Name: 반복적인 후성유전체학 분석을 위한 재사용 가능한 단일 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 학습하세요 재사용 가능한 단일 세포를 활용한 반복적 후성유전체학 분석 방법입니다. 동일 세포에서 여러 후성유전적 표지와 전사인자를 분석하여 유전자 발현 조절 메커니즘을 규명하고 표적 후성유전 치료법 설계에 활용할 수 있습니다.

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프로젝트의 개념화 단계에서 의견을 주신 David Sanchez-Martin 박사와 Christopher B. Buck 박사에게 감사드립니다. 또한 예비 실험에 도움을 주신 Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 그리고 전산 분석에 대한 조언을 해주신 Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH에 감사드립니다. 이 방법에 사용되는 DNA 중합효소의 최적화를 도와준 Ms. Anna Word에게 감사드립니다. 이 작업은 NIHHPC Biowulf 클러스터(http://hpc.nih.gov)의 계산 리소스를 활용했습니다. 이 프로젝트는 암 연구 센터, 국립 암 연구소, 국립 보건원의 교내 프로그램, NCI 이사 혁신상(#397172) 및 계약 번호 HHSN261200800001E에 따라 국립 암 연구소의 연방 기금의 지원을 받습니다. 생산적인 의견을 주신 Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy 및 Laboratory of Cellular Oncology의 모든 구성원에게 감사드립니다.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

오누키 박사와 토사토 박사는 "재사용 가능한 단일 세포를 제조하는 방법 및 단일 세포의 후성유전체, 전사체 및 게놈을 분석하는 방법"(EP3619307 및 US20200102604)이라는 제목의 특허에 대한 공동 발명자입니다. 특허 출원은 부분적으로 현재 원고에 설명 된 기술과 관련된 예비 결과를 기반으로 제출되었습니다. 이 특허 출원에 기술되고 청구된 발명 또는 발명은 발명가가 미국 정부의 정규직 직원이었을 때 만들어졌습니다. 따라서 45 Code of Federal Regulations Part 7에 따라 이 특허 출원에 대한 모든 권리, 소유권 및 이익은 법률에 따라 미국 정부에 양도되었거나 양도되어야 합니다. 미국 정부는 15 U.S. Code § 3710c에 따라 받는 로열티의 일부를 직원 발명가에게 전달합니다.

이 글은 재사용 가능한 단일세포를 이용한 최근 보고된 single-cell multiepigenomic 분석에 대한 단계별 프로토콜을 설명한다7. 다음 단락에서는 프로토콜의 잠재적 한계를 강조하면서 중요한 사항에 대해 논의합니다. 
프로토콜 전반에 걸쳐 중요한 점 중 하나 (7.2-13 단계에서)는 DNase 오염을 피하는 것입니다. 단일 세포에는 게놈 DNA 사본이 두 개뿐입니다. 따라서 게놈 DNA를 손상시키면 신호 수가 크게 감소합니다. DNase로 인한 오염을 피하는 것은 게놈 DNA의 무결성을 보호하는 데 필수적입니다. 
세포막/세포벽을 가로지르는 시약의 투과성도 프로토콜 전반에 걸쳐 중요합니다. REpi-seq는 단일 세포 수준에서 마우스와 인간 세포의 후성유전체를 분석하도록 설계되었습니다. 이러한 실험방법의 최적 조건은 각 시약에 대한 세포 유형 및 핵막의 투과성에 따라 달라...

