Name: Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 Capture Hi-C를 활용한 고분해능 3D 염색질 조직 분석 방법입니다. 다양한 세포 유형과 질병 상태에서 게놈 토폴로지와 유전자 조절의 상호작용을 효율적으로 규명할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

허드 실험실에서의 작업은 유럽 연구위원회 (European Research Council) 고급 조사자 상 (XPRESS-AdG671027)의 지원을 받았습니다. AL은 유럽 연합 Marie Skłodowska-Curie Actions Individual Fellowship(IF-838408)의 지원을 받습니다. AH는 Marie Skłodowska-Curie Grant 계약 813327에 따라 ITN 혁신 및 학제 간 네트워크 ChromDesign의 지원을 받습니다. 저자는 유용한 기술 자문을 제공한 Daniel Ibrahim(MPI for Molecular Genetics, Berlin), Institut Curie(파리)의 NGS 플랫폼, 지원과 지원을 제공한 EMBL(Heidelberg)의 Vladimir Benes 및 Genomics Core Facility에 감사드립니다.

Kai Hauschulz는 Agilent Technologies - Diagnostic and Genomics Group의 현장 응용 과학자입니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

여기에서는 5-10kb 해상도에서 메가베이스 크기 게놈 영역의 고차 조직을 특성화하기 위한 비교적 빠르고 쉬운 Capture Hi-C 프로토콜을 설명합니다. Capture Hi-C는 게놈 전체 3C 또는 Hi-C 템플릿에서 표적 염색질 상호작용을 강화하도록 설계된 Capture-C 기술 제품군에 속합니다. 현재까지 대부분의 Capture-C 애플리케이션은 전체 게놈에 흩어져 있는 비교적 작은 조절 요소의 염색질 접촉을 매핑하는 데 활용되었습니다. 첫 번째 Capture-C 프로토콜에서, 다수의 중첩 RNA 비오티닐화 프로브를 사용하여 적혈구 세포로부터 제조된 3C 라이브러리에서 >400개의 미리 선택된 프로모터를 포획하였다31. 이후 NG(Next Generation) 및 NuTi(Nuclear Titrated) Capture-C에서도 동일한 전략이 개선되어 단일 제한 부위에 걸친 단일 120bp DNA 미끼와 2회의 순차적 포획을 사용하여 >8,000 프로모터의 고분해능 상호작용 프로파일을 달성하여 유익한 결찰 단편의 농축을 극대화했습니다32,40. 이러한 전략은 마우스 배아 발달, 세포 분화, X-염색체 불활성화 및 병리학적 상태에서의 유전자 오조절을 포함하여 다양한 맥락에서 시스 작용 요소의 기능적 해부로 이어졌습니다46,63,65,66,67,68,69,70,71.
프로모터 포획 Hi-C (PCHi-C)에서, 제한 단편을 함유하는 >22,000 주석 달린 프로모터는 제한 단편34,72의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 단일 RNA 120-mer 비오티닐화 프로브의 혼성화에 의해 Hi-C 라이브러리로부터 풀다운되었다. 이 방법은 마우스 배아 줄기 세포, 태아 간 세포 및 지방 세포 34,35,72,73뿐만 아니라 인간 림프구 계통, 조혈 전구 세포, 표피 각질 세포 및 만능 세포 37,74,75,76,77.
이러한 표적 농축 기술과 비교하여 Capture Hi-C는 최대 메가베이스 규모까지 인접한 게놈 영역을 표적으로 하여 하나 이상의 TAD에 걸쳐 유전자의 조절 환경을 포괄합니다. 전체 관심 영역은 표적 내의 각 DpnII 제한 부위를 포함하는 비오티닐화 프로브 어레이로 바둑판식으로 배열되어야 합니다. 3C 템플릿에 대한 비오티닐화 어레이의 하이브리드화, 후속 스트렙타비딘 기반 포획 및 다중화 시퀀싱을 위한 처리는 Illumina Paired-End 다중화 시퀀싱을 위한 표적 농축 시스템을 사용하여 수행됩니다. 전체 프로토콜은 3C 라이브러리 준비에서 NGS 시퀀싱에 이르기까지 1주일 만에 수행할 수 있으며 약간의 조정 및/또는 맞춤형 문제 해결만 필요하기 때문에 빠릅니다.
이 프로토콜은 또한 다른 3C 기반 방법과 비교하여 이점을 제공합니다. 5-10kb의 해상도에서 상호 작용 맵을 얻기 위해 100-120M paired-end 읽기를 시퀀싱했습니다. 비교를 위해 여기서는 20kb 해상도64 (GSM2053973)에 도달하기 위해 571M 읽기의 Hi-C 데이터 세트를 사용했으며 염색체 전체 Hi-C22로 5kb 해상도에 도달하려면 최소 10억 개의 읽기가 필요합니다.
본 연구에서 사용된 포획 Hi-C는 6-bp 절단기 제한효소47 에 기초하여 이전에 발표된 5C보다 훨씬 더 높은 분해능에 도달한다(보충표 1). 중요하게도, 5C에서 표적 상호 작용을 풍부하게하고 증폭하도록 설계된 전략은 염색질 상호 작용의 대립 유전자 특이 적 분석을 허용하지 않습니다. 반대로, Capture Hi-C 데이터는 대립유전자-특이적으로 맵핑될 수 있어서, 예를 들어 인간 세포 또는 유전적으로 상이한 마우스 균주를 교배함으로써 유도된 F1 하이브리드 세포주에서 상동성 염색체 쌍의 3D 구조적 풍경을 해부할 수 있다78. 5kb 해상도에서 대립 유전자 특이적 Capture Hi-C 상호 작용 맵을 생성하기 위해 SNP 적용 범위를 늘리기 위해 150bp paired-end read를 시퀀싱했습니다. 유사한 대립유전자-특이적 접근법이 인간 세포주에 적용될 수 있으며, 이에 대해 SNP의 주석이 이용 가능하다22.
중요한 것은 Capture Hi-C가 일반적으로 염기서열 분석 비용의 경제성을 향상시키면서 고분해능을 보장하지만, 맞춤형 비오티닐화 올리고뉴클레오티드의 생산이 이 방법의 전체 비용에 영향을 미친다는 것입니다. 따라서 가장 적합한 3C 분석법의 선택은 응용 분야마다 다르며, 다루고 있는 생물학적 문제와 필요한 분해능, 관심 영역의 크기에 따라 달라집니다. 개발된 다른 Capture Hi-C 프로토콜은 여기에 설명된 프로토콜과 주요 기능을 공유합니다. 예를 들어, 유방암 및 결장직장암 위험과 관련된 비암호화 변이체에 걸쳐 ~50kb에서 1Mb 게놈 영역을 특성화하기 위해 Capture Hi-C 전략이 적용되었습니다. 이 프로토콜에서, 표적 영역은 3배 커버리지33,38,79에서 표적 영역을 타일링하는 120-mer RNA 미끼를 혼성화함으로써 Hi-C 라이브러리로부터 풀다운되었습니다. 유사하게, HYbrid 캡처 Hi-C (Hi-C 2)는 최대2 Mb80의 관심 영역 내에서 상호 작용을 타겟팅하는 데 사용되었습니다. 두 프로토콜 모두에서 비오틴 풀다운 결찰 단편에 대해 강화된 Hi-C 템플릿을 사용하면 프로토콜에 비해 총 정보 판독 비율이 증가했습니다. 예를 들어, 비교64(GSM2053973)를 위해 여기에서 사용한 Hi-C 데이터 세트에서 중복 제거 후 유효한 쌍의 백분율은 그림 3 및 보충 표 1에 설명된 대로 Capture Hi-C에서 얻은 유효한 쌍보다 4.8배 더 높습니다. 그러나 비오티닐화 결찰 단편 및 하이브리드화된 프로브의 연속적인 풀다운은 프로토콜을 훨씬 더 복잡하고 시간 소모적으로 만드는 동시에 포획된 영역의 복잡성을 감소시킬 수 있습니다.
타일링 프로브로 3C 템플릿을 풍부하게 하는 또 다른 방법은 Tiled-C로, 마우스 적혈구 분화 동안 높은 공간 및 시간 분해능에서 염색질 구조를 연구하는 데 적용되었습니다43. Tiled-C에서, 70 bp 비오티닐화 프로브의 패널은 표적 상호작용43,81의 매우 높은 해상도 맵을 생성하기 위해 2개의 연속 포획 라운드에서 대규모 영역 내의 접촉을 풍부하게 하는 데 사용된다. 또한 이중 캡처 강화는 Capture Hi-C와 비교할 때 프로토콜을 더 길고 복잡하게 만듭니다. 그러나, 단일 제한 부위를 표적으로 하는 Capture-C 전략과는 달리, Tiled-C에서 2차 포획은 포획 효율을 유의하게 증가시키지 않는 것으로 보이므로, 아마도 생략될 수 있다(43). 마지막으로, 이 연구에서 사용된 것과 동일한 표적 농축 전략을 기반으로 하는 유사한 타일링 접근 방식이 선천성 기형 환자에서 설명되고 형질전환 마우스에서 재설계된 구조적 변이를 포함하는 규제 환경의 해부에 적용되었습니다41,42. 이 경우, 프로브의 타일링 어레이는 DpnII 제한 부위(41)의 근접보다는 전체 표적에 걸쳐 설계되었다. 그럼에도 불구하고, 이 연구는 다양한 맥락에서 큰 게놈 영역의 고해상도 특성화를 달성하기 위한 이 전략의 민감도와 힘을 강조하는 데 중요했습니다(41,42,48).
결론적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 관심 있는 모든 게놈 영역의 고해상도 3D 특성화를 위한 쉽고 강력하며 강력한 전략을 나타냅니다. 다양한 모델 시스템, 세포 유형, 발달 조절 염색질 풍경 및 건강하고 병리학적인 조건에서 유전자 조절에 이 접근 방식을 적용하면 후성 유전학 분야의 근본적인 미해결 질문 중 하나인 게놈 토폴로지와 유전자 조절 사이의 상호 작용 및 인과 관계에 대한 이해를 촉진할 수 있습니다. 또한, Capture Hi-C를 적용하여 GWAS 연구에 의해 확인된 위험 변이체의 장거리 상호 작용 및 고차 염색질 접힘을 매핑하면 다양한 맥락에서 인간 질병과 관련된 비암호화 게놈 유전자좌의 기능적 관련성을 밝힐 수 있는 잠재력이 있으며, 이를 통해 잠재적으로 발병의 기저에 있는 과정에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

