Name: 마우스 모델을 사용한 가족성 비후성 심근병증에서 MYH7 돌연변이 Gly823Glu의 발병기전 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 45 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9으로 제작된 MYH7 G823E 돌연변이 마우스 모델을 이용한 가족성 비후성 심근병증 연구 방법입니다. 초음파 영상 기술로 심장 기능을 평가하여 유전적 심장 질환의 발병 기전을 규명할 수 있습니다.

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이 작업은 광동성 의료 연구 기금 프로젝트(A2022363)와 중국 광둥 과학 기술 위원회의 주요 프로젝트(보조금 번호 2022)의 지원을 받았습니다.
이 원고를 준비하는 동안 도움을 주신 메릴랜드 대학교 칼리지 파크의 Qingjian Chen에게 감사드립니다.

가족의 역사는 가족 구성원을 인터뷰하여 얻었습니다. 이 연구는 광동성 중의학 병원 윤리위원회 (No. 2019074 167)의 승인을 받았습니다. 모든 가족 구성원으로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 모든 동물은 광동성 중의학 병원(광저우, 중국)의 윤리 지침에 따라 치료됩니다.
1. 연구 과목
참고: 프로밴드 III-3은 2019년 7월 광동성 중의학병원 심혈관 외과에 의학적 조언을 구했습니다.
<ol><li>프로 밴드의 상세한 가족 병력을 얻으십시오. 프로 밴드의 모든 가족에게 알리고 전화하십시오. 모든 가족 구성원은 세심한 신체 검사를 받았습니다.<ol><li>의료 기록, ECG, 심 초음파 및 심장 카테터 삽입 보고서를 포함한 모든 임상 데이터를 체계적으로 검토합니다.</li>
		<li>중재 또는 수술 중 모든 환자의 심장 표현형을 재확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>로컬 데이터베이스에서 총 174개의 채우기 기반 정상 대조군을 선택합니다. 각 환자로부터 약 4.0mL의 말초 정맥혈을 수집합니다.</li>
</ol>2. DNA 추출
알림: DNA는 제조업체의 지침에 따라 상업용 혈액 키트로 추출됩니다.
<ol><li>제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 안정제의 존재하에 음이온 성 세제로 혈액 세포를 용해시킵니다.</li>
	<li>10 μL의 RNase A 용액을 세포 용해물에 첨가하고 튜브를 25 번 뒤집어 혼합한다. 37°C에서 15분에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>소금 침전으로 단백질을 제거하십시오. 단백질 침전 용액 (증류수 25mL에 용해 된 소 혈청 알부민 0.25mg)과 100 % 이소프로판올을 사용하여 단백질을 침전시킵니다. 그런 다음 200μL의 70% 에탄올을 사용하고 4°C에서 15분 동안 12,000 x g/min으로 원심분리를 수행하여 DNA 펠릿을 세척합니다.</li>
	<li>500 μL의 70% 에탄올로 침전시켜 게놈 DNA를 회수한다. 12,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 펠릿을 흡인한 다음 수화용액(1mM EDTA, 10mM Tris· Cl, pH 7.5).</li>
	<li>분광 광도계 (예 : NanoDrop 2000)를 사용하여 순도를 결정하십시오. 정제된 DNA는 일반적으로 A260/A280 비율이 1.7과 1.9 사이이며 크기는 최대 200kb입니다.</li>
	<li>DNA를 2-8, -20 또는 -80 °C에서 장기간 보관하십시오.</li>
</ol>3. 전체 엑솜 시퀀싱 및 변이체 분석
참고: 질병을 유발하는 유전자 돌연변이를 체계적으로 검색하기 위해 영향을 받은 개체(II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 및 IV-3)와 영향을 받지 않은 개체(III-2, III-5, IV-4)에서 엑솜 시퀀싱을 수행했습니다.
