Name: 아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 학습하세요 아데노바이러스를 이용한 천연 방광 요로상피 형질도입법으로 cDNA와 siRNA를 효율적으로 발현하는 방법을. 이 기술은 95%의 높은 형질도입 효율을 제공하여 요로상피 생물학 및 질병 연구에 필수적인 도구입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 P30DK079307(MGD에게), NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC에), NIH 보조금 R01DK129473(GA에), 미국 비뇨기과 협회 경력 개발 상 및 Winters Foundation 보조금(NM)을 통한 파일럿 프로젝트 상, 피츠버그 신장 연구 센터(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어, 그리고 S10OD028596(G.A.에게)에 의해, 이 원고에 제시된 이미지 중 일부를 캡처하는 데 사용되는 컨포칼 시스템의 구매 자금을 지원했습니다.

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Urothelium%3A+Life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
<li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-regulated+exocytosis%2Fendocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li>
<li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li>
<li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li>
<li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li>
<li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li>
<li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+bladder%2C+cystitis+and+nerve%2Furothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li>
<li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li>
<li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463(2014).</li>
<li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conditional+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li>
<li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li>
<li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Quantitative+Cytology+and+Histology%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li>
<li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li>
<li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+delivery%3A+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li>
<li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal%2Ffusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li>
<li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Molecular+Biology+Organization+journal%22%5BJournal%5D)">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li>
<li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li>
<li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li>
<li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li>
<li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores%3A+identification+of+an+electrostatic+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li>
<li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li>
<li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaching+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804(2018).</li>
<li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888(2022).</li>
<li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Ramesh et al. 방광암 치료에 아데노바이러스 형질도입을 사용하기 위한 전략 개발에 초점을 맞추었지만 18, 보다 최근의 보고서에서는 정상적인 요로상피 생물학/생리학 및 병태생리학을 연구하는 데 이러한 기술의 유용성을 입증했습니다 10,18,19,20,21 . 이 접근법의 중요한 특징은 다음과 같다 : (i) 설치류 방광벽 전체에서, 요로 상피 만이 형질 도입된다10,19,20,21,22<sup class=...