선형 게놈은 유기체가 배아 발달을 겪고 성인이 될 때까지 생존하는 데 필요한 모든 정보를 보유하고 있습니다. 그러나 유전적으로 동일한 세포가 서로 다른 기능을 수행하도록 지시하는 것은 서로 다른 조직 및/또는 발달 단계를 포함하여 특정 상황에서 사용되는 정보를 정확하게 제어하는 데 기본입니다. 게놈의 3차원 조직은 선형 게놈에서 수백 킬로베이스로 분리될 수 있는 조절 요소 간의 물리적 상호작용을 촉진하거나 방지함으로써 유전자 활성의 정확한 시공간 조절에 참여하는 것으로 생각됩니다(리뷰 1,2,3;). 지난 20년 동안 게놈 접힘과 활동 사이의 상호 작용에 대한 우리의 이해는 주로 염색체 형태 캡처 기술(3C)의 개발로 인해 급격히 증가했습니다(검토 4,5,6,7). 이 방법은 게놈의 모든 영역 간의 상호 작용 빈도를 측정하고 핵 내에서 3D로 근접한 DNA 서열의 결찰에 의존합니다. 가장 일반적인 3C 프로토콜은 포름알데히드와 같은 가교제로 세포 집단을 고정하는 것으로 시작합니다. 가교 결합 된 염색질은 제한 효소로 소화되지만 MNase 소화도사용되었습니다 8,9. 소화 후, 공간적으로 가까운 유리 DNA 말단이 다시 결찰되고 가교가 역전됩니다. 이 단계는 3C '라이브러리' 또는 '템플릿'을 생성하는데, 이는 핵에 3D 근접한 서열이 동일한 DNA 단편에서 결찰될 가능성이 더 높은 하이브리드 단편의 혼합 풀입니다. 이러한 하이브리드 단편의 다운스트림 정량화를 통해 선형 게놈에서 수천 개의 염기쌍 떨어져 있지만 3D 공간에서 상호 작용할 수 있는 게놈 영역의 3D 형태를 추론할 수 있습니다.
3C 라이브러리를 특성화하기 위해 다양한 접근 방식이 개발되었으며, 결찰 단편의 하위 집합이 분석되고 다운스트림 정량화에 사용되는 기술이 서로 다릅니다. 원래의 3C 프로토콜은 두 관심 영역의 선택과 PCR10,11에 의한 '일대일' 상호 작용 빈도의 정량화에 의존했습니다. 4C 접근법(원형 염색체 형태 캡처)은 단일 관심 유전자좌(즉, '관점')와 나머지 게놈('하나 대 모두') 간의 상호 작용을 측정합니다12,13,14. 도 4C에서, 3C 라이브러리는 제2 분해 및 재결찰을 거쳐 관점 특이적 프라이머(15)에 의해 PCR 증폭되는 작은 원형 DNA 분자를 생성한다. 5C(염색체 형태 캡처 카본 카피)는 더 큰 관심 영역에서 3D 상호 작용의 특성화를 가능하게 하여 해당 영역 내에서 고차 염색질 접힘에 대한 통찰력을 제공합니다('다수 대 다수')16. 도 5C에서, 3C 라이브러리는 유니버셜 프라이머(15)를 갖는 멀티플렉스 PCR에 의해 후속적으로 증폭될 수 있는 제한 부위를 중첩하는 올리고뉴클레오티드의 풀에 혼성화된다. 4C 및 5C 모두에서, 유익한 DNA 단편은 초기에 마이크로어레이에 의해 정량화되었고, 나중에는 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 정량화되었다17,18,19. 이러한 전략은 표적 관심 영역을 특성화하지만 게놈 전체의 상호 작용을 매핑하는 데는 적용할 수 없습니다. 이 후자의 목표는 3C 템플릿의 대규모 병렬 시퀀싱을 통해 게놈 전체 수준('모두 대 모두')에서 염색질 접힘의 편향 없는 특성화를 허용하는 3C 기반 고처리량 전략인 Hi-C를 통해 달성됩니다('모두 대 모두')20. Hi-C 프로토콜은 소화된 절편의 말단에 비오티닐화된 잔기를 혼입시킨 다음, 결찰된 절편의 회수율을 증가시키기 위해 스트렙타비딘 비드로 결찰 절편을 풀다운하는 것을 포함한다20.
Hi-C는 포유류 게놈이 3D 핵에서 여러 규모로 구조적으로 구성되어 있음을 밝혔습니다. 메가 베이스 규모에서 게놈은 활성 및 비활성 염색질 영역, A 및 B 구획으로 각각20,21로 나뉩니다. 상이한 염색질 및 활동 상태로 대표되는 추가 서브 구획의 존재도 이후에 나타났다22. 더 높은 분해능에서, 게놈은 위상 연관 도메인 (TADs)이라고 불리는 서브 메가 베이스 자기 상호 작용 도메인으로 더 분할되며, 인간 및 마우스 게놈23,24의 Hi-C 및 5C 분석에 의해 처음 밝혀졌습니다. 조직별 방식으로 변하는 구획과 달리 TAD는 일정한 경향이 있습니다(많은 예외가 있음에도 불구하고). 중요한 것은 TAD 경계가 종25에 걸쳐 보존된다는 것입니다. 포유류 세포에서 TAD는 종종 동일한 조절 환경을 공유하는 유전자를 포함하며 인접한 조절 영역과의 상호 작용을 제한하면서 유전자 공동 조절을 용이하게 하는 구조적 프레임워크를 나타내는 것으로 나타났습니다(검토 3,26,27,28). 또한, TAD 내에서, 응집력-압출 루프의 기저부에 있는 CTCF 부위로 인한 상호작용은 프로모터-인핸서 또는 인핸서-인핸서 상호작용의 확률을 증가시킬 수 있다(검토29).
Hi-C에서는 1Mb에서 40kb 해상도로 구획 및 TAD를 감지할 수 있지만 5-10kb 규모에서 원위 요소 간의 루프 상호 작용과 같은 더 작은 규모의 접점을 특성화하기 위해 더 높은 분해능을 달성할 수 있습니다. 그러나, HiC에 의해 이러한 루프를 효율적으로 검출할 수 있도록 분해능을 증가시키려면, 시퀀싱 깊이의 상당한 증가를 필요로 하고, 따라서 시퀀싱 비용도 증가시킨다. 분석이 대립 유전자 특이적이어야 하는 경우 이는 악화됩니다. 실제로, 분해능의 X-배 증가는 염기서열 분석 깊이의X2 증가를 필요로 하며, 이는 고분해능 및 대립유전자 특이적 게놈 전체 접근법이 엄청나게 비쌀 수 있음을 의미합니다30.
고분해능을 유지하면서 비용 효율성과 경제성을 개선하기 위해 다운스트림 염기서열 분석 전에 상보적인 비오틴 표지 올리고뉴클레오티드 프로브와 하이브리드화한 후 게놈 전체의 3C 또는 Hi-C 라이브러리에서 표적 관심 영역을 물리적으로 추출할 수 있습니다. 이러한 표적 농축 전략은 Capture-C 방법이라고 하며 게놈 전체에 흩어져 있는 수백 개의 표적 유전자좌(즉, Promoter Capture(PC) Hi-C; 차세대(NG) Capture-C; 낮은 입력(LI) 캡처-C; 핵 적정(NuTi) Capture-C; Tri-C)31,32,33,34,35,36,37,38,39,40 또는 최대 여러 메가베이스에 걸쳐 있는 지역(예: Capture HiC; HYbrid 캡처 Hi-C (Hi-C2); 타일-C)41,42,43. 2가지 측면은 포획 기반 방법에서 다양할 수 있다: (1) 비오티닐화 올리고뉴클레오티드의 성질 및 설계 (즉, RNA 또는 DNA, 분산된 게놈 표적을 포획하는 단일 올리고 또는 관심 영역을 타일링하는 다중 올리고); 및 (2) 3C 또는 Hi-C 라이브러리가 될 수 있는 타겟을 풀다운하는 데 사용되는 템플릿이며, 후자는 3C 라이브러리에서 풀다운된 비오티닐화된 제한 단편으로 구성됩니다.
여기서는 3C 라이브러리에서 타겟 접점의 강화를 기반으로 하는 Capture Hi-C 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 비오티닐화 RNA 프로브의 맞춤형 타일링 어레이 설계에 의존하며 3C 라이브러리 준비에서 NGS 시퀀싱까지 1주일 이내에 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 빠르고 간단하며 5kb 해상도에서 메가베이스 크기의 관심 영역의 고차 3D 구성을 특성화하는 동시에 다른 3C 방법에 비해 시간 효율성과 경제성을 향상시킬 수 있습니다. Capture Hi-C 프로토콜은 X-염색체 불활성화(XCI)의 마스터 조절 유전자좌인 Xist 비암호화 RNA를 호스트하는 X-불활성화 센터(Xic)에 적용되었습니다. Xic은 이전에 광범위한 구조 및 기능 분석의 대상이었습니다 (검토44,45). 포유류에서 XCI는 암컷(XX)과 수컷(XY) 사이의 X-연관 유전자의 투여량을 보상하고 암컷 세포에서 두 개의 X 염색체 중 하나의 거의 전부의 전사 침묵을 포함합니다. Xic은 3D 게놈 토폴로지 및 유전자 조절44와의 상호 작용에 대한 연구를 위한 강력한 황금 표준 궤적을 나타냅니다. 