Name: 비침습적 경비강 경로를 통한 면역적격 마우스 뇌에서 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포의 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: 학습하세요 비침습적 코 경로를 통한 iPSMG 이식법으로 면역적격 마우스 뇌에 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포를 이식하는 방법입니다. 이 기술은 뇌 손상 없이 세포 치료 연구에 활용됩니다.

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보조금 스폰서: 이 연구는 JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), 미쓰비시 과학 재단 (SK), 다케다 과학 재단 (SK) 및 야마나시 대학 (SK)의 프론티어 뇌 과학 보조금에 의해 지원되었습니다.

이 연구에 사용 된 모든 동물은 일본 생리학 학회20에서 발표 한 "생리 과학 분야의 동물 관리 및 사용에 관한 지침 원칙"과 야마나시 대학 동물 관리위원회 (야마나시, 일본).
1. 세포 배지, 이식 배지 및 마취 혼합물의 제조
<ol><li>DMEM에 10% 소 태아 혈청과 0.1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 세포 배지를 준비합니다.</li>
	<li>세포 배지에 hCSF1 (250 ng/mL) 및 hTGF-β1 (100 ng/mL)을 첨가하여 이식 배지를 준비하십시오.</li>
	<li>정상 식염수 11.8 mL에 메데토미딘 염산염 0.45 mL, 미다졸람 1.2 mL, 부토르파놀 타르트레이트 1.5 mL를 혼합하여 복강내 주사를 위한 마취 혼합물을 제조하였다.</li>
</ol>2. iPSMG의 제조
참고: 냉동 iPSMG (표 물질)는 사용 전까지 -80°C에서 유지하였다.
<ol><li>동결된 세포를 37°C 수조에서 빠르게 해동시킨다. 보이는 모든 얼음이 녹을 때까지 샘플을 소용돌이치십시오.</li>
	<li>해동된 iPSMG를 37°C로 가온된 배양 배지에 첨가한다. 해동된 세포 함유 배지 1 mL(1 × 106 세포)를 배양 배지 10 mL에 첨가한다.</li>
	<li>세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다.</li>
	<li>원심분리 후, 세포 펠릿을 방해하지 않고 모든 상층액을 제거한다. 상청액의 완전한 제거는 이식 배지 내의 사이토카인 농도의 희석을 감소시키는 것이 바람직하다.</li>
	<li>이식 배지를 추가하여 1 x 10 5 cells/μL의 세포 농도를 얻습니다.</li>
	<li>iPSMG를 얼음 위에 놓고 즉시 이식을 진행하십시오. 참고 : 이식을위한 iPSMG의 준비는 오염을 피하기 위해 깨끗한 벤치에서 수행됩니다.</li>
</ol>3. 경비강 이식용 마우스(Tsn)의 제조
<ol><li>야생형 수컷 마우스(C57BL/6J, 8주령)에게 PLX5622가 함유된 사료를 7일 동안 먹이십시오.</li>
	<li>7일이 끝나면 PLX 식단을 중단하고 연구가 끝날 때까지 정상적인 식단으로 마우스에게 먹이를줍니다. 참고: 식단을 함유한 PLX5622는 AIN-93G 1kg에 PLX5622 1.2g을 첨가하여 제조됩니다(재료 표).</li>
</ol>4. 세포의 경비강 이식
<ol><li>PLX 공급의 중단 24시간 후, 마우스를 칭량하고 마취 혼합물(0.2 mL/20 g)의 복강내 주사를 사용하여 마취한다.</li>
	<li>마우스를 페달 금단 반사 (확고한 발가락 핀치)에 대한 무반응으로 평가한 바와 같이 완전히 마취시킨 후, iPSMG의 Tsn을 1 h 전에 PBS (100 U/mL)에 히알루로니다아제 2.5 μL를 10 μL 피펫 팁을 사용하여 각 콧구멍에 2회 투여하여 비강 점막의 투과성을 증가시킨다.</li>
	<li>히알루로니다아제를 적용한 후, 마우스를 수핀 위치에 놓습니다.</li>
	<li>iPSMG의 경비강 이식 10분 전에 단계 4.2를 반복한다.</li>
	<li>2.5 μL의 세포 현탁액을 10 μL 피펫 팁을 사용하여 마우스의 하나의 콧구멍에 도포한다.</li>
	<li>세포 현탁액을 다른 콧구멍에 투여하기 전에 5분 동안 마우스를 수핀 위치에 놓는다.</li>
	<li>단계 4.5 및 4.6을 4회 반복하고, 동물 당 20 μL의 총 부피를 적용한다.</li>
	<li>마우스를 마취로부터 회복될 때까지 37°C 히트 패드 상의 수핀 위치에 놓는다.</li>
	<li>PLX 공급의 중단 후 48 h에서, 동일한 마우스에서 단계 4.1-4.7을 다시 한번 반복한다. 참고 : iPSMG는 이식 중에 얼음 위에 놓여진다는 점에 유의해야합니다.</li>
</ol>5. 사이토카인의 적용
<ol><li>마취 혼합물 (0.2 mL / 20 g)의 복강 내 주사로 마우스를 마취하십시오.</li>
	<li>2.5 μL의 이식 배지를 10 μL 피펫 팁을 사용하여 마우스의 한쪽 콧구멍에 도포한다.</li>
	<li>이식 배지를 다른 콧구멍에 투여하기 전에 마우스를 5분 동안 수핀 위치에 놓는다.</li>
	<li>단계 5.2 및 5.3을 네 번 반복하고, 동물 당 20 μL의 총 부피를 적용한다. 참고: 이식 배지 (인간 사이토카인)의 경비강 투여는 연구가 끝날 때까지 이식된 iPSMG의 생존력을 위해 매 12시간마다 필요하다는 점에 유의해야 한다.</li>
</ol>

