Name: 뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일의 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세 해부 기반 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 학습하세요 레이저 미세 해부와 LC-MS/MS를 활용한 뉴로멜라닌 과립 단백질체 분석 프로토콜입니다. 인간 사후 흑색질 조직에서 1,898개 단백질 군을 식별하여 신경 질환 기전 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 de에 의해 지원되었습니다. NBI, 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) (보조금 번호 FKZ 031 A 534A) 및 P.U.R.E. (유럽 내 단백질 연구 단위 Ruhr) 및 단백질 진단 센터 (ProDi) 보조금, 둘 다 독일 노르트라인 베스트팔렌의 혁신, 과학 및 연구부.

<ol><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+profiling+of+spermatozoa+by+laser+capture+microdissection+and+low+volume-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR.</a> PloS One. 6 (8), 22316(2011).</li>
<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li>
<li>Eggers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+fiber+type-specific+protein+profiles+derived+from+adult+murine+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomes%22%5BJournal%5D)">Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle.</a> Proteomes. 9 (2), 28(2021).</li>
<li>Kley, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+laser+microdissection+and+mass+spectrometry+approach+reveals+new+disease+relevant+proteins+accumulating+in+aggregates+of+filaminopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).</li>
<li>Güttsches, A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+rimmed+vacuoles+define+new+risk+allele+in+inclusion+body+myositis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis.</a> Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).</li>
<li>Bogerts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brainstem+atlas+of+catecholaminergic+neurons+in+man%2C+using+melanin+as+a+natural+marker%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker.</a> The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Engelen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanins+of+human+brain+have+soluble+and+insoluble+components+with+dolichols+attached+to+the+melanic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure.</a> PloS One. 7 (11), 48490(2012).</li>
<li>Duffy, P. E., Tennyson, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+electron+microscopic+observations+of+lewy+bodies+and+melanin+granules+in+the+substantia+nigra+and+locus+caeruleus+in+parkinson%CA%BCs+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).</li>
<li>Zecca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+human+substantia+nigra+neuromelanin+with+lipids+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides.</a> Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).</li>
<li>Fenichel, G. M., Bazelon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+neuromelanin.+II.+Melanin+in+the+brainstems+of+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children.</a> Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).</li>
<li>Halliday, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+specific+phases+in+the+development+of+human+neuromelanin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Transmission%22%5BJournal%5D)">Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin.</a> Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).</li>
<li>Zucca, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+iron%2C+dopamine+and+neuromelanin+pathways+in+brain+aging+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease.</a> Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).</li>
<li>Carballo-Carbajal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tyrosinase+overexpression+implicates+age-dependent+neuromelanin+production+in+Parkinson%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis.</a> Nature Communications. 10 (1), 973(2019).</li>
<li>Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanin+of+the+substantia+nigra%3A+a+neuronal+black+hole+with+protective+and+toxic+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics.</a> Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).</li>
<li>Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neurochemical+mechanisms+in+PD+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis.</a> Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).</li>
<li>Zecca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanin+can+protect+against+iron-mediated+oxidative+damage+in+system+modeling+iron+overload+of+brain+aging+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease.</a> Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).</li>
<li>Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+a+synthetic+neuromelanin+on+yield+of+free+hydroxyl+radicals+generated+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).</li>
<li>Karlsson, O., Lindquist, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanin+affinity+and+its+possible+role+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+transmission%22%5BJournal%5D)">Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration.</a> Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).</li>
<li>Marsden, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigmentation+in+the+nucleus+substantiae+nigrae+of+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals.</a> Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).</li>
<li>Tribl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BSubcellular+proteomics%26%2334%3B+of+neuromelanin+granules+isolated+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">34;Subcellular proteomics&#34; of neuromelanin granules isolated from the human brain.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).</li>
<li>Zucca, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanin+organelles+are+specialized+autolysosomes+that+accumulate+undegraded+proteins+and+lipids+in+aging+human+brain+and+are+likely+involved+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 17(2018).</li>
<li>Plum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+neuromelanin+granules+isolated+from+human+substantia+nigra+by+laser-microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection.</a> Scientific Reports. 6, 37139(2016).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+quantitation+of+proteins+from+small+pools+of+developing+auditory+and+vestibular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells.</a> Scientific Data. 5, 180128(2018).</li>
<li>Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html">https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html</a> (2007).</li>
<li>Plum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+enrichment+of+neuromelanin+granules+and+synaptosomes+from+human+substantia+nigra+pars+compacta+tissue+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis.</a> Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