요로상피(urothelium)는 신장 골반, 요관, 방광, 근위 요도를 둘러싸고 있는 특수 상피이다1. 그것은 3 개의 지층으로 구성되어 있습니다 : 고도로 분화되고 분극화 된 종종 이중 핵 우산 세포의 층으로, 정점 표면은 소변으로 목욕됩니다. 이들의 급성 손실에 반응하여 표재성 우산 세포를 발생시킬 수 있는 이핵-전이-증폭 세포의 집단을 갖는 중간 세포층; 및 기저 세포의 단일 층, 그 하위 집합은 만성 손상에 대한 반응으로 요로 상피 전체를 재생할 수 있는 줄기 세포로 기능합니다. 우산 세포는 주로 고내성 요로상피 장벽을 형성하는 역할을 하며, 그 구성 요소에는 물과 용질에 대한 투과성이 낮은 정점막(콜레스테롤과 세레브로사이드가 풍부함)과 고저항 정점 접합 복합체(밀착 접합부, 부착 접합부, 데스모솜 및 관련 악토미오신 고리로 구성됨)가 포함됩니다.1 . 우산 세포의 정점 표면과 접합 링은 모두 방광 충전 중에 확장되고 1,2,3,4,5를 배뇨한 후 빠르게 미리 채워진 상태로 돌아갑니다. 장벽 기능에서의 역할 외에도 요로피는 세포외 환경의 변화(예: 스트레칭)를 감지하고 매개체(ATP, 아데노신 및 아세틸콜린 포함)의 방출을 통해 이 정보를 전달하여 이 정보를 비뇨상피하 구심성 신경 과정을 포함한 기저 조직으로 전달할 수 있는 감각 및 변환기 기능을 가지고 있다는 가설이 있습니다 6,7,8 . 이 역할에 대한 최근의 증거는 Piezo1과 Piezo2 모두의 요로상피 발현이 결여된 마우스에서 발견되며, 이는 변경된 배뇨 기능을 초래합니다9. 또한, 우산 세포층에서 밀착 접합 기공 형성 단백질인 CLDN2를 과발현하는 쥐는 간질성 방광염 환자에서 볼 수 있는 것과 유사한 염증과 통증을 일으킨다10. 요로상피관/변환기/장벽 기능의 파괴가 여러 방광 장애에 기여할 수 있다는 가설이 있습니다 6,11.
정상 및 질병 상태에서 요로상피의 생물학에 대한 더 나은 이해는 연구자가 내인성 유전자 발현을 쉽게 하향 조절하거나 천연 조직에서 이식유전자의 발현을 허용할 수 있는 도구의 가용성에 달려 있습니다. 유전자 발현을 하향 조절하는 한 가지 접근법은 조건부 요로상피 녹아웃 마우스를 생성하는 것이지만, 이 접근법은 플록스 대립유전자가 있는 마우스의 가용성에 따라 달라지며 노동 집약적이며 완료하는 데 수개월에서 수년이 걸릴 수 있습니다12. 당연히 연구자들은 요로상피를 형질주입하거나 형질도입하는 기술을 개발했으며, 이는 더 짧은 시간 규모로 결과를 가져올 수 있습니다. 형질감염을 위해 공개된 방법은 양이온성 지질13, 안티센스 포스포로티오화 올리고데옥시뉴클레오티드 14, 또는 HIV TAT 단백질 침투 11-mer 펩티드15에 테더링된 안티센스 핵산의 사용을 포함한다. 그러나 이 프로토콜의 초점은 광범위한 세포에 대한 유전자 전달에 효율적인 잘 연구된 방법론인 아데노비랄 매개 형질도입의 사용에 있으며, 수많은 임상 시험에서 테스트되었으며, 가장 최근에는 COVID-19 캡시드 단백질을 암호화하는 cDNA를 COVID-19 백신의 한 변종 수혜자에게 전달하는 데 사용되었습니다16, 17. 아데노바이러스 수명 주기, 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스의 임상적 적용에 대한 보다 자세한 설명은 독자가 참조17을 참조하도록 지시합니다.
요로상피를 형질도입하기 위한 아데노바이러스 사용의 중요한 이정표는 Ramesh et al. N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)를 포함한 세제로 짧은 전처리가 β-갈락토시다아제를 암호화하는 아데노바이러스에 의한 요로상피의 형질도입을 극적으로 향상시켰습니다18. 이 원리 증명 연구를 지침으로 사용하여 요로상피의 아데노비랄 매개 형질도입은 이제 Rab-family GTPases, 구아닌-뉴클레오티드 교환 인자, 미오신 운동 단편, 기공 형성 밀착 접합 관련 클라우딘 및 ADAM17 10,19,20,21,22 . 동일한 접근법이 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하도록 조정되었으며, 그 효과는 이식유전자22의 siRNA 내성 변이체를 공동 발현함으로써 구출되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 이러한 기술에 대한 요구 사항인 고농축 아데노바이러스를 대량으로 생성하는 일반적인 방법과 요로상피에서 이식유전자를 고효율로 발현하기 위한 Ramesh et al.18의 방법의 적응이 포함됩니다.

