Name: 생물 의학 연구에 사용하기위한 3D 송곳니 간 및 장 오가노이드 문화의 표준화 및 유지 보수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 개 간 및 장 오가노이드 분리, 배양, 바이오뱅킹을 위한 표준화된 3D 오가노이드 문화 프로토콜. 이 방법은 감염병 연구와 약물 테스트에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 모델을 제공합니다.

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저자들은 아이오와 주립 대학 직원의 수의학 진단 실험실, 즉 헤일리 M. 램버트, 에밀리 라헤, 로잘린 M. 브라나만, 빅토리아 J. 그린, 제니퍼 M. 그로엘츠-아구창에게 제공된 샘플의 적시 처리에 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 교수진 스타트업, ISU VPR 밀러 상, ISU VPR 밀러 어워드, NSF SBIR 하위 어워드에서 ISU # 1912948에 대한 지원을 인정하고자 합니다.

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<li>Favier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COMMD1-Deficient+dogs+accumulate+copper+in+hepatocytes+and+provide+a+good+model+for+chronic+hepatitis+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis.</a> PLoS ONE. 7 (8), 42158(2012).</li>
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<li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408(2020).</li>
<li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+enteroids%3A+A+new+model+to+study+human+rotavirus+infection%2C+host+restriction%2C+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li>
<li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430(2019).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
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</ol>

K. Allenspach는 LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions의 공동 설립자입니다. 그녀는 Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics 및 Mars의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. J. P. Mochel은 LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions의 공동 설립자입니다. Mochel 박사는 Ceva Animal Health 및 Ethos Animal Health의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. 다른 저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