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 Xic에 대한 5C 분석은 TAD의 발견 및 명명으로 이어졌으며, 토폴로지 분할 및 유전자 공동 조절의 기능적 관련성에 대한 첫 번째 통찰력을 제공했습니다24. Xic의 토폴로지 조직은 이후 Xist 상향 조절 및 XCI 46의 적절한 발달 시기에 결정적으로 관여하는 것으로 나타났으며, TAD 내부 및 TAD 사이의 유전자 활성에 영향을 미칠 수 있는 의심되지 않는 시스 조절 요소도 최근 Xic47,48,49 내에서 발견되었습니다. Xic에 걸쳐 있는 마우스 X 염색체의 3Mb에 Capture Hi-C를 적용하면 고분해능에서 대규모 염색질 접힘을 해부하는 이 접근 방식의 힘을 알 수 있습니다. 관심 영역 내의 모든 DpnII 제한 부위에 걸친 비오티닐화 프로브 어레이의 설계부터 게놈 차원의 3C 라이브러리 생성, 표적 접촉의 혼성화 및 캡처, 다운스트림 데이터 분석에 이르기까지 상세하고 따르기 쉬운 프로토콜이 제공됩니다. 적절한 품질 관리 및 예상 결과에 대한 개요도 포함되어 있으며 접근 방식의 강점과 한계는 유사한 기존 방법에 비추어 논의됩니다.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>37%(vol/vol) 파라포름알데히드 용액</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>일회용 유리 바이알; 재사용하지 마십시오</td></tr><tr><td>50mL PP 코니컬 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>바이오분석기</td><td>애질런트</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼 - 25cm 손잡이 및 3.0cm 블레이드</td><td>Falcon</td><td>353089</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem BV</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini, 프로테아제 억제제 칵테일(EDTA 무함유)</td><td>Merck</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL</td><td>Invitrogen</td><td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td><td>자동화 세포 계수기</td></tr><tr><td>Covaris S2</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>DpnII (50000 units/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Merck</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100%)</td><td>Merck</td><td>1.00983.2500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 혈청 (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>돼지 껍질에서 추출한 젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9516</td><td>Coprecipitant</td></tr><tr><td>High-Sensitivity Bioanlayzer chips</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Large Cooling Centrifuge 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>5948000018</td><td></td></tr><tr><td>leukaemia inhibitory factor (LIF)</td><td>Merck</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Liquiport</td><td>KNF</td><td>NF300</td><td>Benchtop aspiration system</td></tr><tr><td>Low-binding filter tips</td><td>Biozym</td><td>VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학 등급 water</td><td>Merck</td><td>W3500-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Next Seq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td></td></tr><tr><td>Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cycles)</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2004</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute (NP40)</td><td>Merck</td><td>11332473001</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem BV</td><td>Axon 1408</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail (EDTA free)</td><td>Merck</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K - 재조합, PCR 등급(20 mg/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32871</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 어세이 튜브</td><td>, Thermo Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 고감도 키트</td><td>, Thermo Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>RNase A(10 mg/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨, pH 5.2(3M)</td><td>Merck</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>속도 진공 농축기</td><td>Eppendorf</td><td>EP5305000100-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPureXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>SPRI 구슬</td></tr><tr><td>SureSelect Target Enrichment Box 1</td><td>Agilent</td><td>5190-8645</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM 인덱싱 Hyb 모듈 Box 2</td><td>Agilent</td><td>5190-4455</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect XT 라이브러리 준비 키트, ILM</td><td>Agilent</td><td>5500-0132</td><td></td></tr><tr><td>T4 리가제(30개/&마이크로; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0013</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기 5427 R</td><td>Eppendorf</td><td>5409000012</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100 (500 mL)</td><td>Merck</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>15527013</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Thermo Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

