Name: 유산균의 배양, 성장 및 생존력: 품질 관리 관점 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: 배우세요 유산균 배양 및 활성화 프로토콜을 통해 품질 관리 기법으로 세포 순도와 생존력을 확보하는 방법을. 이 연구는 미생물 발효 공정 연구에 활용됩니다.

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이 출판물은 보조금 번호 NC에 의해 가능해졌습니다. X-267-5-12-170-1 국립 식량 농업 연구소 (NIFA) 및 NIZO 식품 연구 BV, 네덜란드, Jarrow Formulas, 미국, 노스 캐롤라이나 농업 및 기술 주립 대학의 가족 및 소비자 과학부 및 농업 연구소 (Greensboro, NC, USA 27411). 이 작업은 1890 년 역량 강화 프로그램 보조금 번호 (2020-38821-31113 / 프로젝트 등록 번호 021765)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 연구는 또한 DCM # 577 / 17.08.2018에 의해 승인 된 국가 연구 프로그램 '강력한 바이오 경제와 삶의 질을위한 건강 식품'에 따라 불가리아 교육 과학부에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. 일반 재료 및 방법
<ol><li>락토바실러스 델브루에키 아종의 출처 불가리쿠스
	<ol><li>신뢰할 수있는 출처에서 L. 불가리쿠스 균주를 얻으십시오. 참고: 이 연구에서는 총 5개의 L. 불가리쿠스 균주가 품질 관리 연구에 사용되었습니다(표 1). 발효유 제품의 산업 생산을위한 동결 건조 L. bulgaricus 의 두 가지 균주는 불가리아 플 로브 디프에있는 식품 기술 대학의 생명 공학과 인 Albert Krastanov 박사에 의해 제공되었습니다. 미국 시장에서 이용 가능한 상업용 요구르트 제품에서 분리 된 2 개의 균주는 노스 캐롤라이나 A &amp; T 주립 대학의 식품 미생물학 및 생명 공학 실험실의 -80 ° C 재고에서 얻었으며 동결 건조 된 균주는 공급 업체 C에 의해 공급되었습니다. 모든 LAB 균주는 추가 사용이 될 때까지 -80°C에서 유지하였다. 또 다른 박테리아 균주 (Limosilactobacillus reuteri)는 노스 캐롤라이나 A &amp; T 주립 대학의 식품 미생물학 및 생명 공학 실험실의 -80 ° C 재고로부터 얻어졌으며 또한 평가되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>표준 L. MRS 발효액 배지<ol><li>1 L의 탈이온수(DW)에 55 g의 MRS 및 0.5 g의 L-시스테인을 완전히 용해시켜 드만, 로고사 샤프(MRS) 배지를 제조한다.</li>
		<li>준비된 MRS 용액 7mL와 2mL를 각각 시험관에 분주하고 121°C에서 15분 동안 오토클레이브한 후 실온(RT)에서 냉각합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>MRS 한천 배지<ol><li>1L의 DW에 55g의 MRS 및 0.5g의 L- 시스테인을 완전히 용해시켜 MRS 한천 배지를 제조합니다. 한천 분말(15g)을 넣고 한천 배지를 121°C에서 15분 동안 멸균한 다음 수조에서 식힌다.</li>
		<li>새로 준비된 모든 배지를 멸균 페트리 접시에 붓고 더 필요할 때까지 4 ° C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>변형 강화 클로스트리듐 중간-피루브산(mRCM-PYR)<ol><li>Oyeniran et al.13 및 Nwamaioha 및 Ibrahim 18에 따라 강화 클로스트리듐 배지를 최적화하여 L. 불가리쿠스의 선택성 및 정확한 열거를 위해 펩톤 #3 10g, 쇠고기 추출물 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 5g, 아세트산나트륨 3g, 이염기성 인산칼륨 2g, DW 1L에 우라실 0.1g, 염화칼슘 0.25g, 덱스트로스 5g, 과당 5g, 맥아당 10g, 피루브산나트륨 2g, 트윈 80 0.2%, L-시스테인 0.5g.</li>
		<li>0.008% 아닐린 블루와 15 g의 한천을 첨가하기 전에 6 N HCl을 사용하여 용액의 최종 pH(6.0 ± 0.2)를 조정한다. 배지를 121°C에서 15분 동안 오토클레이브하고, 수조에서 냉각시키고, 멸균된 페트리 접시에 붓는다. 새로 준비된 모든 배지는 필요할 때까지 4 ° C의 멸균 페트리 접시에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>LAB 배양물의 글리세롤 스톡<ol><li>동일한 부피의 DW에 100% 글리세롤을 희석하여 글리세롤 스톡(50% 글리세롤)을 제조하고 건식 멸균 사이클을 사용하여 100°C에서 30분 동안 멸균합니다. 글리세롤 스톡을 RT로 식히고 추가 사용을 위해 무균 상태로 보관하십시오.</li>
		<li>하룻밤 배양에서 박테리아 성장(개발된 QC 프로토콜을 사용하여 얻은 L. 불가리쿠스의 단일 콜로니)을 사용하십시오.</li>
		<li>밤새 배양된 500μL를 2mL 원심분리 튜브에 50% 글리세롤로 피펫팅하고 부드럽게 혼합합니다. LAB 배양물을 함유하는 글리세롤 스톡을 동결시키고 필요할 때까지 -80°C의 초저온에서 보관한다. 참고: LAB 배양의 품질 관리 및 활성화를 위한 프로토콜의 그래픽 체계가 그림 1에 나와 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>아니요</td>
			<td>제품 코드</td>
			<td>견본</td>
			<td>근원</td>
			<td>1로 표시된 박테리아 조성</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>시즌 9</td>
			<td>순수 산업용 변형</td>
			<td>불가리아</td>