<ol><li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+side+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li>
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<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li>
<li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li>
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<li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li>
<li>Hasselmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+chimeric+model+to+study+and+manipulate+human+microglia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a chimeric model to study and manipulate human microglia in vivo.</a> Neuron. 103 (6), 1016-1033 (2019).</li>
<li>Mancuso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+human+microglia+transplanted+in+mouse+brain+to+study+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived human microglia transplanted in mouse brain to study human disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2111-2116 (2019).</li>
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<li>Elmore, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-stimulating+factor+1+receptor+signaling+is+necessary+for+microglia+viability%2C+unmasking+a+microglia+progenitor+cell+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain.</a> Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).</li>
<li>Zasshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+principles+for+the+care+and+use+of+animals+in+the+field+of+physiological+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Physiologic+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Guiding principles for the care and use of animals in the field of physiological sciences.</a> Journal of the Physiologic Society of Japan. 64 (7-8), 143-146 (2002).</li>
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<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+unique+TGF-beta-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nature Neuroscience. 17 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Regateiro, F. S., Howie, D., Cobbold, S. P., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+in+transplantation+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta in transplantation tolerance.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 660-669 (2011).</li>
<li>Yoshimura, A., Muto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+function+in+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta function in immune suppression.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 350, 127-147 (2011).</li>
</ol>