capture hi-c를 통한 고분해능 3d 염색질 조직 해독

Deciphering High-Resolution 3D Chromatin Organization via Capture Hi-C

게놈의 공간적 구성은 전사, 복제, 재조합 및 복구를 포함한 많은 맥락에서 게놈의 기능과 조절에 기여합니다. 따라서 게놈 토폴로지와 기능 사이의 정확한 인과 관계를 이해하는 것이 중요하며 점점 더 집중적인 연구의 주제가 되고 있습니다. 염색체 형태 캡처 기술(3C)을 사용하면 게놈의 모든 영역 간의 상호 작용 빈도를 측정하여 염색질의 3D 구조를 추론할 수 있습니다. 여기에서는 메가 기반 크기의 게놈 표적의 대립 유전자 특이적 3D 조직을 고해상도로 특성화하는 3C 기반 표적 농축 방법인 Capture Hi-C를 수행하는 빠르고 간단한 프로토콜에 대해 설명합니다. Capture Hi-C에서 타겟 영역은 다운스트림 고처리량 시퀀싱 전에 비오티닐화된 프로브 어레이에 의해 캡처됩니다. 따라서 더 높은 분해능과 대립유전자 특이성을 달성하는 동시에 기술의 시간 효율성과 경제성을 향상시킵니다. 그 강점을 입증하기 위해 Capture Hi-C 프로토콜은 X-염색체 불활성화(XCI)의 마스터 조절 유전자좌인 마우스 X-불활성화 센터 (Xic)에 적용되었습니다.