현재 송곳니 간 및 장 오가노이드의 분리 및 유지에 사용할 수있는 표준화 된 프로토콜이 부족합니다. 오가노이드 배양에 대한 표준 운영 절차를 수립하는 것은이 모델이 다른 실험실 환경에서 적용 될 수 있도록 보증됩니다. 특히, 이러한 송곳니 오가노이드 모델의 배양을 위한 표준화된 작동 프로토콜을 제공하는 것은 확장 및 유지를 위한 최적의 시점을 도출하기 위해 배양 및 패시징 동안 오가노이드의 정상적인 성장을 특성화하는 데 핵심입니다. 상기 프로토콜을 사용하여 배양된 송곳니 장내 오가노이드는 이전에 Chandra et al.12에 의해 특성화되었다.
프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 오가노이드의 통과입니다. 간 구상체의 첫 번째 통과에 대한 최적 시간은 간 스페로이드 측정에 기초하여 분리 후 7 일째로 결정되었다. 구상체의 최대 부피는 7 일째까지 달성되었으며, 동시에 구상체가 싹을 틔우기 시작하여 간 오가노이드를 형성했습니다. 단리 후 2-7일째부터 전체 오가노이드 부피의 증가는 365배 이상이었으며, 이는 최적의 통과 시간이 송곳니 장내 오가노이드 배양물보다 더 길다는 것을 시사한다. 배양 7일 후, 세척 또는 계류 없이도 간 스페로이드에서 세포 사멸의 총체적인 징후가 관찰되지 않았다(도 7). 장 및 간 오가노이드를 통과시키는 것은 절차가 세포의 손실과 변화된 생존력으로 이어질 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 결과는 트립신-유사 프로테아제를 사용한 간 오가노이드의 장기간 배양(최대 12분)이 계대 배양에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 오가노이드를 트립신 유사 프로테아제에서 24분 이상 인큐베이션하는 것은 오가노이드의 후속 계대배양에 해로울 수 있다.
오가노이드 통로가있는 세포 클러스터에서 차선책의 파손의 경우, 트립신과 같은 프로테아제를 사용한 장기간의 배양 대신 기계적 해리가 더 유익 할 수 있습니다. 오가노이드의 적절한 해리와 함께 문제가 발생하면 통과 수율을 향상시키기 위해 샘플의 간단한 볼텍싱이 시도 될 수 있습니다. 반면에 볼텍싱은 배양을 망치고 세포를 손상시킬 가능성이 있으므로 다른 절차가 반복적으로 실패한 경우에만 사용해야합니다. 간 오가노이드를 단일 세포로 분해하면 오가노이드의 성장 속도가 낮아지고 세포 클러스터로 분해하면 생존력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 십분은 오가노이드 프로토콜에 대한 인큐베이션 시간으로서 선택되었다. 12분 인큐베이션 시점은 트립신 유사 프로테아제 실험에서 24분 인큐베이션에 비해 세포독성이 없는 것으로 간주되었다.
생존 가능성 실험은 송곳니 간 오가노이드가 불리한 조건 (구조적 및 영양 고갈)에서 최대 19.5 일 동안 생존 할 수 있음을 확인했습니다. 이러한 조건에서 가장 오래 살아남은 오가노이드는 CMGF+ 배지로 배양되었다. 이 관찰은 Rock 억제제 및 GSK3β로 보충되지 않은 배지에서 간 오가노이드의 느린 성장으로 인해 발생했을 수 있습니다. CMGF+ R/G를 이용한 오가노이드 문화는 더 빠르게 성장했고 자원을 더 빨리 고갈시켰을 수도 있다. 이 실험은 송곳니 오가노이드 배양을 소형화하여 높은 처리량의 시스템 변환을 달성 할 수있는 가능성을 열어줍니다. 이러한 기술은 실질적으로 감소된 비용으로 약물 발견 또는 독성학 연구를 용이하게 할 수 있는 잠재력을 보여준다.