			<td>Lb. 불가리쿠스</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>LB6</td>
			<td>순수 산업용 변형</td>
			<td>불가리아</td>
			<td>파운드 불가리쿠스,</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>ATCC 11842</td>
			<td>순수 산업용 변형</td>
			<td>증권 시세 표시기</td>
			<td>Lb. 불가리쿠스</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>갈까마귀</td>
			<td>요구르트</td>
			<td>미국</td>
			<td>Lb. 불가리쿠스, 다른 라이브 문화</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>E22</td>
			<td>요구르트</td>
			<td>미국</td>
			<td>Lb. 불가리쿠스, 다른 라이브 문화</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>로이테리</td>
			<td>요구르트</td>
			<td>미국</td>
			<td>리모실락토바실러스 루테리</td>
		</tr><tr><td colspan="5">1파운드 =락토바실러스</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 프로바이오틱스 균주. 이 표에는 이 연구에 사용된 프로바이오틱스 균주가 나열되어 있습니다.
2. LAB 배양의 활성화 및 품질 관리를 위한 프로토콜
<ol><li>-80°C 초저온 냉동고에서 준비된 LAB 균주(2mL 원심분리 튜브에 담겨 있음)의 글리세롤 재고를 꺼내 사용하기 전에 해동하지 마십시오.</li>
	<li>원심 분리기 튜브의 입구를 70 % 알코올로 청소 및 소독하고 사용하기 전에 부드럽게 와동하십시오.</li>
	<li>원심분리 튜브에서 약 250 μL (0.25 mL)의 스톡 LAB 배양물을 새로운 2 mL MRS 테스트 튜브로 피펫팅합니다.</li>
	<li>부드럽게 소용돌이치고, 시험관을 파라 필름하고, 42 ° C에서 12-16 시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다.</li>
	<li>2mL MRS 시험관에서 하룻밤 동안 성장한 배양물에서 약 500μL(0.5mL)를 새로운 7mL MRS 시험관, 와류로 가져와 42°C에서 12-16시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다.</li>
	<li>UV-가시광선 분광광도계로 610nm에서 배양물의 광학 밀도 (OD) 또는 성장을 측정하여 미생물 성장을 평가하고 0.7과 0.9 사이의 허용가능한 결과를 기록합니다.</li>
	<li>7mL MRS 튜브에서 밤새 배양한 것을 MRS 및 MRCM-PYR 한천 플레이트에 걸고 42°C에서 72시간 동안 혐기성 배양합니다.</li>
	<li>한천 플레이트에서 분리된 콜로니를 선택하여 신선한 7mL MRS 시험관으로 옮기고 부드럽게 소용돌이치고 42°C에서 12-16시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다.</li>
	<li>분리된 균주가 포함된 한천 플레이트를 4°C에서 일주일 동안 냉장고에 보관한다.</li>
	<li>610nm에서 줄무늬 플레이트에서 분리된 LAB 배양물의 7mL MRS 시험관에서 OD(0.7에서 0.9 사이)를 측정 및 확인하고 이를 모든 관련 실험을 위한 작업 배양으로 사용합니다.</li>
	<li>성장한 LAB 배양물을 최종 7mL MRS 시험관에서 펩톤수(생리학적 완충액) 9mL를 사용하여 10배 희석(연속 희석)하여 1:10 비율을 얻습니다.</li>
	<li>마지막으로, 모든 발효 실험에 적합한 연속 희석액으로부터 약 250 μL (0.25 mL)를 취한다.</li>
	<li>2.12단계의 균주(250μL)가 포함된 액체를 신선한 7mL MRS 브로스에 옮기고 42°C에서 16시간 동안 혐기배양하여 활성화합니다.</li>
	<li>LAB 배양에서 생존 가능하고 우수한 세포 성장을 보장하기 위해 2.6-2.12단계를 계속 반복합니다. 참고: 모든 L. 불가리쿠스 균주를 새로 준비된 MRS 배지에서 활성화시킨 다음, 0.7과 0.9 사이의 박테리아 성장의 광학 밀도(OD610 nm)에 도달하기 위해 42°C에서 16시간 동안 혐기배양하였다. 박테리아 성장은 610 nm에서 UV-가시광선 분광광도계로 측정하였다. 하룻밤 배양의 pH 값은 LAB 발효의 유기 최종 생성물인 젖산의 생산의 결과로 3.5 내지 5.3의 범위였다. 생물 안전 후드의 적절한 공기 흐름 순환 및 분젠 버너 사용 중 화상 방지와 같은 안전 절차를 준수하고 준수했습니다.</li>
</ol><img alt="LAB 배양 공정도; MRS 국물 준비, 배양, 광학 밀도 측정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63314/63314fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 유산균(LAB) 배양 활성화를 위한 프로토콜의 그래픽 체계. 이 계획은 LAB 배양 균주의 취급 및 활성화에 필요한 세부 정보와 기본 도구를 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63314/63314fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol><li>Karakas-Sen, A., Karakas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+identification+and+technological+properties+of+lactic+acid+bacteria+from+raw+cow+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Journal%22%5BJournal%5D)">Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk.</a> Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).</li>