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 엑솜 프로브를 사용하여 엑솜 캡처를 수행하십시오.</li>
	<li>HiSeq X-ten 플랫폼에서 2 × 150bp 쌍단 시퀀싱에 적격 라이브러리를 적용합니다. 보충 파일 1을 참조하십시오.</li>
	<li>FASTQ 파일을 BWA v0.7.1318,19를 사용하여 인간 참조 게놈(hg19/GRCh37)에 맞춥니다. samtools를 사용하여 정렬된 파일(sam/bam 형식 파일)을 정렬한 다음 Picard를 사용하여 중복에 플래그를 지정합니다. 보충 파일 1을 참조하십시오.</li>
	<li>GATK를 사용하고, 판독값을 로컬로 재정렬하고, 기본 품질을 재보정합니다. 보충 파일 1을 참조하십시오.</li>
	<li>BEDTools 및 사내 perl/python 스크립트에 의해 재보정된 파일의 적용 범위와 깊이를 포함하는 매핑 통계를 생성합니다.</li>
	<li>GATK의 HaplotypeCaller 도구의 다중 샘플 처리 모드를 사용하여 재보정된 BAM 파일의 유전자형 변이체(SNV 및 indel).</li>
	<li>VQSR(대안 품질 점수 재보정)을 사용하여 대안 호출의 가양성을 줄입니다.</li>
	<li>ANNOVAR 소프트웨어21을 사용하여 엑솜 집계 컨소시엄(ExAC)(http://exac.broadinstitute.org), 엑솜 시퀀싱 프로젝트(ESP)(https://esp.gs.washington.edu) 및 1,000G(http://www.1000genomes.org)를 포함한 여러 데이터베이스에 대해 SNV 및 인델에 주석을 달 수 있습니다. ACMG 가이드라인에 따라 서열 변이체의 병원성을 해석한다.</li>
</ol>4. 생어 시퀀싱
<ol><li>Sanger 시퀀싱을 수행하여 잠재적인 원인 변이를 확인하고 ABI 3500 시퀀서23을 사용하여 제품군에서 변이 분리를 결정합니다.</li>
	<li>MYH7 유전자 (NM_000257)의 변이체에 대한 프라이머 서열을 다음과 같이 설계하였다: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' 및 5'-CGGACTTCTCTAGCGCCTT-3'.</li>
	<li>변종을 확인하고, 가능한 모든 가족 구성원을 스크리닝하여 가족 내에서 변종 분리를 결정한다(23).</li>
</ol>5. C57BL/6N-MYH7em1(G823E) 노킨 마우스 생성
<ol><li>CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스를 생성합니다. 마우스의 Myh7 유전자(GenBank 수탁번호: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093)은 마우스 14번 염색체에 위치하며 41개의 엑손이 있습니다. ATG는 엑손 4에서 코돈을 시작하고 TAG는 엑손 41에서 코돈을 멈추고 G823E는 엑손 23에 있습니다. 엑손 23을 대상 부위로 선택합니다.</li>
	<li>gRNA 표적화 벡터 및 공여자 올리고의 서열을 설계한다(표적화 서열 포함, 양쪽에 결합된 134 bp 상동 서열 측면).<ol><li>NCBI 웹 사이트에 로그인하고 오른쪽의 BLAST 온라인 프라이머 디자인 기능을 클릭하십시오.</li>
		<li>페이지 하단의 프라이머 -BLAST 기능을 클릭하여 프라이머 를 디자인합니다.</li>
		<li>MYH7 NCBI 참조 시퀀스 번호 NM_000257.4를 PCR 템플릿 상자에 붙여넣습니다.</li>
		<li>표적 단편(MYH7 cDNA 엑손 23 및 그 인접 엑손)을 증폭하여 엑손 21(2392-2528)에 상류 프라이머와 엑손 25(3205-3350)에 하류 프라이머를 설계한다. 상류 및 하류 프라이머의 엑손 번호를 오른쪽 범위 상자에 입력합니다.</li>