Single-cell 기술은 개별 single-cell omics 기술을 통합하는 single-cell multiomics의 시대로 진입하고 있습니다1. 최근 단일 세포 전사체학은 염색질 접근성(scNMT-seq2 및 SHARE-seq3) 또는 히스톤 변형(Paired-seq4 및 Paired-Tag5)을 검출하는 방법과 결합되었습니다. 보다 최근에는 단일 세포 전사체학 및 단백질체학이 염색질 접근성과 통합되었습니다(DOGMA-seq6). 이러한 방법은 염색질 접근성 또는 히스톤 변형을 감지하기 위해 전이효소 기반 태깅을 사용합니다.
전이효소 기반 접근 방식은 게놈 DNA를 절단하고 게놈 DNA 단편 끝에 DNA 바코드를 추가합니다. 절단된 각 게놈 단편은 최대 2개의 DNA 바코드(= 절단 부위당 하나의 후성유전학적 마크)만 수용할 수 있으며 절단 부위의 게놈 DNA는 손실됩니다. 따라서 분열 기반 접근법은 테스트된 후성유전학적 마크의 수와 신호 밀도 사이에 절충안이 있습니다. 이것은 동일한 단일 세포에서 여러 후성 유전 학적 표지의 분석을 방해합니다. 게놈 DNA를 절단하지 않는 단세포 후성유전체법이 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다 7,8.
위에서 언급한 절단 유래 문제 외에도 전이효소 기반 접근 방식에는 다른 제한 사항이 있습니다. 단일 세포 후성유전체 분석에서는 게놈에서 히스톤과 DNA 관련 단백질의 위치를 아는 것이 중요합니다. 현재의 접근법에서, 이것은 고정되지 않은 단일 세포와 단백질-DNA 및 단백질-단백질 상호작용의 유지를 사용함으로써 달성된다. 그러나 이것은 히스톤 변형 분석에서도 접근 가능한 염색질 영역에 강한 편향을 일으킨다9. 게놈 상의 히스톤 및 게놈 관련 단백질의 위치는 폴리아크릴아미드 스캐폴드 7,8을 사용하여 단백질-DNA 및 단백질-단백질을 가교하지 않고 보존할 수 있습니다. 이 접근법은 단백질-DNA 및 단백질-단백질 상호작용에 의존하는 현재 접근법에서 관찰되는 구조적 편향을 줄입니다.
전이효소 기반 접근법은 단일 세포에서 신호를 한 번만 획득할 수 있습니다. 따라서 신호의 감소로 인해 단일 세포의 완전한 후성유전체를 묘사하는 것은 어렵습니다. 재사용 가능한 단일 세포는 동일한 단일 세포에서 반복적인 후성유전체 분석을 허용함으로써 현재의 한계를 극복하기 위해 개발되었습니다.