설명된 Capture Hi-C 프로토콜은 4염기 절단기(DpnII)를 사용하여 게놈 전체 3C 템플릿의 준비를 기반으로 합니다. 관심 게놈 영역에 걸친 결찰 단편의 후속 농축은 이 연구에서 사용된 표적 농축 시스템에 따라 타일링 RNA 프로브 어레이와 스트렙타비딘 기반 포획의 혼성화에 의해 얻어집니다(그림 1). 비오티닐화된 RNA 프로브는 DNA 프로브52,60에 비해 표적에 대해 더 긴밀한 결합 친화도를 나타내기 때문에 선택되었습니다. 그런 다음 캡처된 라이브러리는 멀티플렉싱된 고처리량 시퀀싱을 위해 인덱싱되고 풀링됩니다. 캡처 Hi-C 데이터는 고해상도 Hi-C 상호 작용 맵으로 시각화할 수 있을 뿐만 아니라 4C와 유사한 단일 시점 접촉 맵으로 시각화하여 캡처된 전체 영역 내에서 프로모터 또는 인핸서와 같은 더 작은 시퀀스의 상호 작용을 구체적으로 시각화할 수 있습니다. 프로토콜의 워크플로는 그림 4에 나와 있습니다. 사전 시퀀싱 품질 관리는 그림 2에 나와 있으며 3C 템플릿의 적절한 분해 및 재결찰 평가와 프로토콜의 여러 단계에 걸친 효율적인 전단 및 정제를 포함합니다. 전단된 3C 주형 DNA는 150 내지 700 bp 사이에서 실행될 것으로 예상되며, 단편의 농축 &gt;2 kb는 검출되지 않아야 한다. 다음 단계 동안 여러 비드 기반 DNA 클린업 및 크기 선택 단계가 먼저 전단 후, 그 다음 사전 포획 및 사후 포획 PCR 후에 수행됩니다. 세척된 라이브러리는 고감도 DNA 바이오분석기에서 시각화된 뚜렷한 단편 농축 프로파일을 보여줍니다(그림 2). 평균 단편 크기는 어댑터의 결찰, 시퀀싱 및 인덱싱 프라이머로 인해 라이브러리 준비 과정에서 증가합니다. 시퀀싱 후 품질 관리는 Hi-C Pro를 통해 얻을 수 있으며 그림 3에 나와 있습니다. 3C와 같은 데이터 처리 및 분석을 위해 다양한 생물 정보학 소프트웨어 응용 프로그램이 제안되었습니다. 그 중에서도, HiC-Pro 파이프라인은 가장 인기 있는 솔루션 중 하나이며, 다양한 해상도(55)에서 최종 접촉 맵에 대한 원시 시퀀싱 데이터를 처리할 수 있다. HiC-Pro는 2단계 매핑 전략을 사용하여 참조 게놈에서 염기서열 분석 판독을 정렬합니다. 그런 다음 3C 제품을 재구성하고 필터링하여 정보가 없는 연락처 쌍을 제거하고 연락처 맵을 생성합니다. 또한 알려진 다형성 목록을 사용하여 대립 유전자 특이 분석을 수행하고 별개의 접촉 맵에서 두 부모 대립 유전자에서 오는 접촉을 분리 할 수 있습니다. 보다 최근에, HiC-Pro가 포함되고 nf-코어 프레임워크(nf-core-hic)로 확장되어, 확장성이 뛰어나고 재현 가능한 커뮤니티 기반 파이프라인(61,62)을 제공한다.
마우스 Xic을 포획하기 위해 X 염색체의 3Mb를 타일링하는 28,913개의 RNA 프로브 어레이를 설계했습니다. 이 영역에는 XCI의 핵심 요소인 긴 비암호화 유전자 Xist 및 알려진 ~800kb 조절 환경이 포함됩니다(그림 5). 이 ~800 kb 영역은 2개의 TAD로 분할된다: 하나는 Xist 프로모터 및 그의 공지된 양성 조절인자 (즉, 비암호화 전사체 Ftx, Jpx 및 Xert 및 단백질-코딩 유전자 Rnf12)를 포함하고, Xist의 음성 시스-조절인자(즉, 그의 안티센스 전사체 Tsix, 인핸서 요소 Xite 및 비암호화 전사체 Linx)를 포함하는 인접 TAD (검토44를 위해, 45).
설명된 Capture Hi-C 프로토콜을 Xic에 적용함으로써 이 유전자좌의 토폴로지 구성을 전례 없는 해상도로 얻을 수 있었습니다(그림 6 및 그림 7). 이는 Capture Hi-C 프로파일을 이전에 공개된 5C47과 비교할 때 특히 명확합니다(그림 6 및 그림 7; 보충표 1) 및 Hi-C61(그림 6 및 그림 7; 보충표 1) 프로필. 예를 들어, 하위 TAD 구조가 더 분명한데, Xist 프로모터(Xist-TAD)를 포함하는 TAD는 명확하게 두 개의 작은 도메인으로 세분화됩니다(그림 6A, 파란색 화살촉). 이전에는 5C 프로파일(그림 6B)에서만 시각적으로 "추측"할 수 있었지만 절연 점수 알고리즘을 사용하여 이 영역의 경계를 감지했습니다. 마찬가지로, Capture Hi-C 프로파일의 분해능은 Tsix 유전자좌(Tsix-TAD)의 프로모터를 포함하는 이웃 TAD(그림 6A, B)에서 두 개의 더 작은 도메인을 식별할 수 있게 합니다. 이것은 이전에 5C에서 달성되지 않았습니다(그림 6B). 참고로, Capture Hi-C 및 5C 데이터의 절연 점수에 의해 결정된 토폴로지 경계는 일반적으로 약간 다른 위치와 다른 상대 강도로 감지됩니다.
또한, 접촉 루프와 같은 다른 서브-TAD 구조는 이전에 Capture-C63으로 식별된 Xist와 Ftx 사이의 루프(그림 7A) 및 최근에 Capture Hi-C48에 대해 유사한 프로토콜을 사용하여 식별된 Xist와 Xert 사이의 루프(그림 7B)와 같은 Capture Hi-C 데이터에서 명확하게 볼 수 있습니다. Linx, Chic1 및 Xite 유전자좌 사이의 Tsix-TAD 내에서 알려진 접촉 핫스팟을 형성하는 것과 같은 Capture Hi-C 프로파일의 증가된 분해능으로 인해 다른 접점도 더 정확하게 매핑할 수 있습니다(그림 7A).
그림 7에 표시된 Hi-C 데이터와 비교하여 Capture Hi-C는 분해능을 4배 증가시킬 수 있었지만 시퀀싱 깊이의 1/4(즉, 126M 판독 대 571M)만 필요했습니다(보충 표 1). 이러한 분해능 증가를 통해 그림 6 및 그림 7에 표시된 시퀀싱 깊이에서 Hi-C로 감지할 수 없는 subTAD 및 루핑 상호 작용을 감지할 수 있습니다. 따라서 Capture Hi-C에 대해 설명된 프로토콜은 이전 접근 방식과 비교할 때 대규모 게놈 관심 영역에 대한 훨씬 더 상세한 고해상도 특성화를 가능하게 합니다.
<img alt="DpnII 부위가 있는 염색체 X 맵, 프로브 1-8, 300bp 업스트림/다운스트림, 유전자 분석 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 프로브 설계. 프로브 설계에 사용되는 전략의 개략도. 3Mb 표적 영역에 걸쳐 각 DpnII 제한 부위의 300bp 상류 및 하류 영역을 선택하고 중첩된 비오티닐화 RNA 프로브로 타일링했습니다. 이러한 선택된 영역 중 하나가 chrX: 102,474,805-102,475,500으로 표시됩니다. 각 프로브에는 40개 이하의 반복 염기가 허용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="전기영동 다이어그램 및 크로마토그래피 그래프, DNA 라이브러리 준비 및 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: Hi-C 사전 시퀀싱 품질 제어를 캡처합니다 . (A) 3C 템플릿 품질 관리의 대표적인 예. 200 ng의 DNA를 1% 아가로스 겔에 로딩하였다. 레인 1 : 1kb 사다리. 레인 2: 소화되지 않고 가교된 온전한 염색질은 &gt;10kb에서 날카로운 띠로 실행됩니다. 레인 3: DpnII 소화 가교 염색질은 크기가 1kb에서 3kb 사이인 도말로 실행됩니다. 레인 4 : 최종 3C 라이브러리 또는 템플릿; 소화된 가교 결합된 DNA 단편의 자유 말단은 재결찰됩니다. 더 낮은 분자 크기의 DNA 도말은 거의 검출할 수 없으며 결찰 생성물은 &gt;10kb의 밴드로 검출됩니다. (B) 고감도 바이오분석기 DNA 프로파일의 대표적인 예. 왼쪽 상단: 150bp에서 700bp 사이의 단편 크기 분포를 보여주는 성공적으로 전단된 3C 라이브러리. 오른쪽 상단: 불만족스러운 전단 3C 라이브러리. 