Name: תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למד שיטה חדשנית לניתוח אפיגנומי איטרטיבי בתא בודד לשימוש חוזר. טכנולוגיה זו מאפשרת ניתוח מרובה של סימנים אפיגנטיים באותו תא, ומספקת בסיס לעיצוב טיפולים אפיגנטיים מדויקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר דיוויד סאנצ'ז-מרטין וד"ר כריסטופר באק על ההערות בשלב ההמשגה של הפרויקט. אנו מודים גם ל-Genomics Core, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות על העזרה בניסויים מקדימים, והמשאב הביואינפורמטי השיתופי, CCR, NCI, NIH על הייעוץ בניתוח חישובי. אנו מודים לגב' אנה וורד על עזרתה באופטימיזציה של DNA פולימראז המשמש בשיטה. עבודה זו השתמשה במשאבים החישוביים של אשכול NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). פרויקט זה נתמך על ידי תוכנית Intramural של המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, פרס החדשנות של מנהל NCI (#397172), וקרנות פדרליות מהמכון הלאומי לסרטן תחת חוזה מס 'HHSN261200800001E. אנו מודים לד"ר טום מיסטלי, קרול תיל, דאגלס ר. לואי ולכל חברי המעבדה לאונקולוגיה תאית על הערות פרודוקטיביות.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

ד"ר אוהנוקי וד"ר טוסאטו הם ממציאים שותפים של פטנט שכותרתו "שיטות להכנת תא בודד לשימוש חוזר ושיטות לניתוח אפיגנום, שעתוק וגנום של תא בודד" (EP3619307 ו- US20200102604). בקשת הפטנט הוגשה בחלקה על סמך תוצאות ראשוניות הקשורות לטכנולוגיה המתוארת בכתב היד הנוכחי. ההמצאה או ההמצאות המתוארות והנטענות בבקשת פטנט זו נעשו בזמן שהממציאים היו עובדים במשרה מלאה של ממשלת ארה"ב. לכן, על פי 45 Code of Federal Regulations Part 7, כל הזכויות, הבעלות והעניין בבקשת פטנט זו הוקצו או צריכים על פי חוק להיות מוקצים לממשלת ארה"ב. ממשלת ארה"ב מעבירה חלק מהתמלוגים שהיא מקבלת לעובדיה הממציאים תחת 15 U.S. Code § 3710c.

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שלב אחר שלב עבור ניתוח רב-אפיגנומי של תא בודד שדווח לאחרונה באמצעות תאים בודדים לשימוש חוזר7. בפסקאות הבאות נדון בנקודות קריטיות, תוך הדגשת מגבלות אפשריות בפרוטוקול. 
אחת הנקודות הקריטיות לאורך הפרוטוקול (משלבים 7.2-13) היא הימנעות מזיהום DNase. לתא בודד יש רק שני עותקים של דנ"א גנומי. לכן, פגיעה בדנ"א הגנומי מפחיתה באופן קריטי את מספר האות. הימנעות מזיהום עם DNase חיונית כדי להגן על שלמות ה- DNA הגנומי. 
חדירות הריא...