<table><tbody><tr><td>10x CutSmart 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x 소화 버퍼</td></tr><tr><td>200 프루프 에탄올</td><td>Warner-Graham Company</td><td>200 프루프</td><td>에탄올</td></tr><tr><td>5-하이드록시메틸시토신(5-hmC) 단클론 항체 [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>Anti-5hmC</td></tr><tr><td>Acridine Orange/Propidium Iodide Stain</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>분자 생물학을 위한 아크릴아미드 용액, H2O 40%</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>40% 아크릴아미드 용액</td></tr><tr><td>올인원 형광 현미경 BZ-X710</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>스캐닝 현미경</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 원심 필터 장치</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024</td> 분자생물학용 <td></td></tr><tr><td></td><td>한외여과 카세트 과황산암모늄MilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>과황산암모늄 분말</td></tr><tr><td>무수 DMF</td><td>Vector laboratories</td><td>S-4001-005</td><td>무수 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)</td></tr><tr><td>Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) 항체 [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Anti-Pol II</td></tr><tr><td>Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) 항체</td><td>Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 용액, H2O에서 20mg/mL, 낮은 바이오버든, 프로테아제 프리, 분자생물학용</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA (표 7)</td></tr><tr><td>Bst DNA 중합효소, 대형 단편</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst DNA 중합효소</td></tr><tr><td>BT10 시리즈 10 &마이크로; l 배리어 팁</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 저잔류 팁</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>자동 실험실 솔루션</td><td>N/A</td><td>자동 단일 세포 피킹 로봇</td></tr><tr><td>CellCelector 단일 세포 복제를 위한 4 nl 나노웰 플레이트, 플레이트 S200-100 100K, 24웰, ULA</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>CC0079</td><td>4 nL 나노웰 플레이트</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>클로로포름</td></tr><tr><td>Corning Costar 96-well, 세포 배양 처리, 평면 바닥 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>평면 바닥 96-웰 플레이트</td></tr><tr><td>Deep Vent (exo-) DNA 중합효소</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- DNA 중합효소</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0.5 mL DNA 저결합 튜브</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 1차 무작위 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/ A, 표 3</td><td>1차 무작위 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#01</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A 참조, 표 3</td><td>2차 무작위 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#02</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A 참조, 표 3</td><td>2차 랜덤 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#03</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A 참조, 표 3</td><td>2차 랜덤 프라이머</td></tr> <tr><td>참조DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3 2</td><td>차 무작위 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#05</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A 참조, 표 3</td><td>2차 무작위 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#06</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A 참조, 표 3</td><td>2차 무작위 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo 참조, 2차 무작위 프라이머 Cell#07</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3 2</td><td>차 무작위 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#08</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3</td><td>2차 무작위 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#09</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A 참조, 표 3</td><td>2차 무작위 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#10</td><td>Integrated DNA Technologies</td> <td>참조N/A, 표 3</td><td>2차 무작위 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#11</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A 참조, 표 3</td><td>2차 랜덤 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 랜덤 프라이머 Cell#12</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3</td><td>2차 랜덤 프라이머</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2차 합성 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A 참조, 표 3</td><td>2차 합성 프라이머</td></tr> <tr><td>참조DNA Oligo, Ligation Adaptor</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3 Ligation</td><td>Adaptor</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 역전사 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A 참조, 표 3</td><td>역전사 프라이머</td></tr><tr><td>DNase I (RNase-free)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNase I (RNase-free, 4 U) 참조.