전단되지 않은 DNA는 &gt;2kb)의 광범위한 단편 농축으로 검출됩니다. (C) 왼쪽 하단: SPRI 비드를 사용하여 1:1 왼쪽 크기 선택 후 전단된 DNA 샘플. ~ 300 bp의 단편이 풍부합니다. 하단 중앙: 제조업체의 프로토콜에 따라 paired-end 어댑터를 결찰한 후 사전 캡처 PCR 프로필. 오른쪽 하단: 어댑터, 시퀀싱 및 멀티플렉스 시퀀싱을 위한 인덱싱 프라이머를 포함한 최종 Capture Hi-C 라이브러리. 약어: bp = 염기쌍, FU = 임의의 형광 단위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="HiC-Pro 매핑, 페어링, 필터링, 대립유전자 특이적, 접촉, 통계 캡처; 막대 차트 비교." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: HiC-Pro로 Hi-C 시퀀싱 후 품질 제어 캡처 . (A) 시퀀싱 쌍의 첫 번째 메이트에 대한 참조 게놈에 대한 매핑 속도의 예. 연한 파란색 분수는 HiC-Pro에 의해 정렬되고 결찰 접합부에 걸쳐 있는 판독값을 나타냅니다. 따라서 이 메트릭을 사용하여 실험적 결찰 단계를 검증할 수 있습니다. (B) 시퀀싱 메이트가 게놈에 정렬되면 분석을 위해 고유하게 정렬된 읽기 쌍만 유지됩니다. (C) dangling-end, self-circle 또는 re-ligation과 같은 유효하지 않은 쌍(빨간색)은 분석에서 제외됩니다. 유효한 쌍의 비율은 결찰 및 풀다운 효율의 좋은 지표입니다. (D) 유효한 쌍은 염색체 내/간 및 단/장거리 접촉으로 더 나눌 수 있습니다. PCR 아티팩트를 나타낼 가능성이 있는 중복된 읽기 쌍은 분석에서 삭제됩니다. (E) 대립유전자 특이적 분석을 위해 HiC-Pro는 각 부모 게놈(즉, C57BL/6J x CASTEi/J)에 대해 하나 또는 두 개의 메이트가 지원하는 대립유전자 판독 수를 보고합니다. 모계 및 부계 대립 유전자에 할당 된 동일한 비율의 판독이 예상됩니다. (F) 마지막으로, 캡처 영역과 겹치는 유효한 쌍만 선택되어 접촉 지도를 작성합니다. 캡처-캡처 쌍은 대상 영역 내의 접촉을 나타내는 반면, 캡처-리포터 쌍은 대상 영역과 대상을 벗어난 영역 간의 상호 작용을 포함합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Hi-C 데이터 분석에 대한 염색질 가교; 시퀀싱, 소화, DNA 정제 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: Capture Hi-C 프로토콜의 워크플로. 다양한 프로토콜 단계의 개략도. 게놈 차원의 3C 주형을 생성하기 위해 염색질은 먼저 포름알데히드와 가교된 다음 DpnII 제한 효소로 분해됩니다. 그런 다음 유리 DNA 말단이 다시 결찰되고 가교가 역전되고 DNA가 정제됩니다. 표적 영역을 포함하는 단편을 풍부하게 하기 위해, 비오티닐화된 RNA 프로브의 어레이를 3C 주형에 혼성화하고 스트렙타비딘 매개 풀다운에 의해 포획합니다. 캡처 라이브러리는 멀티플렉스 시퀀싱을 위해 처리되며, 유효한 결찰 단편은 고분해능 상호 작용 맵으로 시각화되는 표적 전체의 염색질 접촉 빈도를 추론하기 위해 정량화됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="마우스 X 염색체 다이어그램, 유전자 매핑, 중심체에서 텔로미어로, 게놈 유전자좌 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: 마우스 X 염색체에서 Xic 를 둘러싸고 있는 영역의 개요. 마우스 X 염색체의 개략도 표현 및 3Mb 캡처 영역의 확대(ChrX: 102,475,000-105,475,000). 표적 영역에는 XCI의 마스터 조절 유전자좌인 Xic에 해당하는 ~800kb의 DNA가 포함됩니다. Xic 에는 긴 비암호화 유전자인 Xist, XCI의 핵심 플레이어 및 규제 환경이 포함됩니다. Xist의 포지티브 레귤레이터는 녹색으로, 네거티브 레귤레이터는 보라색으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="경계 및 절연 점수가 있는 염색체 접촉 맵; 다양한 해상도의 Hi-C 데이터." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6: 3Mb 캡처 영역에서 Hi-C, 5C 및 Hi-C 상호 작용 맵을 캡처합니다. (A) 마우스 Xic를 포함하는 3Mb 대상의 Hi-C 상호 작용 맵을 10kb 해상도로 캡처합니다(이 연구). (B) 6kb 해상도에서 A에서와 동일한 대상 영역의 5C 상호작용 맵(47에서 재처리된 데이터). 분석에 포함되지 않은 반복 영역은 흰색으로 마스킹됩니다. 5C 데이터는 자체 생물정보학 처리를 필요로 합니다(47 참조). 세척 및 정렬 후 프라이머 분해능의 5C 맵은 실행 중앙값(창 = 30kb, 단계 = 5)을 사용하여 비닝되어 6kb의 최종 분해능에 도달합니다. (C) 40kb 해상도에서 A 및 B와 동일한 게놈 영역의 Hi-C 상호작용 맵(64에서 재처리된 데이터). 모든 상호 작용 맵은 마우스 ESC에서 생성되었습니다. 절연 점수는 cooltools를 사용하여 계산되었으며 TAD 경계에서 절연 최소값이 있는 히스토그램으로 표시됩니다. TAD 경계는 맵 아래에 수직선으로 표시됩니다. 각 선의 높이는 경계 강도를 나타냅니다. 유전자는 전사 방향을 가리키는 화살표로 표시됩니다. Capture Hi-C 맵에서 독점적으로 또는 더 정확하게 검출되는 서브 TAD 경계는 Tsix 및 Xist TAD의 서브 TAD에 대해 각각 마젠타 및 파란색 화살촉으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="다양한 해상도로 Hi-C 및 5C 다이어그램을 캡처하여 경계 강도 및 절연 점수를 보여줍니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 그림 7: 캡처된 영역 내에서 1Mb에 걸쳐 Hi-C, 5C 및 Hi-C 상호 작용 맵을 캡처합니다. (A) 마우스 Xic를 포함하는 1Mb 게놈 영역의 Hi-C 상호작용 맵을 5kb 해상도로 캡처합니다(이 연구). (B) A에서와 동일한 게놈 영역의 5C 상호작용 맵. 6KB 해상도(47에서 데이터 재처리). 분석에 포함되지 않은 반복 영역은 흰색으로 마스킹됩니다. 참고로, 5C 데이터는 자체 생물정보학 처리를 필요로 합니다(47 참조). 세척 및 정렬 후 프라이머 분해능의 5C 맵은 실행 중앙값(창 = 30kb, 단계 = 5)을 사용하여 비닝되어 6kb의 최종 분해능에 도달합니다. (C) 20kb 해상도에서 Hi-C의 A 및 B 와 동일한 게놈 영역의 Hi-C 상호작용 맵(64에서 재처리된 데이터). 모든 상호 작용 맵은 mESC에서 생성되었습니다. 절연 점수는 cooltools를 사용하여 계산되었으며 TAD 경계에서 절연 최소값이 있는 히스토그램으로 표시됩니다. TAD 경계는 맵 아래에 수직선으로 표시됩니다. 각 선의 높이는 경계 강도를 나타냅니다. 유전자는 전사 방향을 가리키는 화살표로 표시됩니다. Capture Hi-C에서 독점적으로 또는 더 정확하게 감지되는 접촉 루프는 Tsix 및 Xist TAD의 루프에 대해 각각 마젠타 및 파란색 별표로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 이 원고에 사용된 데이터 세트에 대한 사후 시퀀싱 통계: Capture Hi-C(본 연구), Hi-C64 및 5C47. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/Supplementary%20Table%201-corrected.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