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<li>Aryana, K. J., Olson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+100-year+review%3A+Yogurt+and+other+cultured+dairy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products.</a> Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).</li>
<li>Kandil, S., El Soda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+freezing+and+freeze-drying+on+intracellular+enzymatic+activity+and+autolytic+properties+of+some+lactic+acid+bacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains.</a> Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).</li>
<li>Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cell+density+cultivation+of+Saccharomyces+cerevisiae+with+intensive+multiple+sequential+batches+together+with+a+novel+technique+of+fed-batch+at+cell+level+%28FBC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC).</a> Processes. 8 (10), 1321(2020).</li>
<li>Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonies+in+solid+media+and+foods%3A+A+review+on+their+growth+and+interactions+with+the+micro-environment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1284(2015).</li>
<li>Oyeniran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+reinforced+clostridial+medium+for+the+isolation+and+enumeration+of+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus+in+a+mixed+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture.</a> Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).</li>
<li>Iguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+repeated+subculturing+and+prolonged+storage+at+room+temperature+of+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3A+H7+on+pulsed-field+gel+electrophoresis+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).</li>
<li>Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+limitations+and+challenges+with+lactic+acid+bacteria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Nutrition+Sciences%22%5BJournal%5D)">Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review.</a> Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).</li>
<li>Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+bile+salt+tolerant+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+2007+National+Conference+on+Environmental+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri.</a> Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).</li>
<li>Gyawali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+extraction+techniques+for+maximum+recovery+of+%CE%B2-galactosidase+from+the+yogurt+bacterium+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.</a> Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).</li>
<li>Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+medium+for+the+enumeration+and+differentiation+of+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.</a> Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).</li>
</ol>