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여기의 프로토콜은 마우스 뇌에 iPSMG의 비침습적 이식을 기술한다. 현재 프로토콜의 독창성은 약리학 적 PLX ON/OFF 방법과 비강 내 이식을 결합하여 iPSMG를 비 침습적으로 면역 적격 마우스 뇌에 이식 할 수 있다는 것입니다. 이식 된 iPSMG는 최대 60 일 동안 빈 틈새 시장을 차지하여 해마와 소뇌에서 미세 아교세포의 대부분을 형성했지만 피질에서는 형성하지 않았습니다.
iPSMG의 효율적인 Tsn에 대한 임계점은 (i) 내인성 마우스 미세아교세포의 고갈 효율 (ii) 매 12시간마다 인간 사이토카인의 투여이다. Microglia는 뇌에서 자신의 영토를 유지합니다. 마우스 미세아교세포의 효율적인 고갈은 이식된 iPSMG의 생착을 위한 틈새를 제공하기 위해 요구된다. 내인성 마우스 미세아교세포의 고갈이 불충분할 때, iPSMG에 의한 마우스 해마와 소뇌의 식민지화는 관찰되지 않는다. 미세아교세포의 생존력은 CSF1R 및 TGFBR 신호전달19,21,22에 의존한다. hCSF1은 인간 미세아교세포의 생존력을 선택적으로 증가시키는 것으로 보고되고, hTGF-β1은 매 12시간 21,23,24시간마다 투여시 염증을 약화시킬 뿐만 아니라 미세아교세포의 생존력에 요구된다. 외인성 인간 사이토카인의 부재하에, iPSMG는 마우스 뇌에서 관찰되지 않는다. 또한, 과도한 피펫팅 또는 Tsn에 앞서 다른 수단에 의해 iPSMG를 기계적으로 활성화시키지 않도록 주의해야 하는데, 이는 iPSMG 특성과 이식 효율을 돌이킬 수 없게 변화시키기 때문이다. iPSMG의 만족스러운 Tsn이 보이지 않는 경우, 이식 전 iPSMG의 생존력과 내인성 미세아교세포의 고갈을 결정해야 한다. 내인성 마우스 미세아교세포의 고갈이 90%를 넘지 않으면, PLX5622 먹이는 시간이 고갈을 증가시키도록 변형될 수 있다.
침습적이고 추가적인 장비 및 훈련이 필요한 기존의 외과적 이식 방법과 비교하여, Tsn은 비침습적이고, 간단하고, 안정적이며, 쉬운 방법으로 이식을 가능하게 한다. 또한, 이 방법은 iPSMG를 면역적격 마우스 뇌로 이식하는 것을 허용한다; 따라서, 면역적격 질환 모델 마우스는 iPSMG의 반응을 연구하는데 사용될 수 있다.
현재 방법의 가장 큰 단점은 iPSMG의 생착에서의 지역적 이질성이다. 뇌 영역 특이적 iPSMG 이식이 필요한 경우, 이식된 iPSMG가 해마와 소뇌에서만 60일 동안 생착된 채로 남아 있지만 피질에는 나타나지 않기 때문에 현재의 프로토콜은 적합하지 않다. 또한, 12 h마다 외인성 인간 사이토카인을 비강내 투여해야 하는 필요성 또한 광범위한 노동력을 필요로 하고 비용이 많이 들기 때문에 현재의 프로토콜의 한계이다.
결론적으로, 면역적격 마우스의 뇌에 iPSMG의 Tsn에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다. PLX5622에 의한 마우스 미세아교세포의 약리학적 ON/OFF와 결합될 때, 이 프로토콜은 iPSMG의 성공적인 생착을 허용한다. 이식된 세포는 외인성 사이토카인이 적용될 때 지속적인 기간 동안 해마와 소뇌에서 관찰될 수 있기 때문에, 현재의 방법은 이들 영역 모두에서 생리학적 및 병리학적 상태 둘 다에서 인간 미세아교세포의 역할을 평가하는데 유용할 수 있다.