		<li>하단의 Get Primers 버튼을 클릭하여 여러 쌍의 프라이머를 자동으로 생성합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>MYH7 유전자를 ZFIN 데이터베이스에 입력하고, 공여자 올리고뉴클레오티드에 p.g823e (GGG 대 GAG) 돌연변이 부위를 도입하고, 엑손 23에 침묵 돌연변이 p.r819 (AGG에서 CGA로)를 도입한다. 침묵하는 돌연변이는 상동성-지시된 복구 후에 gRNA에 의한 서열의 결합 및 재절단을 방지한다.<ol><li>일반적인 서열에 따라 gRNA를 설계하면, 양 말단의 서열은 TAATACGACTCACTATA- 및 -GTTTTAGAGCTA이다. 시퀀스의 중간은 위에서 언급 한 표적 부위입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시험 관 내 전사에 의해 생성된 Cas9 mRNA, gRNA 및 공여자 올리고를 KI 마우스 생산을 위해 수정란에 공동 주입합니다.<ol><li>Cas9/gRNA 표적 효율 검출 키트를 사용하여 설계된 gRNA 표적을 시험관 내 gRNA로 전사하고 제조업체의 프로토콜에 따라 전사체의 활성을 검출합니다(특정 검출 방법은 VK007 키트 지침 참조).</li>
		<li>T7 ARCA mRNA 키트 구성 요소를 해동하고 혼합하고 미세 분리기에서 펄스 스핀하여 튜브 바닥으로 용액을 수집합니다. 2x ARCA/NTP 믹스를 10μL로, 1μg의 템플릿 DNA, 2μL의 T7 RNA 중합효소 믹스, 20μL의 뉴클레아제가 없는 물의 순서로 실온에서 반응을 조립합니다.</li>
		<li>철저히 혼합하고 미세 분리기에서 펄스 스핀하십시오. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>2 μL의 DNase I을 첨가하여 주형 DNA를 제거하고, 잘 혼합하고, 37°C에서 15분 동안 배양하여 mRNA를 수득하였다.</li>
		<li>0.5mL 주사기로 약 4주령에 미리 준비된 C57BL/6 암컷 마우스에 혈청 성선 자극 호르몬과 인간 융모막 성선 자극 호르몬을 복강 내 주사하여 마우스당 약 5U의 용량으로 48시간의 두 주사 간격을 두고 수행합니다.</li>
		<li>투여 18시간 후, 호르몬 주사 후 경추 탈구에 의해 C57BL/6 암컷 마우스와 8-12주령의 C57BL/6 수컷 마우스 1마리를 희생시켰다. 난자와 정자를 따로 모으십시오.</li>
		<li>정자는 용량 유체에서 용량화됩니다. 체액 가장자리에 있는 정자를 3-4시간 동안 체외 수정을 위해 수명이 짧은 난자 세포에 떨어뜨립니다.</li>
		<li>성공적으로 전사된 gRNA 및 Cas9 mRNA를 RNase가 없는 물로 시험 관 내에서 25ng/μL 및 50ng/μL로 희석합니다. 미세 주입으로 마우스 수정란의 세포질에 도입하십시오. 양호한 상태의 수정란을 암컷 마우스의 확대 된 난관에 이식하십시오. 결찰 된 수컷 마우스와 공동 케이지.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR에 의한 새끼의 유전자형. 다음 PCR 조건을 사용하십시오 : 3 분 동안 94 ° C, 30 초 동안 94 ° C의 35 사이클, 35 초 동안 60 ° C, 및 35 초 동안 72 ° C; 72 °C에서 5분간 서열 분석을 따르십시오.<ol><li>4 개월 된 쥐의 꼬리를 가위로 자르고 1.5mL EP 튜브에 넣습니다. 미세 원심분리 튜브에 테일 피스(2-5mm)당 180μL의 완충액 GL, 20μL의 프로테이나제 K 및 10μL의 RNase A를 추가합니다. 꼬리를 너무 많이 자르지 않도록주의하십시오.</li>
		<li>튜브를 56°C에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>미세 원심분리 튜브에서 1,000 x g 로 2분 동안 회전시켜 불순물을 제거합니다.</li>