송곳니 오가노이드 배양 유지 보수 중에 발생하는 몇 가지 일반적인 문제는 도금시 부적절한 샘플 응고, 배양 오염 및 오가노이드의 적절한 밀도와 크기를 확립하는 것입니다. 가용화된 ECM이 도금 중에 조기에 응고되면 즉시 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 가용화된 ECM이 돔형 구조를 형성하지 않으면, 샘플로부터 충분한 매질이 제거되지 않았을 가능성이 있다. 이 경우 돔이 형성 될 때까지 샘플을 더 가용화 된 ECM으로 희석하십시오.
곰팡이 또는 박테리아 오염이 전체 플레이트에서 발견되면 ( 그림 4 참조), 가장 좋은 해결책은 플레이트를 버리는 것입니다. 항진균제 또는 항생제로 치료할 수는 있지만 그러한 시도의 성공은 매우 낮습니다. 단일 웰이 플레이트에 오염되면, 실행 가능하고 영향을받지 않는 웰을 새 플레이트로 청소하고 (4.1 ~ 4.5 단계를 따르십시오) 면밀히 모니터링 할 수 있습니다. 샘플이 이미 비상 냉동 된 경우 샘플을 해동하면 인큐베이터가 추가 오염 위험에 노출되므로 전체 샘플을 버리는 것이 좋습니다.
건강한 오가노이드 배양은 적어도 배지 크기 및 중간 밀도 범주 또는 그 이상이어야 한다. 최적의 밀도는 오가노이드 배양 성장에 매우 중요합니다. 낮은 밀도는 오가노이드를 중간 밀도로 청소하여 수정해야합니다. 극단적 인 밀도의 상황이 발생하면 (과밀), 오가노이드는 더 많은 우물로 확장되어야합니다. 세포 아폽토시스의 총체적인 징후는 종종 오가노이드 문화의 과밀과 낮은 밀도를 동반합니다. 이러한 문제가 제 시간에 시정되지 않으면 전체 오가노이드 문화가 며칠 만에 사멸 적으로 변할 것입니다. 오가노이드가 매우 큰 크기 또는 매우 높은 밀도를 달성하는 경우, 배양물은 실험, 동결 또는 고정에 사용되어야합니다.
오가노이드 배지에는 현재 17 가지 구성 요소가 포함되어 있으므로 오가노이드 유지 및 확장에 필요한 성장 인자를 추가하는 것은 비용이 많이 들 수 있습니다. 이 문제는 조건화 된 CMGF +를 생산하기 위해 성장 인자를 합성하는 2D 세포 배양물을 성장시킴으로써 해결 될 수 있습니다. 세포 배양 L-WRN은 Wnt-3a, R-Spondin-3 및 Noggin 성장 인자37을 생산한다. 세포 콜로니는 90% DMEM/F12 및 10% FBS 배양 배지를 사용합니다. 문화가 90 %의 합류율을 달성하면 미디어는 1 주 동안 매일 수확됩니다. 수확 된 배지는 2x CMGF + (이러한 성장 인자 없음)와 혼합됩니다. 2D 배양은 비용의 일부만으로 필요한 성장 인자를 생산할 수 있지만 미디어를 생산하기위한 추가 시간과 준비가 예상되어야합니다. 조건화된 배지 배치 사이의 성장 인자의 농도는 또한 다를 수 있다37,38.
송곳니 성인 줄기 세포 유래 오가노이드 배양은 One Health Initiative39의 목표를 달성하는 데 도움이되는 독특한 생물 의학 모델입니다. 오가노이드 기술은 발달 생물학, 병리 생리학, 약물 발견 및 테스트, 독성학에서 전염병 및 재생 의학 연구에 이르기까지 많은 기본 및 생물 의학 연구 분야에서 사용될 수 있습니다40. 번역 및 역번역 연구는 송곳니 오가노이드가 적용 가능한 영역입니다15. 개는 번역 실험 환경에서 수세기 동안 사용되어 왔으며, 동반자 동물 지위는 수의학에서 가장 많이 탐구 된 종 중 하나로서의 입지를 촉진했습니다.
결론적으로,이 원고는 다양한 생물 의학 분야에서이 모델의 적용을 용이하게하기 위해 송곳니 간 및 장 오가노이드의 분리, 유지 보수, 수확 및 바이오 뱅킹을위한 표준화 된 운영 프로토콜을 제공합니다. 이 모델은 지식의 학제 간 및 학제 내 공유를 촉진하기위한 One Health Initiative의 도구로서 역 번역 연구를 촉진하는 데 독특하게 적합합니다.