Microglia는 중추 신경계 (CNS)의 대식세포와 같은 세포의 전문 집단이며 신경 회로 발달, 신경 전달 조절 및 뇌 항상성 1,2,3과 같은 다양한 뇌 기능을 제어하는 데 필수적인 역할을합니다. 뮤린 미세아교세포는 인간의 것과 많은 기능을 공유하지만, 종별 차이를 보여줍니다. 따라서, 다양한 자극에 대한 마우스 미세아교세포의 반응은 항상 인간 미세아교세포 4,5,6의 반응을 나타내는 것은 아니다. 많은 연구가 인간 미세아교세포를 분석했지만, 이러한 실험은 시험관내 연구로 제한됩니다. 시험관내 배양된 인간 미세아교세포는 생체내에서 그것들과 매우 상이한 형태학적 특징 및 유전자 발현을 나타낸다. 따라서, 시험관내 실험은 인간 미세아교세포의 생체내 특성을 항상 수용하는 것은 아니다. 따라서, 생체내에서 인간 미세아교세포를 연구하기 위한 실험 시스템이 필요하다.
최근에, 인간 미세아교세포의 생체내 특성을 연구하기 위해, 시험관내 생성 유도만능줄기세포(iPSCs)- 또는 배아줄기세포-유래 인간 미세아교세포가 외과적으로 마우스 뇌에 이식되어 7,8,9,10,11,12,13,14이다. 이러한 접근법을 사용하여, 인간 미세아교세포의 다양한 생체내 특징이 특성화되었다. 그러나이 방법의 광범위한 사용은 두 가지 이유로 제한됩니다. 첫 번째는 면역 결핍 마우스의 요구 사항입니다. 따라서, 다양한 신경퇴행성 질환에서 인간 미세아교세포의 역할을 연구하기 위해, 질병 돌연변이-운반 마우스는 상당한 시간과 노력이 필요한 면역-결핍 마우스로 교차되어야 한다. 또한, 다양한 신경 질환에서, T 세포와 같은 말초 면역 세포는 미세아교세포 기능15,16,17을 조절할 수 있다. 따라서, 면역결핍 마우스에서 수행된 실험은 생체내에서 인간 미세아교세포의 진실한 특성을 나타내지 않을 수 있다. 둘째, 미세아교세포 이식을 위한 침습적 수술은 추가적인 장비와 훈련이 필요하다. 또한, 침습적 이식 중 뇌 손상은 미세아교세포 표현형을 변화시킬 수 있다.
이 프로토콜에서, 면역적격 야생형 마우스로의 iPSMG의 비침습적 경비강 이식(Tsn)이18에 기술되어 있다. 내인성 마우스 미세아교세포19 및 Tsn을 고갈시키는 CSF1R 길항제 PLX5622의 약리학적 ON/OFF를 결합하여, iPSMG는 마우스 뇌에 비침습적으로 이식될 수 있다. 또한, 외인성 인간 사이토카인의 적용과 함께, 이식된 iPSMG는 어떠한 면역억제제 없이 영역-특이적 방식으로 60일 동안 생존가능한 상태로 남아있다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10566</td><td></td></tr><tr><td>AIN 93G</td><td>Oriental Yeast Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-IBA1 항체</td><td>FUJIFILM</td><td>019&ndash; 19741</td><td></td></tr><tr><td>항STEM121항체</td><td>Takara Bioscience</td><td>Y40410</td><td></td></tr><tr><td>부토르파놀 주석산염</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>8019</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>소태아혈청</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Frozen iPSMG</td><td>Shionogi & Co., Ltd</td><td></td><td>연구실 신약 개발 및 질병 연구</td></tr><tr><td>인간 식민지 자극 인자 1 (hCSF1)</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>히알루로니다아제</td><td>시그마-알드리치</td><td>H-3506</td><td></td></tr><tr><td>메데토미딘 염산염</td><td>메이지 세이카</td><td>VETLI5</td><td></td></tr><tr><td>미다졸람</td><td>아스텔라스</td><td>18005A2</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>30076028</td><td></td></tr><tr><td>PLX5622</td><td>Amadis Chemical</td><td>A930097</td><td></td></tr><tr><td>Transforming growth factor-&beta; 1 (Tgf-b1)</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>VECTA SHIELD 하드 세트 마운팅 미디엄</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400-10</td><td>안티페이드 마운팅 미디엄</td></tr></tbody></table>

비침습적 경비강 경로를 통한 면역적격 마우스 뇌에서 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포의 이식

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Microglia는 뇌의 대식세포와 같은 세포의 전문화 된 집단입니다. 그들은 생리 학적 및 병리학 적 뇌 기능 모두에서 필수적인 역할을합니다. 미세아교세포에 대한 우리의 현재 이해의 대부분은 마우스에서 수행된 실험에 기초하고 있다. 인간 미세아교세포는 마우스 미세아교세포와 상이하며, 따라서 마우스 미세아교세포의 반응 및 특성은 항상 인간 미세아교세포의 특성을 나타내는 것은 아니다. 또한, 윤리적 및 기술적 어려움으로 인해, 인간 미세아교세포에 대한 연구는 미세아교세포의 생체내 특성을 포기하지 않는 시험관내 배양 시스템으로 제한된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 콜로니자극인자 1 수용체(CSF1R) 길항제를 이용한 내인성 미세아교세포의 약리학적 고갈과 결합하여 경비강 경로를 통해 면역적격 마우스 뇌에 비침습적으로 유도된 만능줄기세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG)를 이식하는 단순화된 방법이 개발된다. 이 프로토콜은 마우스 뇌 내로 비침습적으로 세포를 이식하는 방법을 제공하며, 따라서 생리학적 및 병리학적 뇌 기능에서 인간 미세아교세포의 생체내 역할을 평가하는데 유용할 수 있다.