		<li>200μL의 버퍼 GB와 200μL의 무수 에틸 알코올을 충분히 혼합하여 추가합니다.</li>
		<li>스핀 컬럼을 수집 튜브에 넣습니다. 샘플을 스핀에 적용하고 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.</li>
		<li>500μL의 버퍼 WA를 스핀 컬럼에 넣고 1,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.</li>
		<li>700μL의 버퍼 WB를 스핀 컬럼에 넣고 1,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다. 알림: 버퍼 WB가 100 % 에탄올과 미리 혼합되어 있는지 확인하십시오. 버퍼 WB를 추가할 때 튜브 벽에 추가하여 잔류 염분을 씻어냅니다.</li>
		<li>5.5.7단계를 반복합니다.</li>
		<li>스핀 컬럼을 수집 튜브에 넣고 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>스핀 컬럼을 새 1.5mL 튜브에 넣습니다. 50-200 μL의 멸균수 또는 용출 완충액을 컬럼 멤브레인의 중앙에 추가하고 컬럼을 5분 동안 그대로 둡니다. 알림: 멸균된 물 또는 용리 완충액을 최대 65°C까지 가열하면 용리 수율을 높일 수 있습니다.</li>
		<li>DNA를 용리하려면 컬럼을 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. DNA 수율을 높이려면 플로우 스루 및/또는 50-200μL의 멸균수 또는 용리 완충액을 스핀 컬럼 멤브레인의 중앙에 추가하고 컬럼을 5분 동안 그대로 두십시오. 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>용출된 게놈 DNA를 전기영동으로 정량화합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 심장 형태 및 기능 평가
참고: M-모드 심초음파를 적용하여 C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스의 심장 형태와 기능을 평가합니다.
<ol><li>knockin 마우스를 마취기에 연결된 닫힌 아크릴 상자에 넣고 이소 플루 란 (농도 : 3 %)이 아크릴 상자로 흘러 들어갈 수 있도록 3 방향 인터페이스를 조정합니다. 노킨 마우스가 자율적으로 움직이지 않으면 노킨 마우스를 제거하십시오.</li>
	<li>노킨 마우스를 소형 동물 마취기의 수명 모니터링 플랫폼에 평평하게 놓고 산소(유량: 0.8L/min) 및 이소플루란(농도: 3%)을 혼합한 연속 흡입 마취를 합니다. 각막의 건조를 방지하기 위해 마취 된 마우스에 눈 윤활제를 바르십시오.</li>
	<li>노킹 마우스를 플랫폼에 수평으로 고정하십시오. 플랫폼을 노킨 마우스에 대해 꼬리를 30° 기울입니다. 탈모 크림을 사용하여 노킹 마우스의 앞쪽 흉벽에있는 머리카락을 제거하십시오.</li>
	<li>범프가 동물의 머리를 향하도록 프로브를 수직으로 배치하십시오. 그런 다음 프로브를 시계 반대 방향으로 약 45° 돌립니다.</li>
	<li>흉골 장축 보기에서 프로브를 시계 방향으로 90° 회전하여 흉골 단축 보기를 관찰합니다. 프로브를 90° 회전한 후 y축 변위를 조정하여 올바른 슬라이스를 얻습니다.</li>
	<li>심장의 장축 이미지(그림 1C)를 관찰한 다음 M 모드 측정 데이터를 선택합니다.</li>
	<li>마우스의 흉골 장축 뷰에서 초음파 데이터를 수집합니다 (그림 1). 심박수 (HR), 좌심실 박출률 (LVEF), 심 박출량 (CO), 좌심실 말기 이완기 차원 (LVDd), LVD 좌심실 수축기 말기 차원 (LVSd), 심실 중격 (IVS) 및 좌심실 후벽 (LVPW)을 측정합니다.</li>
	<li>측정 후 마우스에 산소를 공급하고 자율 활동을 회복하면 각각의 케이지에 다시 넣습니다.</li>
</ol>