LMD는 특정 조직 영역, 단일 세포 또는 세포 내 구조의 분리에 널리 적용 가능한 기술입니다. 여기에 제시된 개정되고 자동화 된 프로토콜에서이 기술은 신경 멜라닌 과립 (NMG) 및 NMG 주변 조직 (SN)의 특정 분리에 적용됩니다. 지금까지 인간 사후 뇌 조직에서 NMG를 분리하기위한 두 가지 접근법이 발표되어 널리 사용되었습니다.
a) 흑질 질 조직 1g을 소비하는 불연속 자당 구배20. 인간 사후 흑질 조직은 드물고 여러 연구 질문에 대한 관심이 높기 때문에 불행히도 환자 당 많은 양의 조직이 필요한 경우 대규모 코호트 연구를 설정하는 것이 매우 어렵습니다. 따라서, 이러한 접근법은 NMGs26의 충분한 단리를 위해 필요한 조직 양을 0.15 g으로 감소시키는 것을 더욱 개선하였다. 그러나 여전히 완전한 실질적 흑질 의 절...

모든 조직은 서로 다른 세포 유형의 이질적인 혼합물로 구성되지만 한 세포 유형의 특정 분리는 종종 보다 정확한 특성 분석을 위해 필수적입니다. 현미경과 레이저 응용 분야를 결합하는 레이저 미세 해부(LMD)는 복잡한 복합재에서 조직 영역, 단일 세포 또는 세포 하부 구조를 특이적으로 분리하기 위한 강력한 도구입니다. 질량분석법(LMD-MS)과 LMD의 조합의 적용은 DNA1, RNA2 및 단백질 3,4,5의 분리를 포함한 여러 연구 질문에 대해 이미 성공적으로 구현되었습니다. 이 프로토콜에서는 파킨슨병의 새로운 병리 메커니즘을 해독하기 위해 인간 사후 뇌 조직 및 세포 하위 구성 요소의 단백질체 분석을 위해 수정되고 최적화된 LMD-MS 프로토콜에 대해 설명합니다.
뉴로멜라닌은 흑질의 카테콜아민성, 도파민 생성 뉴런에서 발견되는 거의 녹지 않는 검은색 색소입니다. 단백질 및 지질과 함께 신경 멜라닌 과립 (NMG)이라고하는 이중 막으로 둘러싸인 세포 기관 유사 과립에 축적됩니다.7,8,9. NMG는 노화 과정 동안 양과 밀도가 증가하는 인간에서 3 세부터 관찰 할 수 있습니다10,11. 현재까지 뉴로멜라닌 형성에 대한 명확한 가설은 없지만, 한 가지 가정은 뉴로멜라닌이 도파민12의 산화를 통해 형성된다는 것입니다. 다른 가설은 뉴로멜라닌(예: 티로시나제)의 효소적 생산을 기반으로 합니다.13. 뉴로멜라닌 자체는 지질, 독소, 금속 이온 및 살충제에 대한 높은 결합 친화력을 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 발견을 바탕으로, NMGs의 형성은 독성 및 산화 물질의 축적 및 환경 독소(14,15)로부터 세포를 보호하는 것으로 가정된다. 이러한 신경 보호 기능 외에도, 뉴멜라닌이 예를 들어, 철 포화 및 자유 라디칼의 후속 촉매 작용에 의해 신경퇴행성 효과를 일으킬 수 있다는 증거가 있다16,17. 또한, 신경 퇴행성 과정에서 방출 된 신경 멜라닌은 과산화수소에 의해 분해 될 수 있으며, 이는 이전에 신경 멜라닌에 결합 된 반응성 금속 및 기타 독성 화합물에 의한 괴사를 가속화 할 수 있으며 신경 염증 및 세포 손상에 기여할 수 있습니다18. 그러나 지금까지 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 과정에서 NMG의 정확한 역할은 명확하게 이해되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 NMG는 파킨슨 병의 발병 기전에 관여하는 것으로 보이며 신경 퇴행에서 NMG의 역할을 밝히기 위해서는 구체적인 분석이 가장 중요합니다. 불행하게도, 일반적인 실험실 동물 (예를 들어, 마우스 및 래트) 및 세포주에는 NMGs19가 부족합니다. 따라서 연구자들은 특히 분석을 위해 사후 뇌 조직에 의존합니다. 과거에, 밀도 구배 원심분리에 의한 NMG 분리는 다량의 흑질질 조직20,21의 가용성에 의존하였다. 오늘날 LMD는 인간의 뇌 샘플에서 NMG를 구체적으로 분리한 다음 LC-MS/MS로 분석하는 다목적 도구를 제공합니다.
이 프로토콜에서, NMG 및 주변 조직(SN)의 분리를 위해 이전 프로토콜(22 )의 개선되고 자동화된 버전이 제시되어, 더 빠른 샘플 생성, 더 많은 수의 확인 및 정량화된 단백질, 및 필요한 조직 양의 심각한 감소를 가능하게 한다.