설치류는 생물 의학 및 번역 연구에 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델입니다1. 그들은 만성 다인자 질환에 대한 임상 적 관련성이 최근에 의문을 제기하고 있지만, 질병의 기본 분자 병인을 조사하는 데 매우 유용합니다2. 송곳니 모델은 설치류와 비교하여 몇 가지 장점을 나타냅니다.3,4. 개와 인간은 가축화의 다양한 기간 동안 인간의 식단 섭취로 인해 개발 된 대사체학 및 장내 미생물의 유사성을 공유합니다5,6,7. 송곳니와 인간의 위장 해부학 및 생리학 사이의 유사성은 또 다른 예입니다8.
또한, 개들은 종종 주인과 비슷한 환경과 생활 방식을 공유합니다9. 설치류에 비해 개들의 수명이 길수록 수많은 만성 질환의 자연 발달이 가능합니다10. 염증성 장 질환 또는 대사 증후군은 인간과 개 사이에 중요한 유사성을 공유하는 다인자성 만성 질환의 예이다11,12. 자연적으로 발생하는 질병을 앓고있는 개를 포함하는 송곳니 전임상 시험은 설치류 모델에서 얻은 것보다 더 신뢰할 수있는 데이터를 생성 할 수 있습니다13. 그러나, 살아있는 동물 연구의 사용을 최소화하고 3Rs(Reduce, Refine, Replace)14의 원칙을 준수하기 위해, 3D 시험관내 송곳니 오가노이드를 이용한 생체내 시험에 대한 대안이 등장하였다15.
오가노이드는 원래 장기의 생리학 및 미세 해부학을 재구성하는 자체 조립 된 3D 줄기 세포 유래 구조입니다16,17. 이 기술은 200917 년 Sato et al.에 의해 처음 기술되었으며 2D 암 세포 배양물을 사용하여 이전에 가능했던 것보다 상피 세포주에서 더 많은 번역 가능한 시험관 내 연구를 허용했습니다18,19,20. 오가노이드는 전임상 독성학21,22,23, 흡수 또는 대사 연구 24,25,26,27,28뿐만 아니라 개인화 된 의학적 접근법과 같은 많은 생물 의학 분야에서 시험관 내 모델에서 유용합니다.29,30,31 . 송곳니 장 오가노이드의 성공적인 배양은 201912 년에 처음으로 기술되었으며, 개에서 유래 한 간 오가노이드는 201532 년 Nantasanti et al.에 의해 처음보고되었습니다. 송곳니 오가노이드는 이후 송곳니 만성 장병증, 위장관 기질 종양, 대장 선암종12 및 윌슨병33,34를 조사하는 연구에 성공적으로 사용되었습니다.
성체 줄기 세포는 부검을 통해 수확 될 수 있지만, 오가노이드 기술은 항상 동물을 희생 할 필요는 없습니다. 내시경 및 복강경 생검, 또는 심지어 장기의 미세바늘 흡인물35은 상피 오가노이드 분리를 위한 성체 줄기 세포의 실행 가능한 공급원이다12. 수의학 실습에서 이러한 비 침습적 기술의 광범위한 사용은 역 번역 연구 (수의학 임상 실습에서 인간 임상 실습으로 또는 그 반대의 경우도 마찬가지)를위한 옵션을 용이하게합니다 15. 오가노이드 기술의 발전은 오가노이드 배양 및 유지 보수 방법의 표준화에 의해 보장 될 수 있습니다. 여기에 제시된 오가노이드 프로토콜은 부분적으로 201536 년 Saxena et al.의 이전에 발표 된 연구를 기반으로하며, 방법은 송곳니 장 및 간 오가노이드 배양의 특이성에 맞게 조정되었습니다. 송곳니 오가노이드 프로토콜의 전체 워크플로우는 그림 1에 묘사되어 있습니다.
송곳니 오가노이드 분리 프로토콜은 내시경, 복강경 및 외과 생검 및 부검에서 샘플을 얻는 방법을 소개합니다. 그것은 실험실로 수송하는 데 사용되는 조직 샘플과 방법론의 초기 전처리를 설명합니다. 오가노이드 분리에 필요한 재료 및 시약은 '분리 준비'섹션에 요약되어 있습니다. 조직 샘플로부터 성체 줄기세포를 분리하는 과정은 추가로 상세히 설명된다. 마지막으로, 가용화된 세포외 막 매트릭스를 사용하여 오가노이드를 돔형 구조로 도금하는 과정이 논의된다.
두 번째 프로토콜 인 Canine Organoid Maintenance Protocol은 오가노이드를 문서화하고 배양하는 방법을 설명합니다. 미디어 변경 사항 및 빈도에 대해서는 이 섹션에서 설명합니다. 또한, 3D 송곳니 오가노이드의 성공적인 유지를 보장하는 데 필수적인 세포 배양물을 통과 및 청소하는 것과 같은 실험실 절차가 설명됩니다. 적절한 통과는 프로토콜의 중요한 단계이며,이 단계의 가능한 조정 및 문제 해결은 원고에서 더 자세히 논의됩니다.
마지막 프로토콜은 파라핀 임베딩 및 RNA 보존을 위해 완전히 자란 오가노이드를 준비하는 방법을 포함하는 송곳니 오가노이드 수확 및 바이오 뱅킹 프로토콜입니다. 액체 질소 저장소에서 오가노이드 샘플을 바이오뱅킹하는 방법 또한 여기에 기재되어 있다. 마지막으로, 냉동 샘플을 해동하고 성장을 지원하는 방법이 논의됩니다.
결론적으로,이 기사는 실험실 간 프로토콜의 표준화를 통해 일관된 송곳니 오가노이드 배양 절차를 제공하는 것을 목표로합니다. 이를 통해 원고는 송곳니 오가노이드 모델에서 파생 된 데이터의 재현성을 촉진하여 번역 생물 의학 연구에서의 관련성을 높이는 것을 목표로합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> 그림 1: 송곳니 오가노이드 프로토콜의 워크플로우. 송곳니 오가노이드 분리 프로토콜은 오가노이드 분리에 필요한 재료의 준비, 조직 샘플의 수확 (부검, 내시경, 복강경 및 외과 생검 수단을 통해) 및 세포 집단의 세포 해리 및 도금에 대한 지침을 설명합니다. 송곳니 오가노이드 유지 보수 프로토콜은 오가노이드 문화의 청소 및 통과에 대해 논의합니다. 오가노이드 수확 및 바이오뱅킹 프로토콜은 파라핀 임베딩 및 추가 오가노이드 특성화를 위한 오가노이드 샘플의 준비에 대해 논의합니다. 유기 세포 배양물을 바이오 뱅크하고 액체 질소의 저장에서 부활시키는 방법도 논의됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>킬레이트 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-소르비톨</td><td>피셔 케미컬</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>피셔 케미컬</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>시그마</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>S5136-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>피셔 케미컬</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>펜 연쇄상 렵족성</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>피셔 케미컬</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>오가노이드 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-가스트린 I 인간</td><td>시그마</td><td>G9145-.5 MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>PeproTech</td><td>9094360</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 