일 피부 약동학 정보를 제공 할 수 있습니다. 시각화 및 정량화 및 투과 경로를 통해 특정 경로를 염두에두고 의약품을 개발하여 목표 부위에 도달 할 수 있습니다.조직 준비는이 방법론에서 가장 어려운 부분이 될 것입니다. 조직은 피부를 통해 읽을 수 있도록 충분히 얇아야합니다. 누드 마우스 귀 피부 조직의 준비를 시작하려면 안락사 된 누드 마우스를 획득하고 포셉 및 미세 외과 용 가위를 사용하여 마우스의 귀를 제거하십시오.그런 다음 한쪽 귀를 60 밀리미터 x 15 밀리미터 크기의 대형 페트리 접시에 넣으십시오. 다음으로, PBS로 마우스 귀를 두 번 헹구고 작업 와이퍼로 매번 귀를 두드려 말립니다. 24 시간 이내에 사용하는 경우 PBS에 귀를 섭씨 2 ~ 8도에서 35mm x 10 밀리미터 페트리 접시의 작은 접시에 넣으십시오.수확 24 시간 후에 사용하려면 PBS가없는 페트리 접시에 귀를 넣은 다음 접시를 파라 필름으로 덮어 섭씨 영하 20 도의 냉동실에 보관하십시오. 생물학적 후드 아래에서 작업하는 동안 인간의 피부 조직을 각질층 측면이 아래를 향하게하는 큰 페트리 접시에 넣어 피하 지방에 접근 할 수 있도록하십시오. 그런 다음 포셉과 미세 외과 용 가위를 사용하여 피하 지방을 제거하십시오.가위로 피하 지방을 더 이상 제거 할 수 없으면, 피부에 45도 각도로 10 개의 블레이드 일회용 메스를 사용하여 포셉으로 피부를 가만히 유지하면서 나머지 피하 지방을 제거하십시오. 지방이 제거되면 인간의 피부를 한 센티미터 단위로 한 센티미터 조각으로 나눕니다. 지질 이미징의 경우, 마우스 귀의 앞쪽 부분을 35밀리미터, 숫자 제로 디쉬의 유리 바닥을 향하도록 배치합니다.인간의 피부를 위해, 각질층이 아래로 향하도록 피부를 배치하여 피상적 인 층에서 더 깊은 층으로 약물 정량화를 허용하십시오. 조직이 유리 바닥에 집중되면 면봉 팁 어플리케이터를 사용하여 피부가 평평하고 유리 바닥 접시의 커버 슬립 표면과 완전히 접촉했는지 확인하십시오. 이미징하는 동안 어떤 움직임도 방지하려면 와셔를 피부 위에 놓고 자극된 라만 산란 또는 SRS 전송 감지를 위해 와셔의 중앙 구멍을 통해 조직이 보이도록 하십시오.미리 결정된 제형 용량을 피부에 피펫한 다음, 장갑을 낀 손가락을 사용하여 제형을 시계 방향으로 30초 동안 문지릅니다. 제형이 투과하기 위해 할당된 시간이 경과한 후, 제형 측면이 유리 바닥 디쉬를 향하도록 피부를 배치하기 전에 과량의 제형을 제거한다. 다음으로, 현미경 제어 또는 MC 소프트웨어를 켜서 실험 설정을 진행한다.아이피스를 통해 보면 조정 노브로 축 방향 초점을 조정하여 조직이 초점 내에 있는지 확인합니다. 완료되면 펌프와 스토크스 빔의 차단을 모두 해제하고 ALG1 및 ALG2 채널이 활성화되어 있는지 확인합니다. SRS 광 다이오드가 콘덴서 위에 위치하는지 확인한 다음 MC 소프트웨어에서 초점 x2를 클릭하여 CARS 및 SRS 채널의 스킨을 시각화합니다.다중 영역 시간 경과 또는 MATL 모듈에서 보기 탭으로 이동하여 등록된 지점 목록을 클릭하여 이미징 목록을 표시합니다. 각질층이 확인되면 축방향 초점 또는 Z-초점을 스크롤하여 특정 조직 계층화를 확인합니다. 특정 깊이는 지질 튜닝 콘트라스트를 사용한 라이브 이미징 중에 결정된 바와 같이 각질층, 피지선, 지방세포 또는 피하 지방과 같은 피부 내에 추가될 수 있다.그러나 전체 깊이 스택을 취해야 하는 경우 XY 위치를 추가할 수 있으며 상대 Z 위치는 무시할 수 있습니다. 각 피부 계층화에 대한 특정 깊이를 이미징하는 경우 레지스터 포인트를 선택하여 MATL 큐에 추가합니다. 전체 깊이 스택의 경우 획득 매개변수 창에서 깊이 선택과 함께 각 XY 위치에 대한 점 등록을 클릭합니다.그런 다음 MATL 모듈에서 반복 횟수를 하나로 설정하고 준비(Ready)를 클릭합니다. 재생 화살표가 회색에서 검은색으로 바뀌면 Play를 눌러 예비 지질 스택을 이미징하기 시작합니다. 이미징 사이클이 완료되면 펌프와 스토크스 빔을 모두 차단하고 레이저 그래픽 사용자 인터페이스의 파장을 목표 파수 또는 라만 진동에 따라 원하는 파장으로 변경하십시오.