생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징
August 4th, 2022
본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.
이 프로토콜은 동일한 마우스에서 광시야 및 단일 세포 예약 활동을 측정하기 위해 큰 두개골 창을 만드는 것을 보여줍니다. 우리의 방법을 사용하면 저렴한 비용으로 식품 랩으로 크고 안정적인 두개골 창을 만들 수 있습니다. 이 방법은 거시적 및 미시적 수준에서 행동 중 신경 및 신경교 활동을 연구하는 데 효과적입니다.
작은 두개골 창으로 시작하는 것이 좋습니다. 그런 다음 성공하면 창 크기를 늘립니다. 치과 드릴로 두개골 위의 여분의 시멘트를 제거하는 것으로 시작하십시오.
절단 할 영역을 펜으로 표시하십시오. 끝이 두개골을 관통하지 않도록 끝이 뭉툭한 메스를 사용하여 뼈를 자릅니다. 메스로 뼈를 반복적으로 긁어 가볍게 만졌을 때 다듬을 부위의 뼈가 움직일 때까지 홈을 깊게합니다.
미세한 핀셋으로 절개 된 뼈를 제거하십시오. 뇌를 손상시킬 수 있는 뼈 플랩을 뇌에 밀어 넣지 않도록 주의하십시오. 경막을 제거하려면 약 10 마이크로 미터의 테이퍼 팁이있는 당겨진 유리 피펫을 사용하여 경막을 자릅니다.
U 자형 바늘을 사용하여이 컷을 전체 창에 걸쳐 확장하십시오. 60-100x 줌으로 설정된 실체 현미경에서 초미세 핀셋으로 절단된 경막을 제거합니다. 출혈의 경우, aCSF로 헹구거나 젤라틴 스폰지를 사용하여 출혈을 멈추십시오.
그런 다음 PVDC 랩의 큰 조각을 오토클레이빙과 70% 에탄올로 멸균합니다. 실체 현미경으로 핀셋과 메스를 사용하여 필요한 크기의 랩을 잘라냅니다. 표면에 aCSF를 남겨두고 뇌 표면에 랩을 놓습니다.
랩 가장자리에서 aCSF를 빨아 들여 랩이 뇌 표면에 단단히 달라 붙도록합니다. 두개골 창의 가장자리와 랩 사이에 약 1mm의 여백이 있도록 메스와 핀셋으로 랩을 자릅니다. 랩이 제자리에 있으면 랩의 가장자리를 생물학적 접착제로 두개골에 붙입니다.
접착제를 약 30분 동안 건조시키십시오. 혼합 팁이 있는 디스펜서를 사용하여 랩 위에 투명한 실리콘 엘라스토머를 바릅니다. 두께 0.12-0.17 밀리미터의 커버 유리를 위에 놓습니다.
커버 유리의 둘레를 방수 필름, 슈퍼 접착제 또는 치과 용 시멘트로 밀봉하십시오. 먼저 피브로인과 AAV 용액을 작은 샘플 튜브에 1 대 4 비율로 혼합합니다. 용액의 분취량을 두개골 창의 플라스틱 랩에 떨어 뜨리고 적어도 3 시간 동안 건조시킵니다.
그런 다음 이전 섹션에 표시된 대로 랩을 뇌 표면에 부착합니다. 생쥐와 창문의 상태를 2-4 주 동안 정기적으로 확인하십시오. 이때까지 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지표는 AAV 처리 창을 만든 후 충분히 발현됩니다.
이 프로토콜을 사용하면 최대 10 주 동안 10 마리의 마우스 중 8 마리에서 두개골 창을 유지할 수 있습니다. 성상 세포에서 막에 고정 된 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지표를 발현하는 형질 전환 마우스에서 플라스틱 랩, 투명한 실리콘 및 커버 유리로 넓은 창이 만들어집니다. 이 창을 통해 광시야 칼슘 이미징을 수행했으며 공기 퍼프 자극을 반대쪽 수염에 적용했을 때 형광 변화가 관찰되었습니다.