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저자는 선언 할 재정적 이해 상충이 없습니다.

이 연구에서는 HCM을 가진 한 중국 한족 가족을 설명합니다. 유전학 분석에 따르면 이형 접합체 MYH6 돌연변이 p.G823E는 상 염색체 우성 유전을 가진 가족 구성원에서이 질병과 공동 분리됩니다. G823E 돌연변이의 병원성을 검증하고 기본 메커니즘을 논의하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 엔지니어링에 의해 마우스 Myh7 유전자좌에서 G823E를 사용하여 C57BL/6N 마우스 모델을 만들었습니다.
C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스의 표현형 특성을 심초음파로 평가하였다. 다중 섬유주 및 압축되지 않은 심근 층에 대한 더 높은 비율이 대조군과 비교하여 C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) 노킨 마우스에서 발견되었습니다. 트랜스제닉 마우스는 또한 LVPW 및 IVS 비대 및 HR의 증가를 보였다. 그러나 심장의 기능은 두 그룹간에 큰 변화를 보이지 않았습니다. 이러한 결과는 증가 된 HR이 심장 리...

비대성 심근 병증 (HCM, OMIM : 613690)은 중국에서 가장 흔한 심근 병증으로 추정 발병률은 0.2 %로 150,000 명에게 영향을 미칩니다 1,2.
HCM을 특징 짓는 병리학 적 해부학 적 특징은 비대칭 심실 비대이며, 이는 종종 심실 유출로 및 / 또는 심실 중격3을 포함합니다. 임상 증상은 운동 호흡 곤란, 피로 및 흉통입니다. HCM의 개별 표현형은 임상 적으로 교활한 심부전에서 심각한 심부전에 이르기까지 다양합니다. HCM 환자는 치료, 심장 이식, 생명 유지 장비 및 다 분야 추적 관찰이 필요합니다4.
지난 세기 동안 PCR 기술은 우리가 DNA5를 연구하는 방식을 변화 시켰습니다. 임상 진단을위한 DNA 시퀀싱 방법은 Sanger와 동료6에 의해 발견되었습니다. Sanger 기술은 이후 인간 게놈 프로젝트에 적용되었지만 이 접근 방식은 비용과시간이 많이 소요되었습니다7. 전체 게놈 시퀀싱(WGS)의 출현으로 인간 유전 질환에 대한 통찰력이 새로운 차원으로 올라갔지만 비용 측면에서는 여전히 엄두가 나지 않았습니다. 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 기술은 생식계열 변이체8를 검출하기 위해 오랫동안 사용되어 왔으며 다양한 암9의 엑솜에서 체세포 동인 돌연변이를 확인하는 데 성공적이었습니다. WES에 의한 DNA 엑손 또는 코딩 영역의 검출은 대부분의 멘델 질환에서 병원성 변이를 밝히는 데 사용될 수 있습니다. 오늘날 시퀀싱 비용이 감소함에 따라 WGS는 유전체학 연구에서 중요한 도구가 될 것으로 예상되며 게놈의 병원성 변이 검출에 널리 사용될 수 있습니다.
WES 기술은 또한 유전성 심근 병증에서 병인을 더 밝히기 위해 병원성 변이를 식별하는 데 사용되었습니다. 새로운 증거는 MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 및 TPM1 18과 같은 육종 구조 단백질 유전자 돌연변이를 코딩하는 유전자가 HCM의 유전 적 병인을 담당한다는 것을 암시합니다. 희귀 질환 유발 유전자(예: 옵스큐린, 세포골격 칼모듈린 및 티틴 상호작용 RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, 작용 알파 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, 시스테인 및 글리신이 풍부한 단백질 3(CSRP3, OMIM: 600824)21)의 병원성 변이에 대한 인식도 HCM과 관련이 있습니다. 현재의 유전 연구는 HCM 환자의 약 40 % -60 %에서 육종 단백질 유전자에서 여러 가지 별개의 병원성 변이를 확인했으며, HCM 환자의 유전자 검사에서 대부분의 병원성 변이체가 미오신 중쇄 (MYH7) 및 미오신 결합 단백질 C (MYBPC3). 그러나 HCM의 유전 적 기초는 여전히 파악하기 어렵습니다. 인간 HCM 환자의 기초가되는 이러한 변이의 병원성을 탐구하는 것은 주요 과제로 남아 있습니다22.
이 연구에서는 WES의 HCM을 가진 중국 한족의 MYH7의 병원성 변이를 보고합니다. 이 변종의 병원성을 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스를 구축했습니다. 우리는 또한이 변종의 그럴듯한 메커니즘에 대해서도 논의합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5&배; TBE</td><td>상하이 상곤</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&times; Taq 마스터 믹스 (염료 플러스)</td><td>Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr> 아<tr><td>가로스</td><td>레구</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소동물용 마취기</td><td>Reward Life Technology Co., Ltd.</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>BED툴</td><td></td><td>2.16.1</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA efficiency kit</td><td>Viewsolid Biotechnology Co., Ltd.</td><td>VK007</td><td></td></tr><tr><td>DNA 마커</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 안정제</td><td>Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.</td><td>DNAstable LD</td>는 <td>DNA 분해를 방지합니다</td></tr><tr><td>전기 파라핀 마이크로톰</td><td>Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.</td><td>HS-S7220-B</td><td></td></tr><tr><td>GATK</td><td></td><td>v3.5</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene 혈액 키트</td><td>산타 클라라</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드, 커버 슬립</td><td>Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 염색 용액, Eosin 염색 용액</td><td>Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.</td><td>C0107-500ml, C0109</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq X-ten 플랫폼</td><td>Illumina</td><td></td><td>는 캡처된 라이브러리에서 염기서열분석을 수행합니다</td></tr><tr><td>. 융모성 성선 자극 호르몬 주입</td><td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>임산부 암말 혈청 성선 자극 호르몬</td><td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.</td> 주사<td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>현지 공급 업체</td><td></td><td>흡입 마취</td></tr><tr><td>미세 주입 현미경</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 임베딩 기계</td><td>Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.</td><td>HS-B7126-B</td><td></td></tr><tr><td>Picard</td><td></td><td>(2.2.4) 20</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>samtools</td><td></td><td>1.3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sequencer Applied Biosystems</td><td>ABI 3500</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect Human All Exon V6</td><td>Agilent Technology Co., Ltd.</td><td></td><td>엑솜 프로브</td></tr><tr><td>T7 ARCA mRNA 키트</td><td>New England BioLabs, Inc.</td><td>NEB-E2065S</td><td></td></tr><tr><td>온도 상자</td><td>BINDER GmbH</td><td>KBF-S Solid.Line</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride 솔루션</td><td>Sigma, Merck KGaA</td><td>No. T2663</td><td></td></tr><tr><td>수의학 초음파 시스템</td><td>Royal Philips</td><td>CX50</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 모델을 사용한 가족성 비후성 심근병증에서 myh7 돌연변이 gly823glu의 발병기전 조사