The spatial organization of the genome contributes to its function and regulation in many contexts, including transcription, replication, recombination, ...

Capture Hi-C를 사용하면 메가베이스 크기의 게놈 관심 영역의 3D 염색질 조직을 고해상도로 해독할 수 있습니다. Capture Hi-C를 사용하면 더 높은 해상도와 대립 유전자 특이성을 달성하는 동시에 기술의 시간 효율성과 경제성을 향상시킬 수 있습니다. 건강 및 병리학적 조건에서 다양한 모델 시스템, 세포 유형 및 발달적으로 조절되는 염색질 환경에 Capture IC를 적용하면 게놈 토폴로지와 유전자 조절 간의 상호 작용에 대한 이해를 용이하게 할 수 있습니다.시작하려면 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 위해 특별히 준비된 대조군에서 트립토나이즈 및 세포 계수합니다. 생존 가능한 세포의 백분율을 결정하기 위해 생존력 염색을 포함합니다. 이 세포 수로부터, 가교결합을 위해 준비된 플레이트의 총 세포 수를 추정한다.가교를 위해 준비된 플레이트로부터 배양액을 제거하고, 이를 고정 용액으로 교체한다. 셰이커에서 부드럽게 혼합하여 실온에서 10분 동안 고정합니다. 2.5 몰 글리신 PBS를 0.125 몰의 최종 농도에 첨가하여 고정된 반응을 소멸시킨다.10 센티미터 플레이트에서 10 밀리리터에 2.5 몰 글리신 PBS 530 마이크로 리터를 첨가한다. 실온에서 5 분 동안 배양하고 셰이커에서 부드럽게 혼합합니다. 접시를 얼음으로 옮기고 셰이커에서 부드럽게 혼합하면서 얼음에서 추가로 15분 동안 배양합니다.빠른 취급을 위해 고정 용액을 비커에 부어 세포에서 제거합니다. 10 센티미터 플레이트를 5 밀리리터의 차가운 0.125 몰 글리신 PBS로 빠르게 두 번 헹구어 파편과 죽은 세포를 씻어냅니다. 빠른 취급을 위해 비커에 액체를 부어 접시에서 액체를 제거합니다.차가운 0.125 몰 글리신 PBS 5 밀리리터를 10 센티미터 플레이트에 첨가한다. 그리고 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 셀을 빠르게 긁어냅니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 예냉된 50밀리리터 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다.5밀리리터의 차가운 0.125몰 글리신 PBS로 플레이트를 2회 헹구고 세포 현탁액을 원추형 원심분리기 튜브에 첨가한다. 섭씨 4도에서 10분 동안 480G에서 회전합니다. 탁상형 흡인 시스템으로 흡인하여 상층액을 제거합니다.세포를 재현탁하고 세포 현탁액의 500 마이크로리터를 계산된 수의 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 분취한다. 섭씨 4도에서 10분 동안 480배 G로 회전하고 건전지 펠릿을 섭씨 80도에서 보관합니다. 세포 용해를 위해, 얼어 붙은 펠릿을 얼음 위에서 해동하십시오.물에 1.5 밀리리터의 용해 완충액을 준비하십시오. 600마이크로리터의 저온 용해 완충액을 넣고 얼음에 잘 재현탁합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 2, 655G에서 회전하고 탁상용 흡인 시스템을 사용하여 상층액을 제거합니다.100 % SDS의 0.5 마이크로 리터에서 다시 일시 중단하십시오. 섭씨 62도에서 1400RPM으로 10분 동안 소용돌이치며 배양한 후 물 290마이크로리터와 10%트리톤 X 100 50마이크로리터를 넣고 기포를 피하면서 잘 섞는다. 섭씨 37도에서 1400RPM으로 10분 동안 소용돌이치면서 배양한 후 50마이크로리터의 10 X DPN 튜브 버퍼를 추가하고 튜브를 뒤집어 혼합합니다.품질 관리를 위해 소화되지 않은 DNA 50마이크로리터를 별도의 튜브에 넣습니다. 소화되지 않은 대조군 샘플을 섭취하는 것을 잊지 마십시오. DPN2 소화를 위해 10마이크로리터의 DPN2 고농도를 추가하고 뒤집어서 혼합합니다.샘플과 소화되지 않은 대조군을 섭씨 37도의 열 혼합기에서 배양하고 4시간 이상 동안 분당 1400회 회전합니다. 결찰 및 가교 역전을 위해 별도의 튜브에서 품질 관리를 위해 결찰된 소화된 DNA 50마이크로리터를 채취합니다. 소화되지 않고 결찰되지 않은 대조군은 섭씨 20도에서 보관하십시오.800 마이크로 리터의 결찰 칵테일을 추가하십시오. 섭씨 16도에서 배양하여 밤새 분당 1000 회전으로 소용돌이 치십시오. DNA 정제를 위해 얼음 위의 샘플을 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 물 2밀리리터, 얼음처럼 차가운 에탄올 10.5밀리리터, 3몰 아세트산나트륨 583마이크로리터를 추가합니다.얼음처럼 차가운 에탄올 200 마이크로 리터, 아세트산 나트륨 10.8 마이크로 리터 및 공동 침전제 1 마이크로 리터를 소화되지 않은 결찰 된 품질 관리에 첨가하십시오. 섭씨 영하 80도에서 최소 4시간에서 최대 하룻밤 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 2200G의 15밀리리터 튜브를 45분 동안 돌립니다.조심스럽게 에탄올을 제거하고 샘플을 공기 건조시키고 실온에서 10-15 분 동안 대조군을 건조시킵니다. 과도하게 건조하지 마십시오. 샘플과 대조군을 각각 100마이크로리터와 20마이크로리터의 물에 재현탁합니다.3C 템플릿 준비의 품질 관리를 위해 각 샘플 및 각 대조군의 100-200 나노그램을 1% agros 1XTBE 젤에 로드합니다. 그런 다음 pared end multiplex 시퀀싱을 위한 표적 농축을 수행하기 위해 4마이크로그램의 3C 템플릿을 취하여 각 포획 반응에 대해 130마이크로리터의 물에 재현탁합니다. 샘플을 초음파 처리하고 전단 된 DNA 3 마이크로 그램으로 준비를 계속하십시오.제조된 DNA 샘플을 표적 특이적 RNA 프로브에 혼성화하기 위해, 3.4 마이크로리터의 최종 부피에 750 나노그램의 DNA 샘플을 사용하여, 마이크로리터당 221 나노그램의 초기 농도를 생성한다. 3.4마이크로리터의 최종 부피를 달성하기 위해 필요한 경우 속도 진공 농축을 사용하십시오. 10 마이크로 리터에 재현 된 샘플의 경우 15-20 분 동안 농축하면 충분합니다.제조자의 지시에 따라, 섭씨 105도에서 가열된 뚜껑을 가지고 섭씨 65도에서 16 내지 18시간 동안 혼성화 혼합물을 배양한다. 표적 결찰 단편을 포획하기 위해, 결합된 비드에 스트렙티바이드를 프로브 혼성화된 샘플에 첨가하십시오. 마지막으로, 다중 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위해 쌍 및 다중 시퀀싱을 위해 이 연구에서 사용된 표적 농축 시스템에 따라 프로토콜을 계속합니다.Capture Hi-C 상호작용 맵의 해상도를 통해 Tsix 유전자좌의 프로모터를 포함하는 Tsix-tad에서 두 개의 더 작은 도메인을 식별할 수 있습니다. 이것은 이전에 5C에서 달성되지 않았습니다. 또한, 접촉 루프와 같은 다른 서브 태드 구조는 이전에 Capture C로 식별된 Xist와 FTX 간의 루프 및 Capture Hi-C에 대해 유사한 프로토콜을 사용하여 최근에 식별된 Xist와 Xert 사이의 루프와 같은 Capture Hi-C 데이터에서 명확하게 볼 수 있습니다.다른 접촉은 또한 캡처 Hi-C 프로파일의 증가된 해상도로 인해 더 정확하게 매핑될 수 있으며, 예를 들어 Linx, Chic1 및 Xite 유전자좌 사이의 Tsix-tad 내에서 알려진 접촉 핫스팟을 형성하는 것과 같은 프로파일. 표시된 Hi-C 데이터와 비교하여 Capture Hi-C는 해상도를 4배 증가시킬 수 있었지만 시퀀싱 깊이의 1/4만 필요했습니다. 3C 템플릿 준비의 품질 관리로 50마이크로리터의 소화되지 않고 결찰되지 않은 DNA 샘플을 섭취하는 것을 잊지 않는 것이 매우 중요합니다.