서플리먼트</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR 라이프 사이언스</td><td>J848-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>휴먼 R-Spondin-1</td><td>PeproTech</td><td>120-38-500 UG</td><td></td></tr><tr><td>쥐 EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-1 MG</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38-250 UG</td><td></td></tr><tr><td>쥐 Wnt-3 a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 서플리먼트</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸-L-시스테인</td><td>시그마</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>프리모신</td><td>인비베인젠</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제(Y-27632)</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>SCM 075</td><td></td></tr><tr><td>SB202190(P38 억제제)</td> <td>Sigma</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>줄기 분자 CHIR99021(GSK3&베타;)</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td>T7883-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamethoxazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7507-10G</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td> <td>Fisher Chemicals</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, pH 8.0, 0.5 M</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드(37%)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>F79P-4</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액 Sigma</td><td></td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>오가노이드 배양용 마트리겔 매트릭</td>스 <td>Corning</td><td>356255</td><td>세포외막 매트릭스</td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 97%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X(인산염 완충 식염수)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X(인산염 완충 식염수)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Soln.</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td>RNA 저장 시약</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>트립신 유사 프로테아제</td></tr><tr><td>기타</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>ACD Hybez II 하이브리드화 시스템</td><td>ACD a biotechne 브랜드</td><td>321710</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브, 15mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>BCS-405MC</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알 Corning</td><td></td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>일회용 원심분리기 튜브(50mL)</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>자이로미니 장동 믹서(로커)</td><td>Labnet</td><td>S0500-230V-EU</td><td></td></tr><tr><td>열욕</td><td>실험실 라인 기기</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 냉동 용기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>분광 광도계 분석</td></tr><tr><td>Panasonic 인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170ML-PA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 포장 필름</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996/EMD</td><td>실험실 플렉시블 필름 테이프</td></tr><tr><td>보호 일회용 메스</td><td>Bard-Parker</td><td>239844</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.5 HD 분석 &ndash; RED</td><td>ACD 바이오 테크네 브랜드</td><td>322350</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope H2O2 & 프로테아제 플러스 시약</td><td>ACD a biotechne 브랜드</td><td>322330</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 표적 검색 시약 ACD</td><td>a biotechne 브랜드</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 세척 완충 시약</td><td>ACD a biotechne 브랜드</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 Dot</td><td>Scientific</td><td>6676621</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트 24웰 Fisherbrand</td><td></td><td>FB012929</td><td></td></tr></tbody></table>