טכנולוגיית התא הבודד נכנסת לעידן המולטיומיקס החד-תאי, המשלב טכנולוגיות אומיקס בודדות של תא בודד1. לאחרונה, תעתיק תא בודד שולב עם שיטות לזיהוי נגישות כרומטין (scNMT-seq2 ו- SHARE-seq3) או שינויים בהיסטון (Paired-seq4 ו- Paired-Tag5). לאחרונה, שעתוק חד-תאי ופרוטאומיקה שולבו עם נגישות הכרומטין (DOGMA-seq6). שיטות אלה משתמשות בתיוג מבוסס טרנספוזאז לאיתור נגישות כרומטין או שינויים בהיסטון.
גישות מבוססות טרנספוזאז קוטעות את הדנ"א הגנומי ומוסיפות ברקוד DNA בקצה מקטע הדנ"א הגנומי. כל מקטע גנומי שסוע יכול לקבל רק עד שני ברקודים של דנ"א (= סימן אפיגנטי אחד לכל אתר מחשוף), והדנ"א הגנומי באתר המחשוף אובד. לכן, לגישות מבוססות מחשוף יש פשרה בין מספר הסימנים האפיגנטיים שנבדקו לבין צפיפות האות. זה מעכב את הניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד. שיטה אפיגנומית חד-תאית שאינה מנתקת את הדנ"א הגנומי פותחה כדי להתגבר על בעיה זו 7,8.
בנוסף לנושא שמקורו במחשוף שהוזכר לעיל, לגישות מבוססות טרנספוזאז יש מגבלות נוספות. בניתוח אפיגנום של תא יחיד, חיוני לדעת את מיקומם של היסטונים וחלבונים הקשורים לדנ"א על הגנום. בגישות הנוכחיות, זה מושג על ידי שימוש בתאים בודדים לא קבועים ושימור אינטראקציות חלבון-דנ"א וחלבון-חלבון. עם זאת, זה יוצר הטיה חזקה לאזורי כרומטין נגישים, אפילו בניתוח של שינויים היסטון 9. ניתן לשמר את מיקומם של היסטונים וחלבונים הקשורים לגנום על הגנום ללא קישור בין חלבון-דנ"א לחלבון-חלבון, באמצעות פיגום פוליאקרילאמיד 7,8. גישה זו מפחיתה את ההטיה המבנית שנצפתה בגישות הנוכחיות התלויות באינטראקציות חלבון-דנ"א וחלבון-חלבון.
גישות מבוססות טרנספוזאז יכולות לקבל אותות רק פעם אחת מתא יחיד. לכן, קשה להגדיר את האפיגנום המלא של תא בודד עקב ירידת האותות. תאים בודדים לשימוש חוזר פותחו כדי להתגבר על המגבלות הנוכחיות על ידי מתן אפשרות לניתוח אפיגנומי איטרטיבי באותו תא בודד.