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

가족성 비대성 심근병증(HCM, OMIM: 613690)은 중국에서 가장 흔한 심근병증입니다. 그러나 HCM의 근본적인 유전 적 원인은 여전히 파악하기 어렵습니다.
우리는 이전에 HCM을 가진 큰 중국 한족에서 미오신 중쇄 7 (MYH7) 유전자 이형 접합 변이체 NM_000257.4 : c.G2468A (p.G823E)를 확인했습니다. 이 계열에서 변종 G823E는 상 염색체 우성 장애와 분리됩니다. 이 변이체는 MYH7 단백질의 목 영역의 레버 암 도메인에 위치하며 상동 미오신 및 종 사이에서 고도로 보존됩니다. G823E 변이체의 병원성을 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 공학을 통해 마우스 MYH7 유전자좌에서 점 돌연변이(G823E)가 있는 C57BL/6N 마우스 모델을 제작했습니다. gRNA 표적화 벡터와 공여자 올리고뉴클레오티드(표적화 서열이 134bp의 상동성 옆에 있음)를 설계했습니다. 공여체 올리고뉴클레오티드 내의 p.G823E (GGG 내지 GAG) 부위를 상동성-지시 복구에 의해 MYH7의 엑손 23 내로 도입하였다. 침묵된 p.R819 (AGG 대 CGA)를 또한 삽입하여 gRNA 결합 및 상동성 지향적 복구 후 서열의 재절단을 방지하였다. 심 초음파는 생후 2 개월에 MYH7 G823E /- 마우스에서 수축기가있는 좌심실 후벽 (LVPW) 비대를 나타 냈습니다. 이러한 결과는 마찬가지로 조직학적 분석에 의해 검증되었습니다(그림 3).
이러한 결과는 G823E 변이체가 HCM의 발병기전에 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다. 우리의 연구 결과는 가족 성 HCM과 관련된 MYH7 변종의 스펙트럼을 풍부하게하고이 중국 가족의 유전 상담 및 산전 진단에 대한 지침을 제공 할 수 있습니다.