</td></tr><tr><td>DNase I 반응 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x DNase I 버퍼 (NEB)</td></tr><tr><td>dNTP 믹스 (각 10 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTP</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, 미국 원산지, 열 비활성화</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>소 태아 혈청</td></tr><tr><td>HiScribe T7 고수율 RNA 합성 키트</td><td>New England BioLabs</td><td>E2040S</td><td>체외 전사 마스터 믹스</td></tr><tr><td>히스톤 H3K27ac 항체</td><td>활성 주제</td><td>39133</td><td>Anti-H3K27ac</td></tr><tr><td>히스톤 H3K27me3 항체</td><td>활성 모티프</td><td>39155</td> 토끼 혈청의 <td>Anti-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>Control IgG</td></tr><tr><td>산화철(II,III) 자성 나노 분말, 30nm 평균 부분 크기(TEM), NHS 에스테르 기능화</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>NHS 에스테르 기능화 30nm 산화철 분말</td></tr><tr><td>K-562</td><td>American Type Culture Collection(ATCC)</td><td>CCL-243</td><td>세포</td></tr><tr><td>선형 아크릴아미드(5mg/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9520</td><td>선형 아크릴아미드</td></tr><tr><td>LUNA-FL 이중 형광 세포 계수기</td><td>로고 Biosystems</td><td>L20001</td><td>세포 계수기</td></tr><tr><td>LUNA 세포 계수 슬라이드, 50 슬라이드</td><td>로고 Biosystems</td><td>L12001</td><td>세포 계수기</td></tr><tr><td>미네랄 오일, BioReagent, 분자 생물학, 경유</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>미네랄 오일</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-분자생물학용 테트라메틸에틸렌디아민</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime;,N&prime;-테트라메틸에틸렌디아민</td></tr><tr><td>NaCl(5M), RNase-free</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>써모 피셔</td><td>2516</td><td>&nbsp; 마이크로볼륨 분광 광도계</td></tr><tr><td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>2 mL 딥 웰 96-웰 플레이트</td></tr><tr><td>Non-skirted 96-well PCR 플레이트</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-405</td><td>96-well PCR 플레이트</td></tr><tr><td>NuSive GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>Agarose</td></tr><tr><td>OmniPur 아크릴아미드: 비스-아크릴아미드 19:1, 40% 용액</td><td>MilliporeSigma</td><td>1300-500ML</td><td>40%아크릴아미드/비스-아크릴아</td></tr>미드 <tr><td>OT-2 실험실 로봇</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>자동 액체 처리 로봇</td></tr><tr><td>파라포름알데히드, EM 등급, 정제, 20% 수용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15713</td><td>20% 파라알데히드</td></tr><tr><td>PBS(10x), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>GILSON</td><td></td><td>F123602 P1000 피펫</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1.5 mL Protein low-binding tube</td></tr><tr><td>QIAgen Gel 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>A P1000 피펫</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp; dsDNA 특이적 인터컬레이터 염료</td></tr><tr><td>퀵 라이게이션 키트</td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 DNA 리가제(NEB)</td></tr><tr><td>RNaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>RNAse 억제제</td></tr><tr><td>S-4FB Crosslinker (DMF-soluble)</td><td>Vector laboratories</td><td>S-1004-105</td><td>Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)</td></tr><tr><td>S-HyNic</td><td>Vector laboratories</td><td>S-1002-105</td><td>숙시니미딜 6-히드라지노니코틴산 아세톤 히드라존(S-HyNic)</td></tr><tr><td>아세트산나트륨, 3M, pH 5.2, 분자생물학 등급</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M 아세트산나트륨(pH 5.2)</td></tr><tr><td>중탄산나트륨, 1M 완충액, pH 8.5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>1M 중탄산나트륨 완충액, 분자생물학을 위한 pH 8.5</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>분자생물학을 위한 Na2HPO4</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td>성 <td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV 역전사 효소</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090050</td><td>역전사 효소</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (DMSO에 10,000x 농축액)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11494</td> DNA T4<td>용 인터컬레이터 염료</td></tr><tr><td> DNA 리가제 반응 완충액</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x T4 DNA 리가제 반응 완충액</td></tr><tr><td>ThermoPol 반응 완충액 팩</td><td>New England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x TPM-T 완충액 (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)</td></tr><tr><td>TRIzol LS 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction</td></tr><tr><td>TruSeq Nano DNA library prep kit</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>A DNA 라이브러리 준비 키트(제조업체 지침 참조)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3 참조</td><td>항체용 아민 변형 DNA</td></tr><tr><td>프로브 Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3 참조</td><td>항체</td></tr><tr><td>용 아민 변형 DNA 프로브Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3 참조</td><td>항체용 아민 변형 DNA</td></tr><tr><td>프로브 Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3 참조</td><td>항체용 아민 변형 DNA</td></tr><tr><td>프로브 Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3 참조</td><td>항체용 아민 변형 DNA 프로브</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, 표 3 참조</td><td>IgG</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>15575020 0.5M EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 증류수</td><td>Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>초순수</td></tr><tr><td>Zeba Splin 탈염 컬럼, 7K MWCO, 0.5mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>89882</td><td>탈염 컬럼</td></tr></tbody></table>