<table><tbody><tr><td>10x CutSmart buffer</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x מאגר עיכול</td></tr><tr><td>200 הוכחה אתנול</td><td>חברת וורנר-גרהם</td><td>200 הוכחה</td><td>אתנול</td></tr><tr><td>5-הידרוקסימתילציטוזין (5-hmC) נוגדן חד שבטי [HMC/4D9]</td> <td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>אנטי-5hmC</td></tr><tr><td>אקרידין תפוז/פרופידיום יודיד כתם</td><td>לוגו Biosystems</td><td>F23001</td><td>מונה תאים</td></tr><tr><td>תמיסת אקרילאמיד, 40% ב-H2O, לביולוגיה מולקולרית</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>40% תמיסת אקרילאמיד</td></tr><tr><td>All-in-One מיקרוסקופ פלואורסצנטי BZ-X710</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>מיקרוסקופ סריקה</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 יחידת סינון צנטריפוגלי</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024</td><td>קלטת אולטרה-סינון</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט לביולוגיה</td> <td>מולקולריתMilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>אבקת אמוניום פרסולפט</td></tr><tr>נטול<td>מים</td><td>DMF וקטור מעבדות</td><td>S-4001-005</td><td>נטול מים N,N-dimethylformamide (DMF)</td></tr> <tr><td>אנטי-RNA פולימראז II CTD חוזר YSPTSPS (פוספו S5) נוגדן [4H8]</td> <td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Anti-Pol II Anti-TRAP220</td></tr><tr><td>/MED1 (phospho T1457) נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>תמיסת אלבומין סרום בקר של New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>, 20 מ"ג/מ"ל ב-H2O, עומס ביולוגי נמוך, ללא פרוטאז, לביולוגיה מולקולרית</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA (טבלה 7)</td></tr><tr><td>Bst DNA פולימראז, שבר גדול</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst DNA פולימראז</td></tr><tr><td>BT10 סדרה 10 ומיקרו; l קצה מחסום</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 קצה שימור נמוך</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>פתרונות מעבדה אוטומטיים</td><td>N/A</td><td>רובוט איסוף אוטומטי של תא יחיד</td></tr><tr><td>CellCelector 4 nl צלחות ננו-באר לשיבוט תא בודד, צלחת S200-100 100K, 24 בארות, ULA</td><td>פתרונות מעבדה אוטומטיים</td><td>CC0079</td><td>4 nL צלחת ננו-באר</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>קורנינג קוסטאר 96-באר, טיפול בתרבית תאים, מיקרופלייט תחתון שטוח</td><td></td><td>3596</td><td>צלחות שטוחות 96 בארות</td></tr><tr><td>אוורור עמוק (אקסו-) DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- צינורות DNA פולימראז</td></tr><tr><td>DNA LoBind, 0.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0.5 מ"ל DNA צינור קשירה נמוכה</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי ראשון</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/ A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי ראשון</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #01</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #02</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #03</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר</td></tr> <tr><td>אקראי שניDNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #04</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #05</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #06</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #07</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #08</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #09</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #10</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #11</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר אקראי שני תא #12</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר אקראי שני</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר סינתזה שני</td> טכנולוגיות <td>DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר</td></tr> <tr><td>סינתזה 2DNA Oligo, מתאם קשירה</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>מתאם קשירה</td></tr><tr><td>DNA Oligo, פריימר שעתוק הפוך</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>פריימר שעתוק הפוך</td></tr><tr><td>DNase I (ללא RNase)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNase I (ללא RNase, 4 U).</td></tr><tr><td>מאגר תגובה DNase I</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x DNase I מאגר (NEB)</td></tr> <tr><td>תערובת dNTP (10 מ"מ כל אחד)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 מ"מ dNTPs</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוצא ארה"ב,</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>סרום בקר עוברי</td>מושבת בחום</tr><tr><td>HiScribe T7 ערכת סינתזת RNA בעלת תפוקה גבוהה</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>E2040S</td><td>תערובת מאסטר שעתוק במבחנה</td></tr><tr><td>נוגדן היסטון H3K27ac</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39133</td><td>אנטי-H3K27ac</td></tr><tr><td>נוגדן היסטון H3K27me3</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39155</td><td>אנטי-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG מסרום ארנב</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>בקרת IgG</td></tr><tr><td>תחמוצת ברזל (II,III) ננו-אבקה מגנטית, 30 ננומטר גודל חלק ממוצע (TEM), אסתר NHS פונקציונלי</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>NHS ester פונקציונלי 30 ננומטר אבקת תחמוצת ברזל</td></tr><tr><td>K-562</td><td>אוסף תרבית מסוג אמריקאי (ATCC)</td> <td>CCL-243</td><td>תאי</td></tr><tr><td>אקרילאמיד ליניארי (5 מ"ג/מ"ל)</td> <td>תרמו פישר</td><td>AM9520</td><td>אקרילאמיד ליניארי</td></tr><tr><td>LUNA-FL מונה תאים פלואורסצנטי כפול</td><td>לוגו Biosystems</td><td>L20001</td><td>מונה תאים</td></tr><tr><td>LUNA שקופיות ספירת תאים, 50 שקופיות</td><td>לוגו Biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי נגד תאים, BioReagent, לביולוגיה מולקולרית, שמן קל</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>שמן מינרלי</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylenediamine לביולוגיה מולקולרית</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime;,N&פריים;-Tetramethylethylenediamine</td></tr><tr><td>NaCl (5 מ'), ללא RNase</td><td>תרמו פישר</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop לייט</td><td>תרמו פישר</td><td>2516</td><td>&nbsp; ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח</td></tr><tr><td>NEST 2 מ"ל 96 בארות צלחת באר עמוקה, V תחתון</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>2 מ"ל באר עמוקה 96</td></tr> בארות <tr><td>צלחת ללא חצאית 96 בארות צלחת PCR</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-405</td><td>96 בארות PCR צלחת</td></tr><tr><td>NuSive GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>Agarose</td></tr><tr><td>OmniPur אקרילאמיד: ביס-אקרילאמיד 19:1, 40% תמיסה</td><td>MilliporeSigma</td><td>1300-500 מ"ל</td><td>40% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד</td></tr><tr><td>OT-2 רובוט מעבדה</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד, דרגת EM, מטוהר, 20% תמיסה מימית</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15713</td><td>20% פררמלדהיד</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7.4</td><td>תרמו פישר</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>A P1000 פיפטה</td></tr><tr><td>צינורות חלבון LoBind, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1.5 מ"ל צינור קשירה נמוכה חלבון</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל QIAgen</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>A P1000 פיפטה</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA מבחן</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp; ערכת קשירה מהירה של צבע אינטרקלטור ספציפי dsDNA</td></tr><tr><td>ניו</td><td>אינגלנד BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 DNA ligase (NEB)</td></tr> <tr><td>RNaseOUT מעכב ריבונוקלאז רקומביננטי</td><td>תרמו פישר</td><td>10777019</td><td>מעכב RNAse</td></tr><tr><td>S-4FB Crosslinker (DMF-soluble)</td> <td>מעבדות וקטור</td><td>S-1004-105</td><td>Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)</td></tr> <tr><td>S-HyNic</td><td>Vector מעבדות</td><td>S-1002-105</td><td>Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate אצטון הידרזון (S-HyNic)</td></tr> <tr><td>נתרן אצטט, 3 M, pH 5.2, ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M נתרן אצטט (pH 5.2)</td></tr> <tr><td>נתרן ביקרבונט, סולן חיץ 1M., pH 8.5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>1M מאגר נתרן ביקרבונט, pH 8.5</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי לביולוגיה מולקולרית</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי לביולוגיה מולקולרית</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV reverse transcriptase</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090050</td><td>Reverse Transcriptase</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (תרכיז פי 10,000 ב-DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11494</td><td>צבע אינטרקלטור ל-DNA</td></tr><tr><td>T4 מאגר תגובת DNA ליגאז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x T4 מאגר תגובה DNA ליגאז</td></tr><tr><td>חבילת מאגר תגובה ThermoPol</td> ניו <td>אינגלנד BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x מאגר TPM-T (Tris-HCl / פוטזיום כלוריד / מגנזיום סולפט / טריטון X-100)</td></tr> <tr><td>מגיב TRIzol LS</td><td>תרמו פישר</td><td>10296-028</td><td>מיצוי גואנידיניום תיוציאנט-פנול-כלורופורם</td></tr><tr><td>ערכת הכנה לספריית DNA TruSeq Nano</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>ערכת הכנת ספריית DNA (ראה גם הוראות היצרן)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>בדיקת DNA מותאמת אמין לנוגדנים</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, ראה טבלה 3</td><td>בדיקת DNA שונה אמין לבקרה IgG</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase מים מזוקקים</td><td>תרמו פישר</td><td>10977023</td> עמודי התפלת <td>ספלין מים טהורים במיוחד</td></tr><tr><td>, 7K MWCO, 0.5 מ"ל</td><td>תרמו פישר</td><td>89882</td><td>עמודת התפלה</td></tr></tbody></table>

תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

ניתוחי אפיגנום חד-תאיים נוכחיים מיועדים לשימוש חד-פעמי. התא מושלך לאחר שימוש יחיד, מה שמונע ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים בתא בודד ודורש נתונים מתאים אחרים כדי להבחין בין אות לרעשי רקע ניסיוניים בתא בודד. מאמר זה מתאר שיטה לשימוש חוזר באותו תא בודד לצורך אנליזות אפיגנומיות איטרטיביות. 
בשיטה ניסיונית זו, חלבונים תאיים מעוגנים תחילה לפולימר פוליאקרילאמיד במקום להצליב אותם לחלבון ולדנ"א, ובכך להקל על הטיה מבנית. שלב קריטי זה מאפשר ניסויים חוזרים ונשנים עם אותו תא בודד. לאחר מכן, פריימר אקראי עם רצף פיגום לקשירת קרבה מחושל לדנ"א הגנומי, והרצף הגנומי מתווסף לפריימר על ידי הרחבה באמצעות DNA פולימראז. לאחר מכן, נוגדן כנגד סמן אפיגנטי ובקרת IgG, שכל אחד מהם מסומן בבדיקות DNA שונות, קשורים למטרות בהתאמה באותו תא בודד. 
קשירת קרבה נוצרת בין הפריימר האקראי לבין הנוגדן על ידי הוספת DNA מחבר עם רצפים משלימים לרצף הפיגום של הפריימר האקראי ובדיקת הנוגדן-DNA. גישה זו משלבת מידע נוגדנים ורצפי גנום סמוכים בתוצר DNA יחיד של קשירת קרבה. על ידי הפעלת ניסויים חוזרים עם אותו תא בודד, שיטה זו מאפשרת עלייה בצפיפות הנתונים מתא נדיר וניתוח סטטיסטי באמצעות נתוני IgG ונוגדנים בלבד מאותו תא. התאים הבודדים לשימוש חוזר שהוכנו בשיטה זו יכולים להיות מאוחסנים לפחות מספר חודשים ונעשה בהם שימוש חוזר מאוחר יותר כדי להרחיב את האפיון האפיגנטי ולהגדיל את צפיפות הנתונים. שיטה זו מספקת גמישות לחוקרים ולפרויקטים שלהם.

K562 תאים בודדים נוצרו באמצעות הפרוטוקול המתואר בשלב 8 (ראה איור 5). תאים בודדים הוטמעו בשכבה החיצונית של חרוז הפוליאקרילאמיד. הדנ"א של התא הוכתם והודגם באמצעות צבע אינטרקלטור להכתמת DNA.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> איור 5: יצירת תאים בודדים הניתנים לשימוש חוזר. תאים מוכתמים בצבע אינטרקלטור עבור DNA (פלואורסצנטיות ירוקה). חיצים ל...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חד-תאית לאנליזות אפיגנומיות איטרטיביות באמצעות תא בודד לשימוש חוזר. התא הבודד הניתן לשימוש חוזר מאפשר ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד ותיקוף סטטיסטי של התוצאות.