이 기술은 연구자가 iPSMG를 해마와 소뇌에 비 침습적으로 이식 할 수있게하지만 마우스 뇌의 피질에는 이식하지 못하게합니다. 연구를 완료한 후, 마취된 마우스를 빙냉 PBS(-)의 심내 관류를 실시하고, 이어서 PBS에서 빙냉 4% (w/v) 파라포름알데히드를 투여하였다. 뇌를 분리하고, 4% (w/v) 파라포름알데히드에서 하룻밤 사이에 후고정시키고, 30% (w/v) 수크로스를 함유하는 PBS에서 동결보호하였다. 또한, 뇌를 임베딩 화합물에서 동결시키고, 냉동 스탯 상에서 절편(20 μm 두께의 코로나 절편)하였다. 절편을 PBS(-)(각각 10분)로 세 번 세척하고, 투과시키고, 1시간 동안 10% 정상 염소 혈청 중의 0.5% (v/v) 트리톤 X-100으로 차단하였다. 이어서, 절편을 5일 동안 항-인간 특이적 세포질 마커, STEM121 (1:100) 및 항Iba1 (1:1000)과 함께 인큐베이션하였다. 다음에, 절편을 각각 10분 동안 PBS(-)로 3회 세척하고, 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다: 알렉사 플루오르 488-, 또는 546-접합된 마우스, 또는 토끼 IgGs (1:1000)를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS(-)로 세 번 세척한 후, 절편을 안티페이드 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 장착하였다. 형광 이미지를 획득하기 위해 40x 대물 렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하였다. 해마 및 피질에서 이식 후 2개월째에 iPSMG의 생존능을 도 1에 나타내었다. 이식된 세포의 수는 인간 특이적 항체와 범-미세아교세포/단핵구 마커 둘 다에 대해 양성인 세포를 계수함으로써 결정될 수 있는 반면, 내인성 마우스 미세아교세포는 앞서 기술한바와 같이 범-미세아교세포/단핵구 마커에 대해서만 양성이다. 이식된 iPSMG는 마우스 미세아교세포를 대체하고, 해마에서 파급된 형태를 보여주며, 피질(18)에서 검출되지 않는다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg"> 그림 1: Tsn(Tsn) 후 2개월째에 피질과 해마에서 iPSMG의 생존력. 왼쪽 패널은 범 미세아교세포/단핵구 마커인 Iba1(녹색)을 사용한 면역염색을 보여줍니다. 중간 패널은 인간 특이적 세포질 마커 STEM121 (적색)을 사용한 면역염색을 보여준다. 오른쪽 패널은 Iba1 및 STEM121 면역염색의 병합된 이미지를 보여준다. (A) 대조군 마우스에서, 피질과 해마 모두에서 마우스 미세아교세포(Iba1+/STEM121-)만이 검출되었다. (B) iPSMG 이식 마우스에서, 피질에서는 마우스 미세아교세포(Iba1+/STEM121-)만이 검출된 반면, 해마에서는 iPSMG(Iba1+/STEM121+)만이 검출되었다. 이미지의 화살표는 마우스 미세아교세포를 보여주는 반면, 화살촉은 iPSMG를 보여줍니다. 형광 이미지 획득을 위해 40x 대물 렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하였다. 최대 이미지 크기: 1024 x 1024 픽셀. 확대/축소 계수: 2. 배율 막대 = 50μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에 제시된 프로토콜은 면역적격 마우스에서 경비강 경로를 통해 유도된 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG)를 뇌로 이식하는 것을 허용한다. iPSMG의 유지를 위한 세포의 제조 및 경비강 이식 및 사이토카인 혼합물의 투여를 위한 방법이 제시된다.