<table><tbody><tr><td>1,4-디티오트레이톨</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Merck</td><td>1.00029.2500</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>시그마-알드리치</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>요오드아세트아미드</td><td>AppliChem</td><td>A1666,0100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브 500</td><td>칼 자이스</td><td>415190-9221-000</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량분석기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPfadbmbhq</td><td></td></tr><tr><td>PALM MicroBeam</td><td>Zeiss</td><td>494800-0014-000</td><td></td></tr><tr><td>PEN 멤브레인 슬라이드</td><td>Carl Zeiss</td><td>415190-9041-000<</td><td></td></tr><tr><td>em>substantia nigra pars compacta tissue slices</td><td>Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>Merck</td><td>91707</td><td></td></tr><tr><td>트립신 염기서열분석 등급</td><td>Serva</td><td>37283.01</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 RSLC nano LC 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 이름</td><td>Weblink/Company</td><td>Version</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1.6</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>https://www.maxquant.org/</td> <td>1.6.17.0</td><td></td></tr><tr><td>PALMRobo</td><td>Zeiss</td><td>4.6 pro</td><td></td></tr><tr><td>Perseus</td><td>https://www.maxquant.org/perseus/</td> <td>1.6.15.0</td><td></td></tr><tr><td>Skyline</td><td></td><td>https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view 20.2.0.343</td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>4.3</td><td></td></tr></tbody></table>

뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일의 lc-ms/ms 분석을 위한 레이저 미세 해부 기반 프로토콜

Laser Microdissection-Based Protocol for the LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules

뉴로멜라닌은 흑질의 도파민성 뉴런에 있는 소위 뉴로멜라닌 과립(NMG)에 존재하는 흑갈색 색소입니다. 뉴로멜라닌 외에도 NMG에는 다양한 단백질, 지질 및 금속이 포함되어 있습니다. NMG 함유 도파민 성 뉴런은 파킨슨 병 및 Lewy 시체가있는 치매와 같은 신경 퇴행성 질환에서 우선적으로 손실되지만 NMG 형성 메커니즘과 건강 및 질병에서 NMG의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 따라서 NMG의 분자 특성화에 대한 추가 연구가 필수적입니다. 불행하게도, 단백질 분리를 위한 표준 프로토콜은 밀도 구배 초원심분리를 기반으로 하므로 많은 양의 인간 조직이 필요합니다. 따라서 자동 레이저 미세 해부 (LMD) 기반 프로토콜이 여기에 설정되어 편향되지 않고 자동화 된 방식으로 최소량의 조직을 사용하여 NMG 및 주변 흑질 (SN) 조직을 수집 할 수 있습니다. 절제된 샘플은 이후 질량분석법으로 분석하여 단백질체 구성을 해독합니다. 이 워크플로우를 통해 2,079개의 단백질이 확인되었으며 그 중 514개의 단백질이 NMG에서, 181개의 단백질이 SN에서 독점적으로 확인되었습니다. 현재 결과는 두 프로테옴에 대해 87.6%의 중복에 도달하는 유사한 LMD 기반 접근 방식을 사용한 이전 연구와 비교하여 여기에 제시된 수정 및 최적화된 프로토콜의 적용 가능성을 검증했습니다. 현재 결과를 검증하기 위해 관심 단백질을 표적 질량 분석법(예: 병렬 반응 모니터링(PRM) 실험)으로 분석했습니다.

