Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

시편 스테이지를 기울이면 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집 중에 입자의 방향 분포를 증가시키는 간단하고 일반화 가능한 방법을 제공합니다. 시편 스테이지 틸팅으로 인해 얻은 입자의 균일한 분포는 전체 지도 품질과 해석 가능성을 향상시킬 수 있습니다. 먼저 현미경을 정렬하여 표본의 평행 조명을 보장하고 혼수 수차를 최소화합니다.

데이터 수집에 적합한 사각형을 식별하려면 스테이지 틸트 또는 스테이지 틸트가 없는 그리드 아틀라스를 기록하여 전체 그리드 품질에 대한 개요와 데이터 수집에 적합한 영역의 초기 표시를 제공합니다. 정사각형 획득 노드에 사용된 배율로 정사각형을 수동으로 검사합니다. 호일이 손상되지 않고 탈수된 것처럼 보이지 않으며 이상적인 얼음 두께를 가진 사각형을 찾고 표본 스테이지를 관심 있는 사각형으로 이동합니다.

약 15도에서 알파 워블러를 사용하여 스테이지 위치에 대한 유센트릭 높이 결정tage 기울기 및 Z 높이를 조정하여 s를 유센트릭 높이로 가져옵니다.tage 현미경용 키패드 패널을 사용하여 높이로. 알파 워블 루틴 동안 이미지 이동이 최소화되었는지 확인합니다. 더 정확한 Z 높이를 찾으려면 정사각형 획득 노드에 사용된 배율로 포커서 노드에서 추정합니다.

포커서 노드에 대한 설정을 조정하고 사각형의 초기 대기열 중에 미세 Z 초점 옵션을 활성화 또는 비활성화합니다. 그런 다음 시뮬레이션을 누릅니다. 표본 스테이지를 실제 유센트릭 높이에서 데이터 수집을 위해 원하는 기울기 각도로 기울이고 필요한 경우 스테이지를 중앙에 다시 맞춥니다.

정사각형 수집 노드에서 Simulate 를 눌러 전체 수집 노드 노출에 대한 타겟 대기열을 시작합니다. 그런 다음 Z 초점 대상과 고배율 노출에 적합한 구멍이 있는 영역을 선택하고 이미징을 위해 대상을 대기열에 제출합니다. 시편 스테이지를 기울이지 않은 상태로 되돌리고 다음 사각형으로 이동합니다.

적절한 수의 전체 노출이 대기열에 추가될 때까지 이 단계를 반복합니다. 모든 사각형이 대기열에 있으면 전체 타겟팅 노드로 이동하여 Submit Queued Targets를 누릅니다. 노드 설정에서 선택한 표적에 대한 사용자 검증 허용을 선택하고 고배율 노출 획득 노드에서 선택한 표적을 수동으로 검사하여 시편 스테이지가 기울어졌을 때 자동 EM 구멍 측정기가 이미지 획득에 적합한 영역을 정확하게 식별할 수 있는지 테스트합니다.

사용자가 타겟팅 정확도에 만족하면 자동 데이터 수집을 위해 선택한 타겟의 사용자 확인 허용 옵션을 선택 취소합니다. 유센트릭 Z 높이에서 가까운 곳과 먼 곳에서 수집된 다양한 기울기 각도를 가진 정사각형 배율의 그리드의 대표 이미지가 여기에 표시됩니다. 빔의 중심은 빨간색 동심원 링의 중심으로 표시되고 녹색 화살표는 관심 제곱을 나타냅니다.

참조를 위해 관심 사각형 옆에 깨진 그리드 기능이 있습니다. 다음은 0도, 30도 및 60도 기울기 각도에서 수집된 대표적인 구멍 노출 및 2D 클래스 평균입니다. 단백질 농도는 다른 기울기 각도에서 변하지 않지만 기울기 각도가 높을수록 입자 농도 측면에서 이미지 영역이 더 복잡해 보입니다.

과밀화의 영향을 받는 2D 클래스 평균이 이 빨간색 상자에 표시됩니다. 프로토콜의 단순성으로 인해 현미경의 모든 표준 사용자는 기울어진 데이터 수집 전략을 쉽게 조정할 수 있습니다.