deciphering-high-resolution-3d-chromatin-organization-via-capture-hi-c

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

고처리량 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼은 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 시각화를 위한 플랫폼을 제공합니다. 본 프로토콜은 DNA 커튼 기술을 활용하여 Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase인 Abo1의 생물학적 역할과 분자 메커니즘을 조사합니다.

DNA 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독

Hi-C 3.0은 포름알데히드 및 디숙신이미딜글루타레이트 가교결합제를 DpnII 및 DdeI 제한 효소의 칵테일과 결합하여 신호 대 잡음비와 염색질 상호 작용 감지의 분해능을 높이는 개선된 Hi-C 프로토콜입니다.

길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착

게놈 전체 염색체 형태 캡처 방법인 Micro-C-XL을 사용하여 뉴클레오솜 분해능으로 3차원 게놈 조직을 매핑하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑

여기에서는 학부 참여 및 학습에 중점을 두고 염색체 형태 캡처(3C) 기술의 적응을 자세히 제시합니다.

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

우리는 유크로마틴, 헤테로크로마틴, RNAP II의 재현 가능한 지도화를 가능하게 하는 3색 염색질 단분자 위치 현미경(SMLM) 염색 및 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 크로마틴 관련 표적을 포함한 고밀도 핵 환경에서 효율적인 다색 라벨링을 가능하게 하여 신뢰할 수 있는 동시 검출을 가능하게 합니다.

밀집된 핵 환경에서 크로마틴 연구를 위한 다중 표지 단일 분자 위치 현미경 프로토콜

여기서는 RNA 관련 염색질-DNA 상호작용을 포착하여 RNA 관련 3차원 게놈 조직을 매핑하는 프로토콜을 제시합니다.

RNA 연관 염색질 DNA-DNA 상호작용법

배우세요 Capture Hi-C를 활용한 고분해능 3D 염색질 조직 분석 방법입니다. 다양한 세포 유형과 질병 상태에서 게놈 토폴로지와 유전자 조절의 상호작용을 효율적으로 규명할 수 있습니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

더 많은 동영상 탐색