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품질 관리 프로토콜로 평가 된 모든 균주의 결과와 프로토콜을 사용하지 않은 결과는 동일했기 때문에 균주 (S9 및 LB6)에만 연결된 결과가 제시되었습니다. 활성화된 LAB 균주는 높은 강도의 세포 바이오매스를 특징으로 하는 우수한 세포 성장을 가졌고, 따라서, 시험관(11)에서 MRS 발효액의 혼탁한 외관을 야기하였다. 배양 활성화 후 관찰된 세포 성장은 42°C의 혐기성 발효 온도에서 12시간 및 16시간 사이에 분명했습니다. 또한, 이 프로토콜에 기초하여 활성화된 LAB 균주는 연속적으로 그들의 콜로니 형태가 다중 계대배양 절차(12 )의 결과로서 변형된 것을 확인하였고, 스트리킹 라인을 따라 가시적인 콜로니를 갖는 것으로 확인되었다. 대조 실험은 이 표준 프로토콜을 사용하지 않았으며 한 번만 계대배양되었습니다. 그러나 OD610 nm에서 성장이 여전히 허용 범위 인 0.7-0.9 내에 있었지만 발효액에서 강렬한 탁도...

유산균(LAB)은 산업적 잠재력을 가진 독특하고 다양한 박테리아의 그룹입니다. 락토바실러스 델브루키에 속하는 균주 불가리쿠스와 스트렙토코커스 써모필러스는 주로 요구르트1과 같은 발효 유제품의 유제품 스타터 배양으로 사용됩니다. 선택된 LAB 균주는 복용량이적절하게 투여될 때 인간에게 건강상의 이점을 제공하기 때문에 프로바이오틱스로 분류됩니다2. 유산균은 또한 그람 양성, 포자 형성이 아닌, 호흡이 없지만 일반적으로 주요 발효 생성물로서 젖산의 생산을 특징으로 하는 공기내성 미생물입니다. LAB는 또한 광범위한 식품 매개 병원체4를 억제할 수 있는 유기산, 박테리오신 및 기타 항균 화합물3과 같은 필수 대사산물을 합성합니다. 탄수화물 이화 작용의 주요 최종 생성물이자 LAB 발효의 부산물인 젖산은 항균 특성을 가지고 있으며 식품 생물 보존 응용 분야에 잠재적으로 유용한 유기 대사 산물입니다 3,5,6. 또한 LAB에서 생산 된 유기산은 식품의 풍미, 질감 및 향을 부여하여 결과적으로 전반적인 관능적 특성을 향상시킵니다 5,6. LAB의 뚜렷한 영양 요구 사항과 유비쿼터스 특성이 결합되어 궁극적으로 박테리아가 유제품 기반 식품, 발효 식품, 야채 및 인간의 장7과 같은 다양한 환경에서 쉽게 번성할 수 있도록합니다.
요구르트 생산 및 다양한 유제품 응용 분야 8,9를 위한 LAB의 스타터 배양에 대한 수요가 증가하고 있으므로 LAB 균주 배양뿐만 아니라 동결건조 및 분리 균주의 활성화에서 중요한 관심과 확립된 과학 기술을 준수해야 합니다. 따라서 식품 미생물학 및 생명 공학 실험실은 발효 유제품 및 요구르트 생산에 사용되는 산업 스타터 배양에서 분리 된 LAB 균주의 활성화, 우수한 성장 및 발효 특성을 목표로하는 적절한 기술 개발에 적극적으로 참여하고 있습니다. 또한, 산업적으로 생산된 LAB 배양균주는 동결건조 및 냉동보관 등의 보존활성을 거쳐 이들이 겪게 되는 냉 충격 과정의 결과로 세포 스트레스 및 손상을 일으킨다는 점도 주목할 만하다(10). 단리된 식품 또는 동결건조 제품으로부터 수득된 LAB 균주의 제한, 생존성 도전 및 기능성 향상에 있어서, 이들의 발효 특성을 향상시키기 위한 품질 관리의 한 형태로서 이들 배양물을 적절하게 활성화시키는 것이 중요하다8. 이 연구의 목표는 궁극적으로 생존 가능한 LAB 성장을 촉진하고 LAB 균주의 발효 성능과 대사 기능을 향상시키는 L. delbrueckii subsp. bulgaricus 배양 균주의 활성화 및 성장을 위한 사내 품질 관리 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 이 프로토콜은 궁극적으로 발효 연구뿐만 아니라 산업 목적 또는 바이오 프로세싱 작업을위한 다른 LAB 균주의 배양을 위해 (최적의 성장 배지 및 적절한 배양 조건 사용) 적용될 수 있습니다. 따라서 이 LAB 활성화 및 품질 관리 프로토콜은 우수한 실행 가능한 유제품 스타터 배양을 얻고 글로벌 유제품 및 식품 산업의 다양한 응용 분야에서 잠재적으로 기능할 수 있도록 보장합니다.