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

שיטה ניסיונית זו מאפשרת אחסון ארוך טווח של תאים בודדים לשימוש חוזר לבדיקות אפיגנומיות. זה גם מאפשר ניתוח של סימנים אפיגנטיים רבים וגורמי שעתוק באותו תא בודד. בשיטות הנוכחיות לניתוח אפיגנום של תא יחיד, לא ניתן לנתח מחדש את אותם תאים בודדים.עם זאת, עם תאים בודדים לשימוש חוזר, אותם תאים בודדים ניתן לנתח מחדש פעמים רבות. טכניקה זו שימושית לאבחון ועיצוב של טיפול אפיגנטי, במיוחד כאשר תאי המטופל מוגבלים במספרם. שיטה זו מתאימה ביותר לחקר האפיגנום, ויסות ביטוי גנים ומערכות אחרות כל עוד קיימים נוגדנים ספציפיים לסימנים אפיגנטיים.כאשר אתה מנסה לראשונה טכניקה זו, אנו ממליצים לך להתאמן על דגימות שאינן יקרות מדי, ואתה לאמת את הניסוי באמצעות ריצוף רדוד כגון MiSeq או iSeq 100. כדי להתחיל, במכסה מנוע זרימה למינרית נקייה, מערבבים מיליליטר אחד של תרחיף תאים ו-199 מיליליטר של מילימולר EDTA PBS המכיל צבע אינטרקלטור לדנ"א. לאחר הערבוב, להעביר 200 מיקרוליטר של השעיית התא לכל באר של צלחת 96 באר תחתית שטוחה.הניחו את הכיסוי על צלחת 96 בארות וסרקו את הצלחת באמצעות מיקרוסקופ סורק. לאחר מכן, הטו את הצלחת והמתינו מספר דקות עד שהתא הבודד שקע לקצה התחתון של הבאר. לאחר מכן מניחים את קצה פיפטה בפינה התחתונה ומעבירים את התא הבודד ואת המאגר לצינור PCR.בדוק את הבאר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את ההעברה. אם תא בודד עדיין נמצא בבאר, הוסיפו 200 מיקרוליטר לבאר של PBS EDTA מילימולרי אחד המכיל צבע אינטרקלטור לדנ"א וחזרו על ההעברה. לאחר ההעברה, הניחו כיסוי על צלחת ה-PCR בעלת 96 הקידוחים וצנטריפוגו את הצלחת באמצעות רוטור נדנדה ללא הפסקה.לאחר הצנטריפוגה, הניחו את הצלחת על סיפון רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים. לאחר מכן, גרור ושחרר את הקוד המשלים אחד לחלון התוכנה של הרובוט לטיפול בנוזלים והפעל את התוכנית כדי להסיר 195 מיקרוליטר של supernatant עם מהירות pipetting איטית מאוד. מוסיפים 50 מיקרוליטר של 4% TEMED או שמן מינרלי ודוגרים על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורת החדר.למחרת, להסיר את השמן המינרלי על ידי pipetting ולשטוף את התאים חמש פעמים עם 200 מיקרוליטר של TP מגנזיום שלילי חיץ . לאחר השטיפה האחרונה, להסיר את supernatant, להוסיף 15 מיקרוליטר של חיץ חישול, לדגור על קרח במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, מניחים את צינורות ה-PCR על מחזור תרמי ומחממים ב-94 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.לאחר מכן מעבירים את הצינורות לגוש מתכת מקורר קרח ודגרים במשך שתי דקות. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיקרוליטרים של מגנזיום גופרתי-נתרן כלורי, DNTP לערבב ולערבב על ידי מערבול במהירות מקסימלית. לאחר מכן מוסיפים מיקרוליטר אחד של BST פולימראז פרגמנט גדול, מערבבים על ידי מערבולת, ודוגרים במשך ארבע שעות על שייקר.לאחר הדגירה, הניחו את צינור ה-PCR על מחזור תרמי והפעילו תוכנית של ארבע שעות או לילה כמתואר בטקסט. לקשירת נוגדנים, הוסף 1.625 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלורי EDTA BSA לצינור. מערבבים על ידי מערבולות במהירות נמוכה ודגרים על הצינור על קרח במשך שעה.לאחר מכן להוסיף 0.1 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדנים ולשלוט IgG מצומד עם בדיקת נוגדנים. לאחר הוספת הנוגדנים, לדגור את הצינורות על קרח עם רעד עדין. למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של חיץ TPM-T על קרח.לאחר מכן הסירו את הסופרנאטנט ושטפו פעם אחת עם מאגר ליגאז T4 DNA. לאחר מכן, להוסיף 19 מיקרוליטר של פתרון מתאם קשירה לדגור במשך שעה אחת ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף ליגאז DNA T4 מיקרוליטר אחד וערבב את הצינור על ידי מערבולות במהירות בינונית.