반복적인 후성유전체학 분석을 위한 재사용 가능한 단일 세포

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

현재의 단일 세포 에피게놈 분석은 일회용으로 설계되었습니다. 세포는 일회성 사용 후 폐기되어 단일 세포에서 여러 후성유전학적 표지를 분석할 수 없으며 단일 세포에서 실험 배경 잡음과 신호를 구별하기 위해 다른 세포의 데이터가 필요합니다. 이 논문은 반복적인 후성유전체학 분석을 위해 동일한 단일 세포를 재사용하는 방법을 설명합니다. 
이 실험 방법에서 세포 단백질은 단백질과 DNA에 가교하는 대신 먼저 폴리아크릴아미드 폴리머에 고정되어 구조적 편향을 완화합니다. 이 중요한 단계를 통해 동일한 단일 세포로 반복적인 실험이 가능합니다. 다음으로, 근접 결찰을 위한 스캐폴드 서열을 가진 무작위 프라이머를 게놈 DNA에 어닐링하고, DNA 중합효소를 이용하여 연장하여 프라이머에 게놈 서열을 첨가한다. 이어서, 후성유전학적 마커 및 대조군 IgG에 대한 항체는 각각 상이한 DNA 프로브로 표지되어 동일한 단일 세포 내의 각각의 표적에 결합된다. 
근접 라이게이션은 랜덤 프라이머와 항체-DNA 프로브의 스캐폴드 서열에 상보적인 서열을 가진 커넥터 DNA를 부가함으로써 랜덤 프라이머와 항체 사이에 유도된다. 이 접근법은 항체 정보와 주변 게놈 서열을 근접 결찰의 단일 DNA 산물에 통합합니다. 이 방법을 사용하면 동일한 단일 세포로 반복 실험을 수행할 수 있으므로 희귀 세포의 데이터 밀도를 높이고 동일한 세포의 IgG 및 항체 데이터만 사용하여 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법으로 제조된 재사용 가능한 단일 세포는 최소 몇 개월 동안 보관하고 나중에 재사용하여 후성유전학적 특성을 넓히고 데이터 밀도를 높일 수 있습니다. 이 방법은 연구자와 프로젝트에 유연성을 제공합니다.

K562 단일 세포는 단계 8에 기술된 프로토콜을 사용하여 생성되었다( 도 5 참조). 단일세포는 폴리아크릴아미드 비드의 외층에 포매되었다. 세포 DNA를 염색하고 DNA 염색을 위해 인터칼레이터 염료를 사용하여 시각화했습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> 그림 5: 생성된 재사용 가능한 단일 셀. 세포는 DNA (녹색 형광)에 대한 intercalator 염료로 염색됩니다. 흰색 화살표는 폴리아크릴아미드 비드의 바깥층에 매립된 단일 세포를 나타냅니다. 재사용 가능한 단일 셀은 96웰 평평한 바닥 플레이트에 배치됩니다. 이미지는 주사현미경 BZ-X710으로 촬영하였...

본 프로토콜은 재사용 가능한 단일 세포를 사용하여 반복적인 후성유전체 분석을 위한 단일 세포 방법을 설명합니다. 재사용 가능한 단일 세포를 통해 동일한 단일 세포에서 여러 후성유전학적 마크를 분석하고 결과를 통계적으로 검증할 수 있습니다.