NMG와 SN 조직의 특이적 분리는 이 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 가장 중요한 단계입니다. LMD의 공급업체 제공 소프트웨어에서 시야 분석 기능을 사용하면 NMG를 색상에 따라 자동으로 선택할 수 있습니다. 따라서 NMG가 포함 된 조직 영역 (그림 2A)을 식별하고 조정 된 색상 임계 값으로 시야 분석을 수행해야하므로 NMG (그림 2B)가 표시됩니다. 100μm² 미만의 영역을 덮는 물체를 필터링한 후에는 NMG만 격리를 위해 레이블이 지정된 상태로 유지해야 합니다(그림 2C). 라벨링된 NMG의 정밀한 분리는 레이저 설정을 조정한 후에 달성됩니다(그림 2D). NMG의 분리 (그림 2E) 후, SN 조직은 단백질체 프로파일의 비교를 위해 50 배 배율 (그림 2F) 및 분리 (...

레이저 미세 해부를 통해 인간 사후 흑질 관절 조직으로부터 뉴멜라닌 과립을 분리하기 위한 강력한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 이 개정 및 최적화된 프로토콜은 샘플 수집에 필요한 시간을 크게 최소화하고 필요한 샘플 양을 줄이며 LC-MS/MS 분석을 통해 단백질의 식별 및 정량을 향상시킵니다.

뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일의 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세 해부 기반 프로토콜

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. ...