הניחו את הצינור על מחזור תרמי והפעילו את תוכנית קשירת הקרבה. לאחר הריצה, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר מגנזיום שלילי EDTA חיובי BST ואחסנו את התאים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר מגנזיום שלילי EDTA שלילי BST, והוסיפו 20 מיקרוליטר של תערובת המכילה BST, DNTPs ומגנזיום גופרתי.לאחר מכן מערבבים עם מערבל מערבולת ודגרים על הצינור במשך ארבע שעות על שייקר מסלולי. לאחר הדגירה, הניחו את הצינור על מחזור תרמי והפעילו את תוכנית ההרחבה המלאה כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, להגברה של תזוזה מרובה, הוסיפו 0.4 מיקרוליטר של פריימר אקראי של 100 מיקרומולרית שנייה, וערבבו על ידי מערבולת.לאחר מכן, לדגור על הצינור במשך שעתיים על שייקר מסלול לפני הנחת הצינור על מחזור תרמי לחימום ב 94 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש דקות, הניחו את הצינורות בגוש מתכת מקורר קרח והוסיפו מיקרוליטר אחד של BST DNA פולימראז. מערבלים את הצינורות במהירות איטית.לאחר מכן הניחו את הצינורות על מחזור תרמי כדי להפעיל את תוכנית הגברת התזוזה המרובה. לאחר התוכנית, להעביר כ 20 מיקרוליטר של supernatant לצינור PCR, ולאחסן אותו ב מינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטר של 0.05% TWEEN 20 ו-0.1X TE לצינור PCR המכיל את התא הבודד הרב-פעמי, ודגרו על הצינור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, אספו את הסופרנאטנט ושלבו אותו עם הסופרנאטנט שנאסף קודם לכן. לאחר מכן, השרו את התא הבודד הרב-פעמי ואת מאגר TBS המכיל 50% גליצרול, EDTA של חמישה מילימולרי, 0.5% BSA ו-0.05% TWEEN 20, ולאחר מכן דגרו עליו במשך 30 דקות על שייקר מסלולי. לאחר הדגירה, יש לאחסן את התא הבודד הרב-פעמי בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.לבסוף, הוסף 40 מיקרוליטר של תערובת מאסטר שלילית של Exo, והנח את הצינור על מחזור תרמי כדי להפעיל את התוכנית כמתואר בכתב היד של הטקסט. K562 תאים בודדים לשימוש חוזר נוצרו באמצעות פרוטוקול זה. תאים בודדים הוטמעו בשכבה החיצונית של חרוז הפוליאקרילאמיד והודמיינו באמצעות צבע אינטרקלטור להכתמת DNA.מוצרי DNA לפני ואחרי עיכול BciVI מוצגים כאן. עיכול אנזים ההגבלה יצר את 19 עד 20, 31 עד 32, 49 ויותר מ-49 שברי זוגות בסיסים. יתר על כן, ספריית ה- DNA שנבנתה נותחה על ידי אלקטרופורזה נימית עבור המוצרים הרצויים.תוצאות הריצוף הצביעו על כך שהקריאות הממופות הייחודיות מליזין 27 אנטי-היסטון H3 אצטילאט וליזין 27 טרימתילציה אנטי-היסטון H3 היו רבות יותר באופן משמעותי מאשר מקבוצת הביקורת IgG. אותות ריצוף REpi הוערכו על ידי השוואת נתוני ריצוף REpi עם נתוני ריצוף ChIP בכמות גדולה. בממוצע, כ-91% מהאותות של היסטון H3 אצטילאט ליזין 27 מריצוף REpi חפפו לליזין 27 אצטילאט היסטון H-3 הגיעו לשיאם בריצוף ChIP בתפזורת.הדיוק של ריצוף REpi עבור סימן ההיסטון הלא פעיל, היסטון H3 טרימתילציה ליזין 27 היה 52%הרגישות של ריצוף REpi נותחה כדי למדוד כמה שיאים של ריצוף ChIP בתפזורת זוהו על ידי ריצוף REpi קריאות משוכפלות. הרגישות של ריצוף REpi הייתה 55.30% בהיסטון H3 אצטילאט ליזין 27 ו-50.94% בהיסטון H3 טרימתילציה ליזין 27. אנא הקפד להשתמש בריאגנטים נטולי DNS.כמו כן, כל הפעולות הכוללות את מוליכי צינור הפתיחה או מוליכי מגיב צריכות להתבצע במכסה מנוע נקי. תוצרי דנ"א של הליך זה מרוצפים ולאחר מכן ממופים לגנום כדי לגלות אילו שינויים בהיסטון קיימים, באילו אזורים של הגנום בתאים בודדים. טכנולוגיה זו אפשרה לנתח סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד וסללה את הדרך לניתוח מולטיומיקה בכל תא בודד.