<table><tbody><tr><td>아닐린 블루</td><td>Thermo Scientific</td><td>R21526</td><td>25g</td></tr><tr><td>쇠고기 추출물</td><td>Research Products International</td><td>50-197-7509</td><td>500g</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>포도당 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350500</td><td>500 지</td></tr><tr><td>D-Fructose</td><td>ACROS Organics</td><td>AC161355000</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Difco 한천 분말</td><td>Difco</td><td>DF0812-07-1</td><td>2 kg</td></tr><tr><td>TPY 한천</td><td>Difco</td><td>211921</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap microcentrifuge Safe-Lock)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-12</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI17904</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>적외선 CO2 인큐베이터</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)ATCC</td> <td>11842</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>불가리아</td><td>S9</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. 불가리쿠</td><td>스</td><td>불가리아 LB6</td><td></td></tr><tr><td>락토바실러스 델브루에키 subsp. 불가리쿠스</td><td>식품 미생물학 및 생명공학 연구실(NCATSU)</td><td>DAW</td><td></td></tr><tr><td>락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) subsp. 불가리쿠</td>스 <td>식품 미생물학 및 생명공학 연구실(NCATSU)</td><td>E22</td><td></td></tr><tr><td>리모실락토바실러스 루테리</td><td>Biogai, Raleigh / 식품 미생물학 및 생명공학 연구실(NCATSU)</td><td>RD2</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인 염산염 일수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>C6852-25G</td><td></td></tr><tr><td>맥아당 일수화물</td> 25g <td>Fisher Scientific</td><td>M75-100</td><td>100g</td></tr><tr><td>MRS 육수</td><td>Neogen</td><td>50-201-5691</td><td>5kg</td></tr><tr><td>펩톤 No. 3</td><td>Hach</td><td>50-199-6719</td><td>500g</td></tr><tr><td>인산칼륨이염기성(K2HPO4)</td><td>Research Products International</td><td>50-712-761</td><td>500g</td></tr><tr><td>아세트산나트륨 삼수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>S220-1</td><td>1의 kg</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>1kg</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td> 고무 안감 나사 캡이 있는 <td>100g</td></tr><tr><td>테스트 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB70125150</td><td>25 x 150mm</td></tr><tr><td>트윈 80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td>500mL</td></tr><tr><td>초저온 냉동고</td><td>So-Low</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>ACROS Organics</td><td>AC157301000</td><td>100g</td></tr><tr><td>UV 가시광선 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Evolution 201</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>T08204K7</td><td>4L</td></tr><tr><td>염산(6N(인증), Fisher Chemical)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>&nbsp; SA56-500</td><td>500 밀리리터</td></tr></tbody></table>

유산균의 배양, 성장 및 생존력: 품질 관리 관점

The Cultivation, Growth, and Viability of Lactic Acid Bacteria: A Quality Control Perspective