레이저 미세 해부와 질량 분석법의 조합은 모든 종류의 조직에서 단백질체 수준에서 공간적으로 분해된 변화를 조사할 수 있습니다. 우리의 경우, 신경 멜라닌 과립. 당사의 프로토콜은 제한된 샘플 물질을 기반으로 단백질체학 분석을 허용합니다.이는 일반적으로 사후 뇌 조직으로 작업할 때 큰 도전입니다. 단일 세포를 분리하여 단백질체 수준에서 건강한 상태와 질병 상태를 비교할 수 있기 때문입니다. 이것은 질병 메커니즘에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다.시작하려면 조직이 위쪽을 향하도록 로보 스테이지의 슬라이드 홀더에 조직막 슬라이드를 놓습니다. 조직 섹션의 개요 스캔을 획득합니다. 스캔 기능을 사용하여 왼쪽 상단과 오른쪽 하단에서 관심 영역을 선택하십시오.그런 다음 모든 ROI 검색을 선택하여 스캔을 수행합니다. 현재 시야에서 신경 멜라닌 과립의 자동 선택. 시야 분석을 선택합니다.그런 다음 결과 반전을 선택하고 RGB 채널의 임계값을 설정합니다. 따라서 뉴로멜라닌 과립만 미리보기 창에서 빨간색으로 강조 표시됩니다. 이제 확인을 클릭하여 시야에 대해 조정 된 설정을 사용하십시오.멤브레인으로 덮인 슬라이드 영역만 사용하여 레이저 설정을 조정합니다. 샘플 수집 튜브 캡을 50마이크로리터의 초순수로 채웁니다. 그리고 로보 발동기의 수집기에 캡을 삽입하십시오.소프트웨어 인터페이스를 사용하여 로보 무버를 로보 스테이지 2 위에 배치하여 샘플 수집을 시작합니다. 레이저를 시작하십시오. 레이저 공정 중에 에너지 및 초점 설정을 제어하고 필요한 경우 설정을 조정합니다.격리된 물체를 최소한 처음 10개의 물체에 대해 샘플 수집 튜브 캡으로 적절하게 분리하고 투석하도록 합니다. 샘플링이 완료되면 로보 무버를 시작 위치로 탐색하고 샘플 수집 튜브를 제거합니다. 샘플을 회전시킨 후 중심화시킨다.진공 농축기에서 1.5 시간 동안 샘플을 건조시킵니다. 본문에 설명 된대로 삼중 소화를 수행 한 후. HPLC-MS 분석을 위해 200 내지 400 나노그램의 샘플 펩티드를 0.1%TFA의 정의된 부피에 용해시켜 샘플을 준비합니다.불활성 질량 분석 유리 바이알 입구에서. 낮은 샘플 양으로 인해 농도 측정이 적용되지 않는 경우. 총 이온 전류를 비교하여 동일한 샘플 로딩을 확인합니다.단백질체학 원시 데이터 분석을 시작합니다. 로드를 클릭하여 원시 파일을 소프트웨어로 로드합니다. 실험 설정을 클릭하여 샘플 이름을 할당합니다.그룹별 매개 변수를 정의합니다. 탈아미드화 NQ, 산화 M 및 카바미도메틸화 N-항을 가변 수정으로 선택하여 수정을 추가합니다. 그런 다음 카바미도메틸화 C를 고정 변형으로 추가합니다.소화 탭에서 트립신을 소화 효소로 선택하십시오. 레이블 없는 정량화 탭에서 LFQ 옵션을 추가하고 10개 이상의 파일을 처리해야 하는 경우 빠른 LFQ 옵션을 선택하여 처리 시간을 단축합니다. 다른 모든 그룹별 매개변수가 공장 설정으로 유지되는지 확인합니다.전역 매개 변수 탭으로 이동하여 uniprot에서 파생된 FASTA 파일을 추가합니다. 시퀀스 탭의 조직. 식별자 규칙을 적절하게 수정합니다.그리고 호모 사피엔스에 대한 분류 ID 9606을 추가하십시오. 단백질 정량화를 위해서는 독특한 면도기 펩타이드를 선택하십시오. 그런 다음 iBAQ 옵션을 무라벨 정량화 탭에서 단백질 정량화를 위한 측정값으로 추가합니다.다른 모든 전역 매개 변수가 공장 설정으로 유지되는지 확인하고 시작을 클릭하십시오. 분석이 성공적으로 수행된 후 단백질 그룹을 회수한다. txt 출력.단백질 그룹을 로드합니다. TXT 파일을 사용할 수 있습니다. iBAQ 값을 기본 열로 추가하고 유형에 따라 다른 모든 열을 정렬합니다.범주형 열을 기준으로 행을 필터링하여 미끼와 오염 물질을 필터링하고 유효한 값을 기준으로 결과를 필터링합니다. 추가 처리를 위해 출력을 txt 형식으로 내보냅니다. 그리고 연구 질문에 관한 결과를 평가하십시오.본 연구에서, NMG에서 1, 898 개의 단백질 그룹이 확인되었고, 주변 SN 조직에서 1, 565 개가 확인되었으며, 그 중 1, 384 개가 두 조직 영역에서 확인되었다. 따라서 514 및 181 단백질 그룹은 각각 NMG 및 SN 조직에서 독점적으로 확인되었습니다. 대표적인 DDA 측정에서.SN에 비해 NMGs에서 약간 더 높은 iBAQ 값은 NMGs에서 단백질 세포질 dynien-1, 중쇄 1의 더 높은 풍부함을 나타냅니다. 이러한 관찰은 펩티드 ESPEVLLTLDILK에 대한 PRM 실험에서 검증될 수 있었다. NMG에서 더 높은 존재가 감지되었습니다.MS1 및 MS2 수준의 피크 영역을 기반으로 합니다. 가장 중요한 단계는 NMG의 격리이며, 나머지 프로토콜은 이 단계를 기반으로 제대로 수행됩니다. LMD 절차 후 샘플을 활용하고 유전체학, 전사체학, 단백질체학 또는 지질체학과 같은 모든 종류의 오믹스 기술에 대해 추가 처리할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