수동 시간 지연 단계를 조정하면서 동일한 힘이 선험적으로 확립 된 지질 및 활성 제약 성분 또는 API를 이미지화하는 데 사용되도록하십시오. 총 사이클 반복 횟수를 선택하면 펌프 빔의 차단을 해제하고 Power가 포토다이오드를 사용하여 원하는 전력과 일치하는지 확인한 후 Play를 눌러 설정점의 자동 이미징을 시작합니다. 다음으로, 피지선 지질 이미지를 피지로 가져오고 채널 분할이라는 상자를 선택하여 파일을 CARS 및 SRS 채널로 분할하여 각 피부 계층화에 대한 데이터 분석을 수행합니다.관심 영역 또는 ROI 관리자를 열려면 분석, 도구 및 ROI 관리자를 클릭합니다. C가 하나와 같도록 SRS 채널을 사용하여 이미지에서 피지선을 선택 해제하고 ROI 관리자에서 T 추가를 클릭하여 ROI 관리자에 표시를 추가합니다. 이미지 내의 각 피지선에 대해 이 과정을 반복합니다.지질이 풍부한 영역을 마스킹하려면 각 ROI를 선택한 다음 추가, 결합 및 추가 탭을 클릭합니다. 지질이 부족한 영역을 마스크하려면 피지 메뉴의 사각형 도구를 사용하고 전체 이미지 주위에 사각형을 그립니다. ROI 관리자에 영역을 추가합니다.ROI 관리자에서 지질이 풍부한 모든 영역을 선택하는 ROI 외에 새로 추가된 사각형 ROI를 클릭합니다. 자세히에서 XOR을 선택하여 지질 불량 영역의 마스크를 생성하고 ROI 관리자에 추가합니다. 이미지, 스택, 도구로 이동하여 이미지를 숫자 순서로 연결하고 탭을 순서대로 연결합니다.또는 이미지를 피지로로드 한 다음 설치 페이지에서 비슷한 이름의 파일 그룹화라는 옵션을 선택하여 이미지를 가져옵니다. 연결된 이미지가 활성화된 상태에서 ROI 관리자로 이동하여 지질이 풍부한 영역을 선택하고 다중 측정을 선택하기 전에 자세히 탭을 클릭한 다음 결과 창이 나타날 때까지 기다립니다. 결과 창에서 데이터를 스프레드시트로 내보내고 지역이라는 제목의 열을 추가하여 지질이 풍부한 영역을 각 데이터 행에 추가합니다.지질 밖에 있던 영역에 불량한 지질을 첨가한다. 데이터를 시각화하려면 스프레드시트를 저장하고 R 패키지인 ggplot2로 가져옵니다. 그런 다음 데이터를 이미지 수 대 평균 강도의 함수로 플롯하여 농도 시간 데이터를 추정합니다.하나의 레이어를 호출하여 스프레드시트에서 가져온 강도 시간 데이터에 대해 RStudio에서 비구획 분석 또는 NCA를 실행합니다. 완료되면 플롯을 작성하고 Jmax 및 AUCflux-all 메트릭을 시각적으로 비교합니다. 또한 실험 조건에서 통계적 비교를 수행하십시오.대표적인 분석은 각질층, 피지선, 지방세포, 누드 마우스 귀 피부로부터의 피하 지방, 및 인간 피부로부터의 각질층, 유두 진피 및 피지선을 묘사한다. 누드 마우스 귀 피부에서, 피지선의 제한된 조직 이동은 제형 적용 시점과 적용 후 120분에 동일한 조직 깊이의 땀샘으로 관찰되었다. 피부의 실질적인 조직 이동은 약물 적용 120 분 후에 거의 보이지 않는 피지선을 보여 주었고 원래의 프로토콜의 비효율성을 보여주었습니다.여러 연구에서 강도 대 시간 프로파일은 초기 농도가 높았고 농도가 감소하여 약물이 조직으로 더 이상 흡수되지 않음을 나타냅니다. 반면에, 일부 연구는 나중에 실험 기간 동안 감소한 강도의 증가를 나타 냈으며, 이미징 전에 조직으로의 플럭스가 최대치에 도달하지 못했다는 것을 보여주었습니다. 동일한 API에 대한 두 제형의 농도-시간 프로파일의 NCA 분석은 에톡시에톡시에탄올이 피부층에 관계없이 겔 제형의 그것과 비교하여 확장된 API 투과를 제공한다는 것을 나타내었다.동일한 제형 사이의 총 노출 분석은 피부의 더 깊은 층에서 유사한 관찰을 나타냈다. 인간 피부의 준비와 약물 적용 후 유리 바닥 접시에 적절한 피부 배치는 실험의 성공에 매우 중요합니다. 여기서 명확한 해결책은이 방법론의 적합성을 입증했습니다.추가 연구에는 크림과 같은 시판 제형이 포함되어있어 제형이 API 침투 및 투과에 어떻게 영향을 미치는지 이해할 수 있습니다.