유산균(LAB)은 요구르트 및 치즈와 같은 발효 유제품 제조에 크게 사용되는 필수 유제품 스타터 배양입니다. LAB는 주로 발효의 주요 최종 생성물인 젖산을 생산하며, 발효식품의 관능적 특성을 부여하는 중요한 대사산물을 합성합니다. LAB는 적절한 영양 요구 사항이 충족되면 많은 환경에서 번성하는 까다로운 박테리아입니다. 식품 및 유제품 산업의 발효 응용 분야를 위한 우수한 LAB 유제품 스타터 배양에 대한 수요로 인해 모든 바이오프로세싱 작업에 실행 가능하고 활동적인 배양을 제공해야 할 필요성이 대두되었습니다. 따라서 실험실 및 유제품 가공 환경에서 LAB 배양의 실행 가능성과 향상된 기능을 보장하기 위한 표준 프로토콜의 개발은 매우 중요합니다. 약하고 스트레스를 받고 손상된 LAB 배양 세포의 소생과 관련된 문제를 해결하기 위해 LAB 균주의 회복, 세포 재생 향상 및 대사 기능 개선을 위한 두드러진 단계를 생생하게 설명하는 프로토콜이 가장 중요합니다. LAB 스타터 배양의 배양 순도, 기능 및 생존력 유지도 마찬가지로 중요합니다. 따라서 고유한 프로토콜 지침을 준수하면 발효 및 생명공학 공정에 전념하는 많은 LAB 균주의 발효 성능이 향상될 것입니다. 그 결과, 노스캐롤라이나 농업 기술 주립 대학의 식품 미생물학 및 생명공학 연구소는 선택된 LAB 균주의 활성화 및 품질 관리를 위한 표준 프로토콜을 개발하여 발효 연구에 사용되는 고기능 및 실행 가능한 LAB 배양 균주를 탄생시켰습니다. 유제품 및 식품 산업에서 사용하기 위해 이와 같은 프로토콜을 조정하고 권장하면 많은 응용 분야에서 LAB 실행 가능성과 기능을 보장하는 데 도움이 될 것입니다.

품질 관리 프로토콜로 배양된 평가된 LAB 균주의 세포 성장은 이 표준 프로토콜 없이 배양된 균주와 유의하게 달랐습니다(P &lt; 0.05). L. bulgaricus와 L. reuteri 모두에 대한 QC 프로토콜은 다중 계류 배양 접근법 (한천 플레이트에 줄무늬를 짓기 전에 3 번 계대 배양)을 사용하는 반면, 제어 절차는 다른 모든 조건이 일정하게 유지되는 상태에서 한 번만 계대 배양을 수행했습니다. 콜로니 성장은 또한 이 표준 QC 프로토콜을 사용하여 재배된 성장 배지 플레이트에서 더 높고 잘 정의되었습니다. 이것은 발효액에서 세포 분열을 통해 향상된 LAB 성장을 보장하는 프로토콜의 효과를 확인했으며, 따라서 LAB 균주에서 향상된 세포 대사를 돕습니다. 개발된 품질 관리 프로토콜의 유무에 관계없이 배양된 두 균주의 성장은 그림 2에 나와 있습니다. 균주를 한천 플레이트 상에 줄무늬를 표시한 후 강렬한 성장(OD610 nm<...

유산균(LAB) 배양액의 품질관리 평가는 발효 절차를 위한 LAB 균주의 생존력과 기능성을 향상시키는 효과적인 방법으로 확인되었습니다. 이 주장을 뒷받침하기 위해 우리는 발효 및 바이오 프로세싱 절차를 위해 LAB 배양이 어떻게 활성화되고 배양되는지 설명하는 프로토콜을 개발했습니다.

Lactic acid bacteria (LAB) are essential dairy starter cultures that are significantly employed for the manufacture of fermented dairy products such as ...