생물 의학 연구에 사용하기위한 3d 송곳니 간 및 장 오가노이드 문화의 표준화 및 유지 보수

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

개는 염증성 질환, 대사성 질환 및 암을 포함하여 인간과 유사한 복잡한 다인자 질환을 발병합니다. 따라서 그들은 인간 의학에 대한 번역 잠재력을 가진 관련 대형 동물 모델을 대표합니다. 오가노이드는 3차원(3D), 그들의 기원 기관의 미세해부학 및 생리학을 모방하는 줄기세포로부터 유래된 자기조립 구조이다. 이러한 번역적 시험관내 모델은 약물 투과성 및 발견 응용, 독성학 평가, 및 다인자성 만성 질환의 병태생리학에 대한 기계론적 이해를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 송곳니 오가노이드는 반려견의 삶을 향상시켜 수의학 연구의 다양한 분야에 대한 의견을 제공하고 수의학에서 개인화 된 치료 응용 프로그램을 촉진 할 수 있습니다. 소그룹의 기증자는 오가노이드 샘플의 바이오 뱅크를 만들 수 있으며, 오가노이드 세포주가 무기한으로 계대 배양 될 수 있기 때문에 지속적인 조직 수확의 필요성을 줄일 수 있습니다. 본원에서, 성체 줄기 세포로부터 유래된 장 및 간 송곳니 오가노이드의 배양에 초점을 맞추는 세 가지 프로토콜이 제시된다. 송곳니 오가노이드 분리 프로토콜은 조직을 처리하고 세포를 지지하는 매트릭스 (가용화 된 세포외 막 매트릭스)에 격리하는 방법을 설명합니다. 송곳니 오가노이드 유지 보수 프로토콜은 확장을위한 적절한 타이밍과 함께 청소 및 통과를 포함하여 오가노이드 성장 및 유지 보수를 설명합니다. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol은 추가 분석을 위해 오가노이드를 추출, 동결 및 보존하는 방법을 설명합니다.

3D 오가노이드 배양물을 확립하기 위해 송곳니 장 및 간 조직으로부터 성체 줄기 세포를 수확하는 실험 방법이 기재되어 있다. 또한, 일관된 성장을 보장하고 수확, 바이오 뱅크 및 개 장 및 간 오가노이드 배양을 부활시키기위한 표준 운영 절차를 제공하기위한 실험실 기술이 논의됩니다.