가족의 임상 프로필 HCM의 가족 혈통을 얻었으며 그림 2에 나와 있습니다. 문서화 된 모든 가족 구성원은 등록시 HCM 진단을 받았습니다.
가족 (그림 2A)에서 프로 밴드는 46 세에 HCM 및 좌심실 유출로 폐쇄 (LVOTO)로 진단되어 심장 수술을받은 환자 III-7이었다. 환자 III-3은 외과 적 치료가 필요하지 않은 경미한 HCM을 가졌습니다. 환자 IV-3은 또한 그의 아버지 인 환자 III-3과 유사한 경미한 HCM을 가지고있었습니다. 환자 II-5는 HCM을 앓고 LVOTO로 인해 51 세의 나이에 결함을 복구하기 위해 수술을 받았습니다. 환자 I-1과 환자 II-2는 각각 57 세와 46 세의 심장 사고로 사망했습니다. 환자 I-1의 병력을 알 수 없었습니다. 환자 II-7 및 환자 III-9는 호흡 곤란을 나타내고 HCM으로 진단되었습니다....

임상 연구에서 발견된 가족성 유전성 심근병증 계열을 기반으로 이 돌연변이를 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 엔지니어링을 통해 마우스 MYH7 유전자좌에서 점 돌연변이(G823E)가 있는 C57BL/6N 마우스 모델을 만들었습니다.

마우스 모델을 사용한 가족성 비후성 심근병증에서 MYH7 돌연변이 Gly823Glu의 발병기전 조사

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...

이 프로토콜은 작은 동물에서 초음파의 시연을 제공 할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술은 유전성 심근 병증에서 병원성 유전자의 발견에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 노킨 마우스를 플랫폼에 수평으로 고정한 다음 플랫폼을 노킨 마우스에 30도 기울입니다.탈모 크림을 사용하여 노킨 마우스의 전방 흉벽에 있는 털을 제거하고 범프가 동물의 머리를 향하도록 프로브를 수직으로 배치합니다. 그런 다음 프로브를 흉골 주변 장축 보기에서 시계 반대 방향으로 약 45도 회전합니다. 프로브를 시계 방향으로 90도 회전하여 흉골 단축 보기를 얻습니다.프로브를 회전시킨 후 Y 축 변위를 조정하여 올바른 슬라이스를 얻습니다. 심장의 장축 이미지를 관찰한 다음 M 모드 측정 데이터를 선택합니다. 마우스의 흉골 장축 뷰에서 초음파 데이터를 수집하고 심박수, 좌심실 박출률, 심박출량, 좌심실 및 이완기 치수, 좌심실 및 수축기 치수를 측정합니다.좌심실 후벽과 심실 중격. 비대성 심근 병증의 가족 혈통을 얻었고, 문서화 된 모든 가족 구성원은 비대성 심근 병증 등록으로 진단되었습니다. Sanger 시퀀싱은 모든 환자에서 동일한 M Y H 7 P G 8 23 E 변이체를 확인했지만 가족의 건강한 개인에서는 확인하지 않았습니다.174개의 대조군에서, 이형접합체 MAYH7PG8 23E가 이 패밀리에서 완전히 공동 분리되었다. MH7의 목 도메인 영역 내의 코돈 8 23에서의 글리신 잔기는 모든 이용가능한 척추동물 미오신 서열에서 고도로 보존되었다. A C M G 표준 및 가이드라인에 따르면 상기 MY H7 P G 8 23 E 변이체는 병원성 변이체인 것으로 예측되었다.knockin 마우스는 출생 후 연령 의존성 심장 비대가 발생했습니다. 심 초음파는 심실 간 중격과 좌심실 후벽이 노킨 마우스에서 심박수가 증가함에 따라 발생했음을 밝혀 냈습니다. 또한 조직학적 분석에 의해 확인되었다.바이러스 초음파 데이터는 마우스 용어의 다른 섹션에서 다른 각도로 프로브를 회전시켜 얻을 수 있습니다.

investigating-pathogenesis-myh7-mutation-gly823glu-familial

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

마우스의 가로 대동맥 수축 (TAC)은 심장 비대 및 심장 마비 개발을 기본 메커니즘을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 실험적인 모델입니다. 여기, 우리는 절차가 생쥐에서 심장 비대의 재현성 학위를 만들 수있는 대동맥을 수축에 대해 설명합니다.