visualizing-quantifying-pharmaceutical-compounds-within-skin-using

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging(Coherent 라만 산란 이미징을 사용한 피부 내 제약 화합물 시각화 및 정량화)

세 단일 파장 짧은 펄스 레이저의 조합 일관된 안티 - 스톡 래맨 산란 (자동차)과 이중 - 공진 자동차 (DR - 자동차)를 생성하는 데 사용됩니다. 이러한 신호의 차이점은 약한 래맨 scatterers의 이미징을함으로써 일관된 래맨 신호를 감지 않으면 어려운위한 향상된 감도를 제공합니다.

이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경은 현장과 용해를받은 의약품 정제의 표면을 실시간으로 시각화 수 있도록 고유의 흐름을 통해 용해 설정과 결합됩니다. 이 사용자 정의 - 기본 설정을 사용하여, 인라인 UV 흡수 분광법을 사용하여 촬영 한 약물 용출 프로파일을 가진 차 비디오의 상관 관계를 할 수 있습니다.

해산 동안 일관된 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 시각화 제약 정제

분자 결합의 고유 진동에 따라 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 레이블없는 화학적으로 선택적 라이브 세포 이미징을 허용합니다. 사파이어 레이저와 OPO 레이저 본 작업은 펨토초의 Ti에 기초한 표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 상보 현미경 기술의 구현을 제공한다.

사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현

이 원고에서, 레이저 스캐닝 현미경과 SRS 실험 설정의 통합에 의해 얻어진 자극된 라만 산란(SRS) 현미경의 구현이 설명된다. SRS 현미경은 두 개의 펨토초(fs) 레이저 소스, Ti-Sapphire(Ti:Sa) 및 동기화된 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 기반으로 합니다.

자극된 라만 산란을 기반으로 한 비선형 현미경 구현

여기에서, 우리는 스펙트럼 이상치 제거및 주요 특징의 연속적인 추출을 위한 화학측정 접근과 결합된 임상 연구에서 인간 적인 과목에서 공초점 라만 스펙트럼의 수집을 위한 프로토콜을 제시합니다.

화학 측정 접근을 통해 지층 각막의 생체 내 공초점 라만 스펙트럼에서 물, 단백질 및 지질을 해결

자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

우리는 광대역 자극 라만 산란 (SRS) 현미경으로 화학 이미지를 획득하기위한 프로토콜을 제시합니다. 차등 다중 채널 잠금 검출로 작동하는 SRS 현미경을 기반으로 하는 프로토콜은 시료 준비, SRS 장치의 조정 및 화학적으로 이질적인 샘플의 서로 다른 구성 요소를 분리하기 위한 화학측정법을 설명합니다.

광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

이 연구는 비선형 광학 분광법 및 질량 분광 이미징을 사용하여 연조직 내 약물의 상관 이미징 방법을 제시합니다. 고해상도 피부 이미징과 민감한 약물 검출을 결합하면 피부 내 약물 분포를 연구할 수 있는 유용한 접근 방식을 얻을 수 있으며, 이는 우수한 국소 제품 개발에 매우 중요합니다.

Correlative Optical Spectroscopy 및 Mass Spectrometry Imaging methodology를 통해 연조직 절편에서의 약물 분포를 시각화합니다.

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

학습하세요 코히어런트 라만 산란 이미징을 활용한 피부 내 제약 화합물 시각화 및 정량화 방법을 인간과 마우스 피부 조직을 사용하여 재현 가능한 약물 전달 경로 분석 기술을 익히세요.

코히어런트 라만 산란 이미징을 사용하여 피부 내 제약 화합물 시각화 및 정량화

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