출처: Wulf, M., et.al.  뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일에 대한 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세해부 기반 프로토콜. J. Vis. 특급 (2021). 이 동영상은 인간의 사후 뇌 조직에서 분리한 뉴로멜라닌 과립(NMG)의 펩타이드 시료 분석을 보여줍니다. 펩타이드는 먼저 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분리한 다음 질량 분석법으로 분석하여 질량 대 전하 비율(m/z)을 측정합니다. 표적 펩타이드는 번역 후 변형을 식별하기 위해 단편화되고 결과 데이터는 NMG의 단백질체 프로파일을 결정하기 위해 참조 데이터베이스와 비교됩니다.

인간 뇌 조직에서 분리된 뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일에 대한 LC-MS/MS 분석

우리는 정량 실시간 PCR 및 / 또는 전체를 게놈 microarrays를 사용하여 후속 유전자 발현 분석을위한 부상을 쥐의 뇌의 냉동 섹션에서 hippocampal 뉴런 또는 단일 뉴런의 풍부한 인구를 얻기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

개별 도파민 뉴런의 단리 또는 직접 또는 간접 면역과 복측 피개 영역은 레이저 미세 절제를 캡처하여 설명된다. 적외선 레이저를 이용하여 유리 슬라이드 조직으로부터 단리 및 적외선 및 자외선 레이저의 조합을 이용하여 막 slide에서 파라미터 논의된다.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

이 프로토콜의 목표는 다운스트림 RNA 분석을 위해 이질적인 전립선 조직에서 세포 유형의 순수한 집단을 분리하는 효과적인 방법으로 레이저 캡처 미세 해부를 사용하는 것입니다.

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

여기, 우리 다운스트림 RNA 분석에 대 한 배수 채널 (TM)를 격리 하기 위한 재현성 레이저 캡처 기정 (LCM)에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. TM에 유전자 발현에 변화를 분석 하는 능력은 TM 관련 눈 질병의 근본적인 분자 메커니즘을 이해에 도움이 됩니다.

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

RNA 시퀀싱을 위해 개별 선충류 조직을 분리하기 위해 레이저 미세 해부를 사용하는 프로토콜이 기술되어 있습니다. 이 프로토콜은 종 특이적 유전자 툴킷을 필요로하지 않으므로 단일 조직 샘플 수준에서 다른 종간에 유전자 발현 프로필을 비교할 수 있습니다.

종에 구애받지 않는 단일 조직 응용 분야를 위한 레이저 미세 해부

이 프로토콜은 레이저 미세 해부를 사용하여 조직학적으로 해결된 세포 집단의 농축을 위해 염색된 얇은 조직 섹션 이미지로부터 병리학적으로 확인된 관심 영역의 인공 지능 기반 세분화를 위한 고처리량 워크플로우를 설명합니다. 이 전략에는 관심 있는 세포 집단을 나타내는 경계선을 레이저 현미경으로 직접 전송할 수 있는 새로운 알고리즘이 포함되어 있습니다.

종양 미세환경의 미세스케일 프로테오믹 분석을 위한 산업화된 인공 지능 유도 레이저 미세 해부

이 프로토콜은 형광 유도 단일 세포 MALDI-2 질량 분석법에 microMS를 사용하여 1차 쥐 신경 세포의 분자 프로파일링을 향상시키는 방법을 설명합니다.

Fluorescence-Guided Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization with Laser-Induced Postionization Mass Spectrometry of Individual Rat Neural Cells

학습하세요 레이저 미세 해부와 LC-MS/MS를 활용한 뉴로멜라닌 과립 단백질체 분석 프로토콜입니다. 인간 사후 흑색질 조직에서 1,898개 단백질 군을 식별하여 신경 질환 기전 연구에 활용됩니다.

뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일의 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세 해부 기반 프로토콜

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