<table><tbody><tr><td>10 mL 피펫</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4488</td><td>멸균, 혈청학적 피펫, 개별 포장</td></tr><tr><td>12 mL 초원심분리 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>06-752</td><td>PET thinwall 초원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352097</td><td>멸균</td></tr><tr><td>18 G 바늘</td><td>BD&nbsp;</td><td>305196</td><td>18 G x 1.5 in needle</td></tr><tr><td>20 mL 피펫</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4489</td><td>steril, 혈청학 피펫, 개별 포장</td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352098</td><td>sterile</td></tr><tr><td>5 mL 피펫</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4487</td><td>sterile, 혈청학 피펫, 개별 포장</td></tr><tr><td>Cavicide</td><td>Henry Schein</td><td>6400012</td><td>항바이러스 용액</td></tr><tr><td>세포 배양 접시 - 15cm</td><td>Falcon (Corning)</td><td>353025</td><td>멸균, 조직 배양 처리&nbsp; (150mm × 25mm 접시)</td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼</td><td>Sarstedt</td><td>893.1832</td><td>핸들 길이 24 cm, 블레이드 길이 1.7 cm</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>C-4306</td><td>분자 생물학 등급 &ge; 98%</td></tr><tr><td>DMEM 배양 배지(고포도당)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td>4.5 g/L 포도당 + L-글루타민 + 페놀 레드</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>EDS</td><td>Bioiultra 등급 &ge; 99%</td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Hyclone (Cytiva)</td><td>SH30070.03</td><td>defined serum</td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>5.75 in glass pipette, 오토클레이</td></tr><tr><td>브 글리세롤</td><td>Millipore Sigma</td><td>G-5516</td><td>Molecular Biology grade &ge; 99%</td></tr><tr><td>HEK293 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK293T세포는 SV40 대형 T-항원 이소플루란을 발현하는 HEK293 세포의 변형체입니다</td></tr>.<tr><td></td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>IV 카테터 - 마우스</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3063</td><td>24 G x 3/4 in Safety IV 카테터&nbsp; 방사선 투과성</td></tr><tr><td>IV 카테터 - 랫</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3060</td><td>22 G x 1 인치 안전 IV 카테터 방사선 불투과</td></tr>성 <tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P-9541</td><td>분자 생물학 등급 &ge; 99%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5655</td><td>세포 배양 등급&nbsp; &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&bull; 7 H2O</td><td>밀리포어 시그마</td><td>431478</td><td>&nbsp; &지; 99.99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3014</td><td>분자 생물학 등급 &ge; 99%</td></tr><tr><td>N-도데실-&베타;-D-말토사이드&nbsp;</td><td>밀리포어 시그마</td><td>D4641</td><td>&nbsp; &지; </td></tr><tr><td>98%다양한 동물을 위한 노즈콘</td><td>맞춤형 설계</td><td></td><td>상업 옵션에는 Parkland Scientific (RES3200)</td></tr><tr><td>PD-10 컬럼에서 나온 것이 포함됩니다&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-085-01</td><td>사전 포장된 칼럼이 Sephadex G-25M</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 항생제 (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15070063</td><td>100x 집중 용액</td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>BioPhotometer</td><td></td></tr><tr><td>스탠드 및 클램프</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q 및 05-769-8FQ</td><td>수많은 공급업체에서 제공</td></tr><tr><td>멸균 필터 장치</td><td>Fisher Scientific (Nalgene)</td><td>09-740-65B</td><td>0.2 &micro; m 급류 필터 장치 (150 mL)</td></tr><tr><td>멸균 필터 장치 0.2 &micro; m (주사기)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SLGV004SL</td><td>Millipore 시그마 Milex 0.22 &마이크로; 주사기에 부착되는 m 필터 유닛</td></tr><tr><td>초고속 원심분리기</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810R</td><td>과 Eppendorf F34-6-38 고정 각도 로터 (12,000 rpm)</td></tr><tr><td>주사기 (1 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309628</td><td>1-mL 주사기 Luer-lok 팁 - 멸균</td></tr><tr><td>주사기 (3 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309656</td><td>3-mL 주사기 슬립 팁 - 멸균</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기 (저속)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5702</td><td>스윙 버킷 로터</td></tr><tr><td>전송 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>폴리에틸렌 3.4 mL 전송 피펫</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Millipore Sigma</td><td>648310-M</td><td>분자 생물학 등급&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE select 프로테아제 솔루션</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>12604013</td><td>TrypLE 익스프레스 효소 (1x), 페놀 레드 없음</td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-80 XP</td><td>with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)</td></tr><tr><td>Vaporizer&nbsp;</td><td>일반 마취 서비스, Inc.</td><td>Tec 3</td><td>Isoflurane 기화기</td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>아날로그 와류 믹서</td></tr></tbody></table>