reusable-single-cell-for-iterative-epigenomic-analyses

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

שיטות למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA in vivo הופכות חיוניות לכל היבט של מחקר גנומי, אך הן מייגעות, יקרות וגוזלות זמן. כאן מוצגת מערכת רובוטית לטיפול בנוזלים זמינה מסחרית המבצעת אוטומציה של משקעים חיסוניים של כרומטין למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA in vivo עם כמויות מוגבלות של תאים.

אוטומציה של ניסויי שבב seq כדי ליצור פרופילים אפיגנטיים על 10,000 תאים הלה

תא בודד רצף חושף הטרוגניות genotypic במערכות ביולוגיות, אך טכנולוגיות הנוכחי חוסר התפוקה הכרחי עבור פרופיל עמוק של הקהילה הרכב ותפקוד. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה microfluidic עבור רצף &gt; הגנום בתא יחיד 50,000 מ מגוונות תא אוכלוסיות.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

תפזורת ג'ין ביטוי מדידות ענן תא בודד הבדלים באוכלוסיות הטרוגניות תא. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור ביטוי מפענוח ואינדקס איך החד-תאיים מיון על-ידי Florescence מופעל התא מיון (FACS) יכול להיות משולב על הטרוגניות, immunophenotypically מאפיינות אוכלוסיות תאים נפרדים מולקולרי.

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללי, בקרת איכות בודק הדרושים להכנת בריאים למבוגרים תאים בודדים בתרבית של תפוקה גבוהה, מבוסס-droplet תא בודד RNA-Seq ההכנות. קביעת רצף פרמטרים, יישור קריאה וניתוח bioinformatic תא בודד במורד הזרם הינם גם מסופקים.

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

CUT&amp;RUN והוריאנטים שלה יכולים לשמש לקביעת תפוסת החלבון בכרומטין. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע לוקליזציה של חלבון על כרומטין באמצעות uliCUT&amp;RUN של תא יחיד.

לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.

חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק

הפרוטוקול משלב טכנולוגיית אורגנואיד מעיים אנושיים עם ניתוח תעתיק של תא בודד כדי לספק תובנה משמעותית לגבי ביולוגיית המעי שלא נחקרה בעבר.

שימוש באורגנואידים של המעי האנושי כדי להבין את אפיתל המעי הדק ברמת השעתוק של תא בודד

מחקר זה מציג פרוטוקול מולטיאום מרחבי Trekker–CUT&amp;Tag, המשלב ברקידוד מרחבי ישיר של חתך רקמה עם ניתוח מולטיאום חד-תאים. גישה זו מאפשרת פרופילינג חד-תאי של ביטוי גנים ושינוי ההיסטון H3K27ac בו-זמנית, ומציעה תובנות מכניות על ויסות גנים בהקשר של מיקרואנטומיה של רקמות.

לאחר פתרון מרחבי, פרופיילינג מולטיאומי חד-תאי משולב של מטרות טרנסקריפטום ואפיגנומיה בחתכי רקמה קפואים.

למד שיטה חדשנית לניתוח אפיגנומי איטרטיבי בתא בודד לשימוש חוזר. טכנולוגיה זו מאפשרת ניתוח מרובה של סימנים אפיגנטיים באותו תא, ומספקת בסיס לעיצוב טיפולים אפיגנטיים מדויקים.

תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים

גלה סרטונים נוספים