우리의 프로토콜은 품질 관리 검사로서 순도를 보장하기 때문에 중요합니다. 또한 유산균 발효에서 심각한 발효 성능과 수율의 일관성을 촉진합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 세포 순도, 생존력 및 기능성을 통해 유산균의 발효 성능을 향상시킬 수 있다는 것입니다.이 기술은 사용자 친화적이며 많은 기술적 요구 사항없이 기본 장비 만 사용하기 때문에 누구나 쉽게 수행 할 수 있습니다. Philip Yeboah는 우리의 대학원 연구 조교이며 절차를 시연 할 것입니다. 시작하려면 영하 80도의 초저온 냉동고에서 2밀리리터 원심분리기 튜브에 준비된 유산균 또는 LAB 균주의 글리세롤 재고를 가져갑니다.사용하기 전에 해동하지 마십시오. 사용하기 전에 원심 분리기 튜브의 입구를 70 % 알코올로 청소하고 소독하고 부드럽게 와동하십시오. 원심분리 튜브로부터 약 250 마이크로리터의 스톡 LAB 배양물을 신선한 2 밀리리터 MRS 시험관으로 피펫팅한다.시험관을 부드럽게 소용돌이 치고 파라 필름을 만들고 섭씨 42도에서 12-16 시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다. 다음으로, 2 밀리리터 MRS 시험관에서 밤새 성장한 배양 물에서 약 500 마이크로 리터를 신선한 7 밀리리터 MRS 시험관으로 가져 와서 와류시키고 섭씨 42도에서 12-16 시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다. UV 가시광선 분광광도계로 610나노미터에서 배양물의 광학 밀도 또는 성장을 측정하여 미생물 성장을 평가하고 0.7에서 0.9 사이의 허용 가능한 결과를 기록합니다.7 밀리리터 MRS 튜브에서 밤새 배양 물을 MRS 및 MRCMPYR 한천 플레이트에 넣고 섭씨 42도에서 72 시간 동안 혐기성 배양합니다. 한천 플레이트에서 분리 된 콜로니를 골라 신선한 7 밀리리터 MRS 시험관으로 옮기고 부드럽게 와류를 일으키고 섭씨 42도에서 12-16 시간 동안 밤새 혐기성 배양합니다. 분리 된 균주가 들어있는 한천 플레이트를 섭씨 4도에서 냉장고에 일주일 동안 보관하십시오.다음으로, 610나노미터에서 줄무늬 플레이트에서 분리된 LAB 배양물의 7밀리리터 MRS 시험관에서 광학 밀도를 측정 및 확인하고 이를 모든 관련 실험을 위한 작업 배양으로 사용합니다. 9 밀리리터의 펩톤 물을 사용하여 최종 7 밀리리터 MRS 시험관에서 성장한 LAB 배양 물의 10 배 오염을 수행하여 1 대 10 비율을 얻습니다. 모든 발효 실험에 적합한 연속 망상에서 약 250 마이크로 리터를 취하고 신선한 7 밀리리터 MRS 국물에 옮기고 섭씨 42도에서 16 시간 동안 혐기성으로 배양하여 균주가 포함 된 국물을 활성화시킵니다.LAB 배양에서 생존 가능하고 우수한 세포 성장을 보장하기 위해 단계를 반복하십시오. 품질관리 프로토콜로 배양한 S9 및 LB6 락토바실러스 불가리쿠스 균주와 품질관리 프로토콜 없이 배양한 S9 락토바실러스 불가리쿠스 균주의 세포 형태 성장이 여기에 표시됩니다. 균주는 삼중으로 줄무늬가 있었고 섭씨 42도에서 72시간 동안 혐기성 배양되었습니다.이 절차를 시도할 때 교차 오염을 방지하기 위해 냉동실의 스톡 배양 튜브를 70% 알코올로 소독해야 합니다. 성장 배양의 광학 밀도 측정은 항상 0.7과 0.9 사이여야 합니다. 이 프로토콜에 따라 우수한 배양 사용으로 효율적인 LAB 발효 또는 바이오 프로세싱 작업을 달성 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Ayivi, R. et al., 유산균의 배양, 성장 및 생존력: 품질 관리 관점. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 냉동 글리세롤 스톡에서 저온 스트레스를 받은 유산균을 회수하고, 혐기성 배양을 통해 박테리아 생존력을 회복하고, 배양 확장을 위해 활성 콜로니를 분리하는 방법을 보여줍니다.

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이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

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배우세요 유산균 배양 및 활성화 프로토콜을 통해 품질 관리 기법으로 세포 순도와 생존력을 확보하는 방법을. 이 연구는 미생물 발효 공정 연구에 활용됩니다.

유산균의 배양, 성장 및 생존력: 품질 관리 관점

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