생물 의학 연구에 사용하기위한 3D 송곳니 간 및 장 오가노이드 문화의 표준화 및 유지 보수

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

송곳니 간 및 장 오가노이드의 배양을위한 프로토콜은이 새로운 기술을 표준화하는 데 중요합니다. 이 기술은 샘플의 오가노이드 분리, 유지 보수, 수확 및 후속 바이오 뱅킹을 포함하여 송곳니 오가노이드 배양의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 확립을 허용합니다. 송곳니 오가노이드는 생물학, 전염병 개발, 약물 테스트 및 발견, 또한 전염 의학에 이르기까지 수많은 응용 분야에 대한 훌륭한 모델을 제공 할 수 있습니다.시작하려면 5 밀리리터의 1X 완전 킬레이트 용액이있는 5 개의 15 밀리리터 원심 분리 튜브, 1X 완전 킬레이트 용액 3 밀리리터가있는 튜브 1 개, 빈 튜브 1 개, 1X 완전 킬레이트 용액 5 밀리리터가있는 튜브 1 개, 태아 소 혈청 2 밀리리터를 준비하십시오. 격리 당일에는 멸균 페트리 접시, 메스, 얼음 양동이 및 차가운 고급 DMEM 영양 혼합물 F12를 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오. 필요한 수의 24-웰 세포 배양 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 예열한다.해동을 위해 가용화된 세포외 막 매트릭스를 얼음 위에 놓는다. 원심 분리기를 섭씨 네 도까지 미리 식히십시오. 성장 인자가있는 전체 매체를 냉동실에서 섭씨 37도 수조로 옮겨 직접 빛에 노출되지 않도록하십시오.조직 샘플을 수송 튜브에서 30초 동안 흔든다. 0.5 밀리리터가 튜브에 남을 때까지 유체 표면 근처에서 천천히 피펫팅하여 조직을 버리지 않고 과도한 상층액을 제거하십시오. 조직과 남아있는 상등액을 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.일회용 메스를 사용하여 조직을 자르고 약 다섯 분 동안 매쉬 일관성을 닮은 작은 조각으로 다듬습니다. 다진 조직을 페트리 접시에서 액체로 피펫팅하여 첫 번째 완전한 킬레이트 용액 튜브로 피펫 한 다음 2 밀리리터의 고급 DMEM 영양 혼합물 F12를 페트리 접시에 첨가하십시오. 나머지 조직을 플러시하고 첫 번째 완전한 킬레이트 용액 튜브로 옮깁니다.1X 완전 킬레이트 용액 튜브를 다섯 초 동안 약 다섯 번 볼텍스합니다. 생검이 튜브 바닥에 한 분 동안 침전되도록 허용하고 다섯 밀리리터가 남을 때까지 상층액을 제거하십시오. 1X 완전 킬레이트 용액을 새 튜브에서 샘플 튜브로 옮깁니다.다음 두 튜브에 대해 이전 단계를 반복합니다. 그리고 마지막 두 번의 세척에서 튜브에 남아있는 세 밀리리터까지 상층액을 제거하십시오. 생검 및 1X 완전 킬레이트 용액을 샘플 튜브로부터 여섯 웰 플레이트의 한 웰로 옮긴다.세 밀리리터의 1X 완전 킬레이트 용액을 샘플 튜브에 첨가하십시오. 부드럽게 소용돌이 치며 남아있는 조직을 수집하고 플레이트의 동일한 웰로 옮깁니다. 우물에 0.5 몰 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 150 마이크로 리터를 넣고 섭씨 4도에서 20도 24RPM 로커에 여섯 웰 플레이트를 놓습니다.간 샘플을 10분 동안 인큐베이션하고, 장 샘플을 움직이는 로커 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 여섯 웰 플레이트를 다시 생물안전 캐비닛으로 운반하고 다진 조직과 액체를 태아 소 혈청이 있는 1X 완전 킬레이트 용액을 함유하는 튜브로 옮깁니다. 조직이 침전되고 조직의 상부 부분의 0.2 밀리리터로 상층액을 빈 튜브로 운반하도록하십시오.샘플이 들어있는 튜브를 섭씨 네 도에서 5분 동안 700 XG에서 회전시킵니다. 줄기 세포는 이제 다진 조직과 함께 펠릿화됩니다. 펠렛을 방해하지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.펠렛을 고급 DMEM F12에 재현탁시킨다. 튜브를 다시 회전시키고 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인한다. 가용화된 세포외 막 매트릭스의 계산된 부피를 샘플 튜브에 첨가한다.배지를 제거할 때 세포 펠릿을 잃지 않도록 주의하십시오. 세포외 막 매트릭스를 첨가할 때, 피펫은 오가노이드 현탁액 내에 과도한 기포를 생성하지 않도록 천천히 한다. 가용화된 세포외 막 매트릭스를 갖는 샘플을 얼음 위에 보관하고 현탁액을 웰의 중간에 시드하여 가용화된 세포외 막 매트릭스가 돔형 구조를 형성하도록 한다.플레이트를 인큐베이터로 운반하고 가용화된 세포외 막 매트릭스가 30분 동안 응고되도록 한다. ROCK 억제제와 GSK3 베타를 성장 인자와 함께 완전한 배지에 혼합하고 모든 웰에이 용액 500 마이크로 리터를 첨가하십시오. 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다.송곳니 오가노이드 프로토콜은 전형적으로 웰 당 대략 50, 000 내지 150, 000개의 장 또는 간 세포를 생성한다. 줄기 세포 분리 후, 간 송곳니 오가노이드는 구상체를 확장시키는 것으로 수명주기를 시작하고, 칠일 후, 그들은 싹을 틔우고 분화시키는 오가노이드로 변합니다. 구상체의 부피, 표면적, 2D 타원 영역 및 둘레를 계산하였다.2D 타원 영역 및 둘레를 사용하여 오가노이드 배양물의 건강을 평가하였다. 반정량적 방식으로 마커의 발현을 평가한 결과, 구상체가 우선적으로 1 내지 26%에 이르는 담관세포 마커 KRT7을 발현한 것으로 나타났고, 줄기세포 마커인 LGR5 발현은 0.17 내지 0.78% 사이인 반면, 간세포 마커는 포크헤드 박스 1A의 경우 0.05 내지 0.34%로 낮은 정도로 발현되었고, 시토크롬-P450의 경우 0.03 내지 0.28%로 더 낮은 정도로 발현되었다. 트립신-유사 프로테아제와 함께 12분 인큐베이션한 결과, 오가노이드 성장을 억제하지 않았다.그러나, 오가노이드의 성장은 24분 인큐베이션을 사용하여 부정적인 영향을 받았다. 불리한 환경에서 송곳니 간 오가노이드의 생존 가능성을 분석하여 간 오가노이드의 성공적인 성장과 생존에 필요한 오가노이드 배지 및 기저 매트릭스의 부피를 결정했습니다. 오가노이드의 생존율은 12.9 일에서 18 일 사이였습니다.기본적인 세포 배양 기술과 무균 접근법은 적절한 오가노이드 분리 및 유지를위한 필수 전제 조건입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트 3 차원 organoid 시스템의 생산을 설명합니다. 이러한 담 즙 organoids cholangiocyte 생물학 연구 문화에서 유지할 수 있습니다. 담 즙 organoids 조상 및 담 즙 셀의 마커를 표현 하 고 편광 된 상피 세포의 구성 됩니다.