아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

고저항 장벽을 형성하는 것 외에도 신장 골반, 요관, 방광 및 근위 요도를 둘러싸고 있는 요로상피는 환경에 대한 정보를 감지하고 기저 조직으로 전달하여 배뇨 기능과 행동을 촉진하는 것으로 가정됩니다. 요로상피장벽 또는 감각/변환기 기능의 파괴는 질병을 유발할 수 있습니다. 이러한 복잡한 사건을 연구하는 것은 요로상피에서 유전자와 단백질 발현을 변화시키는 간단한 전략이 없기 때문에 방해를 받습니다. 연구자가 다량의 고역가 아데노바이러스를 생성할 수 있도록 하는 방법이 여기에 설명되어 있으며, 이를 사용하여 설치류 요로상피를 고효율로 비교적 간단한 방식으로 형질도입할 수 있습니다. cDNA와 작은 간섭 RNA는 모두 아데노바이러스 형질도입을 사용하여 발현될 수 있으며, 요로상피 기능에 대한 이식유전자 발현의 영향은 12시간에서 며칠 후에 평가할 수 있습니다. 이러한 방법은 마우스 또는 쥐 동물 모델을 사용한 정상 및 비정상 요로상피 생물학 연구에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

바이러스 준비 밀도 구배 원심분리에 의한 바이러스 정제의 예가 도 1A에 제시되어 있다. 로드된 세포 물질과 1.25g/mL CsCl 층의 계면에서 발견되는 연한 분홍색 띠는 주로 파괴된 세포와 그 파편으로 구성됩니다( 그림 1A의 자홍색 화살표 참조). 그것은 프로토콜의 1.5 단계에서 이월되는 소량의 배양 배지에서 분홍빛이 도는 색을 띤다. 유백색 띠로 나타나는 관심 바이러스 입자는 1.25g/mL CsCl 및 1.40g/mL CsCl 용액의 계면에서 발견됩니다( 그림 1A의 노란색 화살표 참조). 농축된 바이러스 입자 위로 2-3mm 위에 떠 있는 물질 띠를 관찰할 수도 있습니다( 그림 1A의 가는 검은색 화살표 참조). 조립되지 않은 바이러스와 파편으로 구성되고 IVP가 거의...

다량의 재조합 아데노바이러스의 생성에 대한 방법이 기재되어 있으며, 이는 이식유전자의 발현 또는 내인성 유전자 산물의 하향조절을 허용하는 천연 설치류 요로상피를 형질도입하는 데 사용될 수 있습니다.