마우스의 가로 대동맥 수축

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

마우스를 모델 시스템으로 사용하여 인간 질병과 관련된 유전자군을 이해하기 위한 역유전학 접근 방식을 제시하고 후속 마우스 표현형 분석 일정을 설명합니다. 관심 유전자인 HtrA2에 결함이 있는 마우스가 파킨슨병 증상을 보였기 때문에 표현형 분석 요법은 신경학적 결함을 식별하는 데 중점을 둡니다.

노화의 인간의 질병에 관여 유전자를 연구에 사용 된 유전자 변형 마우스에 대한 표현형 요법

Echocardiographic 시험 쥐에서 자주 사용 됩니다. 비싼 고해상도 초음파 장치가이 목적을 위해 개발 되었습니다. 이 프로토콜에서는 심장 형태를 결정 하는 조직학 형태학 분석 함께 저렴 한 echocardiographic 절차를 설명 합니다.

마우스의 심장 형태학의 echocardiographic 및 조직학 검사

이 프로토콜의 목표는 단계별로 설명 하는 최소 침 습 가로 대동맥 수축 (TAC) 생쥐에서의 기술. 삽 관 법 그리고 일반적으로 사용 되는 표준 절차 필수는 환기의 제거, 최소 침 습 전술 수술 절차를 간소화 하 고 동물에 긴장을 감소 시킨다.

왼쪽된 심 실 비 대의 유도 대 한 생쥐에서 최소 침 습 가로 대동맥 수축의 기술

성인 zebrafish (Danio rerio)에서 독 소 루비 유발 심근 모델을 생성 하는 메서드는 여기에 설명 되어 있습니다. 복 주입의 2 개의 다른 방법을 제시 하 고 다른 실험적인 그룹 사이 변이 줄이기 위해 조건을 설명.

성인 제 브라에서 독 소 루비 유발 심근 모델

이 프로토콜은 저산소증에 노출및 VEGF 수용체 길항제의 주입에 근거하여 마우스에 있는 폐 고혈압 (PH)의 유도를 기술합니다. 동물은 프로토콜의 개시 후에 PH 및 오른쪽 심실 (RV) 비대 3 주를 개발합니다. 모델의 기능적 및 형태특성도 표시됩니다.

저산소증/SU5416 모델을 사용하여 마우스에서 폐 고혈압의 유도 및 특성화

이 논문은 다른 병리를 나타내는 다양한 모양의 심장 심근세포를 성장시키고 단일 세포 수준에서 자신의 형태에 따라 이러한 부착 된 심장 심근세포를 분류하는 방법을 제시합니다. 제안 된 플랫폼은 심부전의 다른 모형을 위한 높은 처리량 및 약 검열에 새로운 접근을 제공합니다.

단일 세포 수준에서 모양 의존적 전사학을 연구하는 접근법

본 프로토콜은 Gja1에서 전장 Connexin43 생성을 유지하지만 더 작은 GJA1-20k 내부 번역 이소형의 번역을 방지하는 단일 M213L 돌연변이를 기술한다.

전장 단백질의 발현을 유지하면서 mRNA로부터 내부 번역 개시 부위의 제거

이 프로토콜은 박출률(HFpEF)이 보존된 고지혈증 유발 심부전의 쥐 모델을 복제하기 위한 자세한 접근 방식을 제시합니다. 이 설계는 아데노 관련 바이러스 9-심장 트로포닌 T-저밀도 지단백질 수용체(AAV9-cTnT-LDLR)와 폴록사머-407(P-407)의 투여를 결합합니다.

박출률이 보존된 고지혈증 유발 심부전의 쥐 모델

배우세요 CRISPR/Cas9으로 제작된 MYH7 G823E 돌연변이 마우스 모델을 이용한 가족성 비후성 심근병증 연구 방법입니다. 초음파 영상 기술로 심장 기능을 평가하여 유전적 심장 질환의 발병 기전을 규명할 수 있습니다.

마우스 모델을 사용한 가족성 비후성 심근병증에서 MYH7 돌연변이 Gly823Glu의 발병기전 조사

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