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

여기에서, 우리는 이중 챔버, 투과성 지원 시스템에서 송곳니 장 오가노이드의 배양을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 투과성 지지체에서의 오가노이드 시딩, 단층 유지, 및 후속 약물 투과성 실험이 기재되어 있다.

이중 챔버 투과성 지원 시스템의 송곳니 장 오가노이드

여기에서는 1차 환자 검체 또는 환자 유래 세포 배양에서 교모세포종(GBM) 오가노이드를 생성하고 성숙할 때까지 유지하는 방법을 설명합니다. 이러한 GBM 오가노이드는 표현형적으로 다양한 세포 집단을 포함하고 생체 외 종양 미세 환경을 재현합니다.

3차원 오가노이드 배양을 사용한 생체 외 인간 교모세포종 세포 다양성 유지

개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

엔테로이드는 조직 생리학 및 병태생리학, 약물 개발 및 재생 의학을 연구하기 위한 새로운 모델로 부상하고 있습니다. 여기서는 관련 조직 세포 유형과의 공동 배양을 허용하는 소 일차 세포 2D 장내 유래 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 모델은 위장 연구 모델링을 위한 중개적 이점을 제공합니다.

중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성

이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

우리는 송곳니 hindlimb의 근육 강도와 반복 편심 수축으로 근육 응답을 측정하기 위해 최소한 - 침략과 고통없이 방법을 설명합니다.

VIVO 개 근육 기능 분석에

배우세요 개 간 및 장 오가노이드 분리, 배양, 바이오뱅킹을 위한 표준화된 3D 오가노이드 문화 프로토콜. 이 방법은 감염병 연구와 약물 테스트에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 모델을 제공합니다.

생물 의학 연구에 사용하기위한 3D 송곳니 간 및 장 오가노이드 문화의 표준화 및 유지 보수

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