체성 감각 피질의 형광 변화의 시간 경과는 피질 활동을 보였다. 이광자 이미징을 통해 신경교 세포에 특이적인 단일 세포 형광 이미지를 관찰할 수 있었습니다. 감각 자극에 의해 유도 된 형광 변화는 상이한 피질 영역의 개별 세포에서 관찰되었다.
랩은 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지시약을 발현하는 AAV로 코딩되었으며, 피브로인은 두개골 창을 만드는 데 사용되었습니다. 광시야 칼슘 영상은 수술 후 2-4 주 후에 감각 자극에 의해 유도 된 피질을 가로 질러 전파되는 피질 활동을 보여주었습니다. 창이 크기 때문에 동일한 마우스의 다른 피질 영역을 이미지화하고 감각 자극에 의해 유도 된 형광 변화를 개별 세포에서 볼 수있었습니다.
두개골 창을 만들 때 뇌 손상을 피하는 것이 중요합니다. 큰 두개골 창이있는 마우스에서 행동 작업을 수행 할 수 있습니다. 이를 통해 신경 활동과 마우스 행동 사이의 관계를 조사 할 수 있습니다.
이 방법은 다양한 신경 과학 연구에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 의사 결정 작업, 모터 달리기 및 뇌 손상 및 질병의 대량 모델에서 피질 활동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.
개요
이 연구는 식품 포장지, 투명 실리콘, 그리고 커버 글래스를 사용하여 마우스에 큰 두개골 창을 만드는 프로토콜을 제시합니다. 이 창은 행동 중 신경 및 신경교 활동을 검사하기 위해 넓은 필드와 이광자 칼슘 이미징을 모두 가능하게 하여 피질 역학과 감각운동 통합에 대한 통찰력을 제공합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 칼슘 이미징
- 생체 내 이미징 기술
배경
- 신경 활동을 측정하는 것은 뇌 기능을 이해하는 데 중요합니다.
- 두개골 창은 살아있는 피험자의 만성 이미징을 가능하게 합니다.
- 제안된 방법은 비용 효율적이며 확장 가능합니다.
- 기존 기술은 큰 이미징 영역을 수용하지 않을 수 있습니다.
연구 목적
- 큰 두개골 창을 만드는 신뢰할 수 있는 방법을 개발하기 위함입니다.
- 실시간으로 뉴런 및 신경교 활동의 관찰을 가능하게 하기 위함입니다.
- 마우스에서 행동-반응 관계의 연구를 가능하게 하기 위함입니다.
사용된 방법
- 큰 두개골 창은 식품 포장지, 실리콘, 그리고 커버 글래스를 사용하여 만들어졌습니다.
- 모델은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지시자를 발현하는 형질전환 마우스를 포함했습니다.
- 수술 단계 및 자료를 포함한 창 준비의 상세 설명.
- 기술에는 뇌 손상을 방지하기 위한 주의 깊은 취급이 포함되었습니다.
- 수술 후 2-4주에 칼슘 이미징이 수행되었습니다.
주요 결과
- 큰 창을 통해 감각 자극에 의해 유도된 피질 활동의 관찰이 가능했습니다.
- 다양한 피질 영역에서 신경 반응을 나타내는 형광 변화가 관찰되었습니다.
- 10마리의 마우스 중 8마리가 최대 10주 동안 기능적인 창을 유지했습니다.
- 초기 시험에서는 성공 가능성을 높이기 위해 더 작은 창으로 시작하는 것이 제안되었습니다.
결론
- 이 프로토콜은 행동하는 마우스의 뇌 활동에 대한 심층 연구를 가능하게 합니다.
- 이 방법은 다양한 신경과학 연구 분야에 잠재적인 응용 가능성을 가지고 있습니다.
- 얻은 통찰은 신경 가소성 및 행동 신경과학에 대한 이해를 발전시킬 수 있습니다.