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

이 프로토콜은 조사자가 천연 방광 요로상피에서 CDNA 또는 SIRNA를 발현할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 단순성, 요로상피에서 cDNA, siRNA를 고효율로 비교적 짧은 시간 내에 발현하는 능력입니다. 이 기술의 가장 어려운 부분은 카테터 삽입입니다.그러나 전반적인 기술은 한 번 배우면 비교적 쉽게 마스터할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 전문가 IV인 Giovanni Ruiz가 될 것입니다. 시작하려면 마취 된 마우스를 코 콘 옆의 가열 패드에 놓습니다.프로토콜 기간 동안 동물을 마취 상태로 유지하십시오. 마우스가 발가락 핀치로 완전히 마취되었는지 확인합니다. 방광으로 공기가 유입되는 것을 방지하려면 멸균 이송 피펫 또는 주사기를 사용하여 IV 카테터 및 관련 허브의 플라스틱 카테터 부분을 멸균 PBS로 채웁니다.앙와위 자세의 동물과 함께 외부 요도 비도를 70 % 알코올로 닦습니다. 그런 다음 외부 요도 비도를 형성하는 조직을 부드럽게 잡고 미세한 집게를 사용하여 동물에서 수직으로 확장합니다. 멸균 카테터를 외부 비도에 삽입합니다.다른 손을 사용하여 카테터를 요도 비도에 약 3-4mm 수직으로 조심스럽게 삽입합니다. 그런 다음 외부 비도에 삽입 된 카테터를 동물의 꼬리쪽으로 내리면 치골 아래를 통과하여 궁극적으로 방광으로 들어가는 요도 부분으로 쉽게 들어갈 수 있습니다. 방광의 소변이 새어 나오도록하십시오.Crede의 조작을 수행하여 하복부 부위의 방광 범프를 마사지하고 부드럽게 눌러 잔류 소변을 제거합니다. 요로상피가 형질도입을 수용하도록 하려면 PBS로 채워진 멸균된 1밀리리터 주사기를 카테터 허브에 부착하여 마우스 또는 쥐 방광을 세척합니다. 100마이크로리터의 멸균 PBS를 마우스 방광에 주입합니다.카테터 피팅에서 주사기를 분리한 후 PBS가 배출되도록 합니다. PBS에 용해된 0.1%N-도데실-베타-D-말토사이드 100마이크로리터를 주입하고 멸균된 1밀리리터 주사기를 사용하여 마우스 방광에 멸균된 0.2마이크로미터 필터를 주입합니다. 주사기를 제자리에 두고 N-dodecyl-beta-D-maltoside를 방광에 10분 동안 유지합니다.주사기를 분리하고 배출되도록 하여 방광에서 N-dodecyl-beta-D-maltoside를 제거합니다. 방광에 바이러스를 도입하려면 멸균 된 1 밀리리터 주사기를 카테터 허브에 부착하고 5, 000, 000에서 100, 000, 000 IVP의 아데노 바이러스를 100 마이크로 리터의 멸균 PBS에 희석하거나 쥐의 경우 450 마이크로 리터를 방광에 주입하십시오. 30분 후 주사기를 분리하고 바이러스 용액이 방광을 일회용 패드로 배출하도록 합니다.패드를 버리는 동안 흡수성 물티슈로 잔류 바이러스 용액을 닦아내고 생물학적 유해 폐기물로 닦아냅니다. 동물이 회복 할 수 있도록하려면 이소 플루 란의 흐름을 중단하십시오. 특히 동물이 집단 사육장인 경우 새장으로 돌려보내기 전에 동물이 회복되고 완전히 움직일 수 있도록 하십시오.mRNA in situ hybridization, western blot 또는 immunofluorescence와 같은 방법을 사용하여 처리 후 12 내지 72시간 후에 이식유전자 발현의 효과를 분석한다. 요로상피 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 형질도입된 방광의 요로상피에서 V5 태그가 부착된 인간 성장 호르몬 발현을 나타내었지만 형질도입되지 않은 방광에서는 발현되지 않았습니다. 또한 인간 성장 호르몬 또는 V5 에피토프 태그를 인식하는 항체를 이용한 면역형광법으로도 발현을 확인하였다.웨스턴 블롯 분석은 아데노바이러스로 형질도입된 쥐에서 Claudin-2의 발현을 확인했지만 통제된 GFP-인코딩 바이러스로 형질도입된 쥐에서는 확인되지 않았습니다. 면역형광 분석은 바이러스-코딩 Claudin-2 cDNA로 형질도입된 요로상피우산 세포에서 외인성 Claudin-2 발현을 추가로 확인했습니다. 전체 장착 또는 단면 요로상피의 면역형광 및 공초점 현미경에 의한 Tight Junction Protein 1의 외인성 Claudin-2의 검출은 세포 세포질에서 Tight Junction의 존재 및 Claudin-2의 세포 내 축적을 밝혀냈습니다.이미지 필드는 형질도입된 우산 세포의 수를 세면 95%에 가까운 효율이 나타나고 방광벽 전체에서 요로상피만 형질도입되고 주입된 아데노바이러스에 의해 표적이 되는 다른 조직은 없음을 보여줍니다. 카테터 삽입은 프로토콜이 의도한 대로 작동하는 데 중요합니다. 이 기술을 통해 연구자는 정상적인 요로상피 생물학을 연구할 수 있을 뿐만 아니라 단백질 과발현 또는 과소 발현이 질병을 유발하는 상태를 이해할 수 있습니다.

expression-transgenes-native-bladder-urothelium-using-adenovirus

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

마우스 방광 벽 주입은 orthotopically 방광 줄기 세포와 암 생물학을 연구하는 유용한 방법입니다. 이 섬세한 microsurgical 방법은 신중 기술과 연습 마스터하실 수 있습니다.