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

이 실험 방법은 후성유전체 테스트를 위해 재사용 가능한 단일 세포의 장기 보관을 허용합니다. 또한 동일한 단일 세포에서 많은 후성유전학적 표지와 전사 인자를 분석할 수 있습니다. 단세포 후성유전체 분석을 위한 현재의 방법에서는 동일한 단일 세포를 재분석할 수 없습니다.그러나 재사용 가능한 단일 셀을 사용하면 동일한 단일 셀을 여러 번 재분석할 수 있습니다. 이 기술은 특히 환자 세포의 수가 제한되어 있는 경우 후성유전학적 치료의 진단 및 설계에 유용합니다. 이 방법은 후성유전체 연구, 유전자 발현 조절 및 후성유전학적 표지에 대한 특정 항체를 사용할 수 있는 한 기타 시스템에 가장 적합합니다.이 기법을 처음 시도할 때는 너무 귀중하지 않은 샘플에 대해 연습하고 MiSeq 또는 iSeq 100과 같은 얕은 시퀀싱을 사용하여 실험의 유효성을 검사하는 것이 좋습니다. 시작하려면 깨끗한 층류 후드에서 1 밀리리터의 세포 현탁액과 199 밀리리터의 1 밀리몰 EDTA PBS를 혼합하여 DNA 용 인터 칼레이터 염료를 함유합니다. 혼합 후, 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮긴다.덮개를 96웰 플레이트에 놓고 주사 현미경을 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 다음으로, 플레이트를 기울이고 단일 셀이 우물의 아래쪽 가장자리로 가라 앉을 때까지 몇 분 동안 기다리십시오. 그런 다음 피펫 팁을 하단 모서리에 놓고 단일 세포와 완충액을 PCR 튜브에 옮깁니다.형광현미경을 이용하여 웰을 확인하여 전사를 확인하였다. 단일 세포가 여전히 웰에 있는 경우, DNA에 대한 삽입기 염료를 함유하는 1밀리몰 EDTA PBS를 웰당 200마이크로리터 첨가하고 전달을 반복한다. 이송 후 96-웰 PCR 플레이트에 커버를 놓고 스윙 로터를 이용하여 플레이트를 끊김 없이 원심분리한다.원심분리 후 자동 액체 처리 로봇의 데크에 플레이트를 놓습니다. 그런 다음 보충 코드 1을 액체 처리 로봇의 소프트웨어 창으로 끌어다 놓고 프로그램을 실행하여 매우 느린 피펫팅 속도로 195마이크로리터의 상층액을 제거합니다. 50 마이크로 리터의 4 % TEMED 또는 미네랄 오일을 넣고 실온에서 밤새 플레이트를 배양합니다.다음날, 피펫팅에 의해 미네랄 오일을 제거하고, 200 마이크로리터의 TP 마그네슘 음성 완충액으로 세포를 5회 세척한다. 마지막 세척 후, 상청액을 제거하고, 15 마이크로리터의 어닐링 완충액을 첨가하고, 1시간 동안 얼음 위에서 배양한다. 배양 후 PCR 튜브를 열 순환기에 놓고 섭씨 94도에서 3분 동안 가열합니다.그런 다음 튜브를 얼음 냉각 금속 블록으로 옮기고 2 분 동안 배양합니다. 다음으로, 4 마이크로 리터의 황산 마그네슘 - 염화나트륨, DNTP를 넣고 최대 속도로 와동하여 혼합합니다. 그런 다음 1마이크로리터의 BST 중합효소 큰 조각을 추가하고 볼텍싱으로 혼합한 다음 셰이커에서 4시간 동안 배양합니다.배양 후 PCR 튜브를 열 순환기에 놓고 텍스트에 설명된 대로 4시간 또는 야간 프로그램을 실행합니다. 항체 결합을 위해 1.625 마이크로 리터의 염화나트륨 EDTA BSA 용액을 튜브에 첨가하십시오. 저속으로 소용돌이 치면서 혼합하고 튜브를 얼음 위에서 1 시간 동안 배양합니다.그런 다음 밀리리터당 0.1 마이크로 그램의 항체를 추가하고 항체 프로브와 결합 된 IgG를 조절하십시오. 항체를 추가한 후 부드럽게 흔들면서 얼음 위에서 튜브를 배양합니다. 다음날, 얼음 위에서 200 마이크로리터의 TPM-T 완충액으로 세포를 2회 세척한다.그런 다음 상층액을 제거하고 T4 DNA 리가제 완충액으로 한 번 세척합니다. 다음으로, 19 마이크로 리터의 결찰 어댑터 용액을 첨가하고 섭씨 25도에서 1 시간 동안 배양한다. 그런 다음 1마이크로리터 T4 DNA 리가아제를 추가하고 중간 속도로 볼텍싱하여 튜브를 혼합합니다.열 순환기에 튜브를 놓고 근접 결찰 프로그램을 실행합니다. 실행 후 200 마이크로리터의 BST 마그네슘 음성 EDTA 양성 완충액으로 세포를 두 번 세척하고 섭씨 4도에서 밤새 세포를 보관합니다. 