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

이 프로토콜은 CSF1 수용체 길항제 PLX5622의 약리학적 온/오프를 경비강 이식과 결합하여 면역적격 마우스 뇌에 iPSMG의 비침습적 이식을 허용한다. 이 기술의 가장 큰 장점은 iPSMG가 면역 적격 마우스에서도 뇌 손상을 유발하지 않고 이식 될 수 있다는 것입니다. 미세아교세포 이식은 장래에 다양한 신경퇴행성 질환에서 기능성 미세아교세포와 기능성 미세아교세포를 교환하기 위한 잠재적인 치료법으로 작용할 수 있다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구원 인 Bijay Parajuli가 될 것입니다. 먼저 동결유도만능줄기세포 유래 인간 미세아교세포를 섭씨 37도 수조에서 빠르게 해동시킨다. 보이는 모든 얼음이 녹을 때까지 샘플을 소용돌이치십시오.해동된 iPSMG를 배양 배지에 첨가하고, 섭씨 37도까지 가온한다. 10 밀리리터의 배양 배지에 1 밀리리터의 세포를 첨가하십시오. 세포를 5분 동안 300회 g에서 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다.세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거한다. 이식 배지를 첨가하여 마이크로리터 당 다섯 번째 세포 농도 10 내지 10을 얻었다. iPSMG를 얼음 위에 놓고 즉시 이식을 진행하십시오.경비강 이식을 위한 마우스를 준비하려면, 수컷 마우스에게 칠일 동안 PLX를 함유한 식단을 먹이십시오. 일곱째 날이 끝나면 PLX 식단을 중단하고 쥐에게 정상적인 식단을 먹이십시오. iPSMG의 경비강 이식 1시간 전에, PBS에 2.5 마이크로리터의 히알루로니다아제를 10-마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 콧구멍에 두 번 투여하여 비강 점막에 대한 투과성을 증가시킨다.마우스를 히알루로니다아제 적용 후 수핀 위치에 놓는다. iPSMG의 경비강 이식 10분 전에 히알루로니다아제 2.5 마이크로리터를 투여한다. 10 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 마우스의 한 콧구멍에 2.5 마이크로리터의 세포 현탁액을 바릅니다.세포 현탁액을 다른 콧구멍에 투여하기 전에 마우스를 다섯 분 동안 수핀 위치에 놓는다. 세포 현탁액을 네 번 투여하고 동물 당 20 마이크로 리터의 총 부피를 적용하십시오. PLX 공급의 중단 48시간 후, 동일한 마우스에 히알루로니다제 및 세포 현탁액의 투여를 반복한다.사이토카인을 투여하려면 10마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 2.5 마이크로리터의 이식 배지를 마우스의 한 콧구멍에 도포한다. 두 달간의 경비강 이식 후, 이식된 세포의 수는 인간 특이적 및 범-미세아교세포 마커 둘 다에 대해 양성인 세포를 계수함으로써 결정될 수 있다. 내인성 마우스 미세아교세포는 범-미세아교세포 마커에 대해서만 양성이다.대조군 마우스에서, 단지 마우스 미세아교세포만이 피질과 해마 둘 다에서 검출되었다. iPSMG 이식 마우스의 피질에서는 마우스 미세아교세포만 검출된 반면, 해마에서는 iPSMG가 검출되었다. 이 프로토콜을 시도 할 때, 상청액의 완전한 제거는 사이토 카인의 희석을 방지하기 위해 필수적입니다.이식 된 세포의 생존력을 위해 12 시간마다 사이토 카인을 적용하는 것이 중요합니다. 내인성 마우스 미세아교세포의 고갈은 iPSMG의 이식에 필요하다. 이 절차는 정상 또는 병든 마우스 뇌에 iPSMG의 이식을 허용합니다.따라서, iPSMG의 특성뿐만 아니라 질병에 대한 반응이 결정될 수 있다. 이 기술은 마우스 뇌에서 iPSMG의 생체내 특성을 결정하는데 적합하다. 따라서, iPSMG를 질병 모델 마우스에 이식하는 것은 우리가 반응을 이해하는 데 도움이 될 것이며 새로운 치료 표적을위한 길을 닦을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

설립 demyelination과 생쥐의 척수 코드에 마우스를 신경 줄기 세포 (NSCs)의 이식이 자세히 있습니다. NSCs의 준비는 흉부 척추 9 조 (T9) 및 NSCs의 이식의 laminectomy은 생쥐의 사전 및 사후 수술 치료와 함께 설명되어 있습니다.

Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

출처: Weber, R. Z., et al. 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 뇌내 이식 및 생체 내 생물 발광 추적. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 유전자 변형 인간 신경 전구 세포(NPC)를 마우스 뇌로 정위 이식하는 방법을 보여줍니다. 연구자들은 루시페라아제와 형광 단백질을 발현하는 NPC를 주입하여 생체 내 생물발광 이미징과 사후 형광 현미경을 통해 신경학 연구에서 세포 생존, 이동 및 통합을 연구할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 이식

출처: Furmanski, O., et al. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료적 이식을 통한 마우스 뇌 손상의 제어된 피질 충격 모델. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오에서는 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포를 심부 피질의 회백질-백질 경계에 입위적으로 주입합니다. 이식된 세포는 조직에 통합되어 손상된 뇌의 기능 회복과 회로 복구를 촉진합니다.

외상성 뇌손상이 있는 마우스에 신경 세포 현탁액의 정위 이식

이 비디오는 종양 용해성 바이러스가 로드된 치료용 신경 줄기 세포를 뇌종양 보유 마우스 모델에 비강 내 전달을 보여줍니다. 줄기세포의 비침습적 비강 내 투여는 혈액 뇌 장벽을 우회하여 치료 적용을 위해 뇌의 종양 부위로 전달을 용이하게 합니다.

쥐 모델에서 치료용 신경 줄기세포(NSC)의 비강 내 전달: 종양 용해성 바이러스가 로드된 NSC를 뇌종양 베어링 마우스 모델에 종양 표적 전달하기 위한 절차

출처: Parajuli, B., et.al. 비침습적 경비강 경로를 통한 면역 적격 마우스 뇌에 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 미세아교세포의 이식. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 유도 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG) 세포를 마우스 뇌로 경비강 이식하는 방법을 보여줍니다. 히알루로니다아제는 미세아교세포가 고갈된 마우스의 콧구멍에 적용되어 투과성을 향상시킵니다. iPSMG 현탁액을 비강 내로 투여하고 마우스를 회복시킵니다. 성장 인자가 풍부한 배지는 뇌 조직에서 iPSMG 생존을 지원하기 위해 정기적으로 투여됩니다.

유도만능줄기세포 유래 인간 미세아교세포를 마우스 뇌로 경비강 이식

줄기 세포는 내재 된 종양 향성으로 인해 뇌종양 치료제로서 유망한 치료제입니다. 비 침습적 비강 내 줄기 세포 전달은 혈액 뇌 장벽을 우회하여 임상 번역의 가능성을 보여줍니다. 이 기사는 신경 교종 마우스 모델에서 비강 줄기 세포 전달의 기본 원리를 요약합니다.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

우리는 마우스 뇌에서 루시페라아제-녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 이중 리포터 벡터로 형질도입된 인간 신경 전구 세포의 사다리꼴 이식을 기술한다. 이식 후, 루시퍼라아제 신호는 형광 현미경을 사용하여 뇌 절편에서 확인된 생체 내 생체 발광 및 GFP 발현 이식된 세포를 사용하여 반복적으로 측정된다.

Intracerebral 이식 및 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 생체 내 생체 발광 추적

신경 프로그래밍에 의해 생성 된 인간 다 능성 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런의 이식은 신경 발달 장애에 대한 잠재적 인 치료 접근법이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런 전구체의 생성 및 신생아 마우스의 뇌에 이식하여 이식 된 뉴런의 장기 조사 및 치료 잠재력 평가를 가능하게합니다.

신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마에 이식

이 연구는 뇌 염증의 간접 평가를 가능하게 하는 인간 단핵구 유래 미세아교세포(iMG) 세포의 확립을 위한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이는 뇌의 잠재적 염증 및 관련 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 연구에 도움이 될 수 있는 세포 모델을 제시합니다.

역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링

학습하세요 비침습적 코 경로를 통한 iPSMG 이식법으로 면역적격 마우스 뇌에 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포를 이식하는 방법입니다. 이 기술은 뇌 손상 없이 세포 치료 연구에 활용됩니다.

비침습적 경비강 경로를 통한 면역적격 마우스 뇌에서 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포의 이식

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