마우스 블레더 월 주입

초음파와 발광 생물 이미징에 의한 intravesically 전달 saRNA 및 모니터링 종양 성장의 antitumor 효과를 평가하는 orthotopic 방광 종양 모델을 수립.

Orthotopic 방광 종양 모델 및 Intravesical saRNA 트리 트먼트의 평가

이 비디오는 요도 카테터 삽입과 전기천공법 기술의 조합을 사용하여 DNA 플라스미드를 마우스 방광의 요로 상피로 전달하는 방법을 보여줍니다. 설명된 절차를 통해 마우스 방광암 모델을 생성할 수 있습니다.

마우스 방광의 요로텔륨으로 DNA 플라스미드 전달: 유전자 조작 모델을 생성하기 위해 DNA 플라스미드를 쥐 방광의 요로텔륨 세포로 효율적으로 전달하기 위한 전기천공 기반 절차

기원의 장기에 암 세포의 주입은 새로운 치료법을 평가하는 유용한 전임상 모델이 될 수 있습니다. MB49 방광 암 세포가 방광 내 점적 다음 방광 내에서 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 종양 이식 및 아데노 바이러스 전달의 목적을 위해 마우스 방광 카테터를 보여준다.

유전자 전달 연구 동소 방광암 모델

N-부틸-N-(4 - 히드 록시 부틸) 니트로사민 유도 방광암 모델은 인간의 점액 1 (MUC1) 테스트의 목적 MUC1-감독 면역 형질 전환 생쥐에서 개발되었다. MUC1 표적 펩타이드 백신을 투여 한 후, MUC1에 대한 세포 독성 T 림프구 반응은 혈청 사이토 카인 수준과 T 세포의 특정 활동을 측정하여 확인 하였다.

면역 본래대로 사람 MUC1 유전자 변형 마우스의 침략 과도 셀 방광 암의 유도 : 면역 요법 개발을위한 모델

이 프로토콜 murine 전립선에 바이러스 배달 하는 새로 설립된 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 기술, 유전자 overexpression 또는 Cre recombinase 배달 사용 하 여, 기술 유전자 발현의 orthotopic 변경 허용 하 고 전립선 암에 대 한 새로운 마우스 모델을 구현.

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

이 프로토콜은 발암물질 유도 뮤린 방광암에서 유래한 방광 종양 오르가노이드의 3차원 시험관 내 배양을 확립하기 위한 상세한 실험 단계를 제공한다. 종양 오르가노이드의 통과, 유전 공학 및 정형외 이식을 포함하는 배양 방법이 기재되어 있다.

마우스 방광 종양 오르가노이드의 문화, 조작 및 정형 외과 이식

이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.

Ex Vivo 마우스 자궁 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 오가노이드 모델

이 프로토콜은 형광Ca2+ 센서 GCaMP5G를 사용하여 천연 요로상피 세포에서 기계적으로 활성화된 이온 채널의 기능을 평가하는 방법론을 설명합니다.

Ex Vivo (생체 외 ) 요로상피세포에서 기계적으로 활성화된Ca2+ 과도 현상 분석

학습하세요 아데노바이러스를 이용한 천연 방광 요로상피 형질도입법으로 cDNA와 siRNA를 효율적으로 발현하는 방법을. 이 기술은 95%의 높은 형질도입 효율을 제공하여 요로상피 생물학 및 질병 연구에 필수적인 도구입니다.

아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현

더 많은 동영상 탐색