다음날, 200 마이크로리터의 BST 마그네슘 음성 EDTA 음성 완충액으로 세포를 2회 세척하고, BST, DNTPs 및 황산마그네슘을 함유하는 혼합물 20 마이크로리터를 첨가한다.그런 다음 소용돌이 믹서와 혼합하고 궤도 셰이커에서 4 시간 동안 튜브를 배양합니다. 배양 후 튜브를 열 순환기에 놓고 텍스트 원고에 설명된 대로 전체 확장 프로그램을 실행합니다. 다음으로, 다중 변위 증폭을 위해, 0.4 마이크로리터의 100 마이크로몰 제 2 무작위 프라이머를 첨가하고, 와류에 의해 혼합한다.그런 다음 튜브를 오비탈 셰이커에서 2시간 동안 배양한 후 튜브를 섭씨 94도에서 가열하기 위해 열 순환기에 놓습니다. 3분 후, 튜브를 얼음으로 냉각된 금속 블록에 넣고 1마이크로리터의 BST DNA 중합효소를 추가합니다. 튜브를 느린 속도로 소용돌이칩니다.그런 다음 튜브를 열 순환기에 올려 다중 변위 증폭 프로그램을 실행합니다. 프로그램 후 약 20 마이크로 리터의 상청액을 PCR 튜브에 옮기고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음으로, 재사용 가능한 단일 세포를 함유하는 PCR 튜브에 0.05% TWEEN 20 및 0.1X TE 완충액 20마이크로리터를 첨가하고, 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 배양한다.다음날 상청액을 수집하여 이전에 수집 한 상청액과 결합합니다. 그런 다음 50% 글리세롤, 5밀리몰 EDTA, 0.5% BSA 및 0.05% TWEEN 20을 포함하는 재사용 가능한 단일 세포 및 TBS 완충액을 담근 다음 오비탈 셰이커에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 재사용 가능한 단일 세포를 추가로 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.마지막으로 40마이크로리터의 엑소 네거티브 마스터 믹스를 추가하고 튜브를 열 순환기에 올려 텍스트 원고에 설명된 대로 프로그램을 실행합니다. K562 재사용 가능한 단일 세포는 이 프로토콜을 사용하여 생성되었습니다. 단일 세포를 폴리아크릴아미드 비드의 외층에 포매하고 DNA 염색을 위해 인터칼레이터 염료를 사용하여 시각화했습니다.BciVI 소화 전후의 DNA 산물이 여기에 표시됩니다. 소화된 제한효소는 19 내지 20, 31 내지 32, 49, 및 49 초과의 염기쌍 단편을 예상하였다. 또한, 구축된 DNA 라이브러리를 목적 생성물에 대해 모세관 전기영동에 의해 분석하였다.시퀀싱 결과는 항히스톤 H3 아세틸화 라이신 27 및 항히스톤 H3 트리메틸화 라이신 27의 고유한 매핑된 판독값이 대조군 IgG보다 훨씬 더 많다는 것을 나타냅니다. REpi 시퀀싱 신호는 REpi 시퀀싱 데이터를 벌크 ChIP 시퀀싱 데이터와 비교하여 평가되었습니다. 평균적으로 REpi 시퀀싱에서 히스톤 H3 아세틸화 라이신 27 신호의 약 91%가 벌크 ChIP 시퀀싱에서 히스톤 H-3 아세틸화 라이신 27 피크와 겹쳤습니다.비활성 히스톤 마크인 히스톤 H3 트리메틸화 라이신 27에 대한 REpi 시퀀싱의 정밀도는 52%였으며 REpi 시퀀싱의 민감도는 REpi 시퀀싱 재생 판독에 의해 얼마나 많은 벌크 ChIP 시퀀싱의 피크가 검출되었는지 측정하기 위해 분석되었습니다. REpi 시퀀싱의 민감도는 히스톤 H3 아세틸화 라이신 27에서 55.30%, 히스톤 H3 트리메틸화 라이신 27에서 50.94%였습니다. DNS가 없는 시약을 사용해야 합니다.또한 개방 튜브 리드 또는 시약 리드와 관련된 모든 작업은 깨끗한 후드에서 수행해야 합니다. 이 절차의 DNA 산물은 시퀀싱된 다음 게놈에 매핑되어 단일 세포에서 게놈의 어느 영역에 어떤 히스톤 변형이 존재하는지 나타냅니다. 이 기술을 통해 동일한 단일 세포에서 여러 후성유전학적 마크를 분석할 수 있었고 모든 단일 세포에서 다중오믹스 분석을 위한 길을 열었습니다.

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연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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