Name: 실시간 보이드 스팟 어세이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 배우세요 실시간 보이드 스팟 어세이를 이용한 생쥐 배뇨 행동 분석 방법입니다. 이 기술은 주야 주기별 행동 변화와 배뇨 이벤트의 시간적·공간적 데이터를 제공하여 방광 기능 및 신경행동학적 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC), P30DK079307(MGD)를 통한 파일럿 프로젝트 상, 미국 비뇨기과 협회 경력 개발 상 및 Winters 재단 보조금(NM), 피츠버그 신장 연구 센터(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어.

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urothelium%3A+life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).</li>
<li>de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+the+lower+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neural control of the lower urinary tract.</a> Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2015).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), (2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+infection+with+uropathogenic+Escherichia+coli+increases+the+excitability+of+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1(2022).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+tight+junction+barrier+dysfunction+sensitizes+bladder+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents.</a> eNeuro. 4 (3), (2017).</li>
<li>Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+K%2B+promotes+irritative+voiding+symptoms+and+pain+in+the+face+of+urothelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5509(2019).</li>
<li>Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urological+complications+of+obesity+and+diabetes+in+males+and+females+of+three+mouse+models%3A+temporal+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160(2020).</li>
<li>Bartolone, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micturition+defects+and+altered+bladder+function+in+the+klotho+mutant+mouse+model+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).</li>
<li>de Rijk, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging-associated+changes+in+oxidative+stress+negatively+impacts+the+urinary+bladder+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium.</a> International Neurourology Journal. 26 (2), 111(2022).</li>
<li>Coyne, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+lower+urinary+tract+symptoms+%28LUTS%29+and+overactive+bladder+%28OAB%29+by+racial%2Fethnic+group+and+age%3A+results+from+OAB-POLL%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL.</a> Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230(2013).</li>
<li>Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+bladder+dysfunction%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Diabetic bladder dysfunction: a review.</a> Urology. 123, (2019).</li>
<li>Irwin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+survey+of+urinary+incontinence%2C+overactive+bladder%2C+and+other+lower+urinary+tract+symptoms+in+five+countries%3A+results+of+the+EPIC+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Urology%22%5BJournal%5D)">Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study.</a> European Urology. 50 (6), 1314(2006).</li>
<li>Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptoms+of+interstitial+cystitis%2C+painful+bladder+syndrome+and+similar+diseases+in+women%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review.</a> The Journal of Urology. 177 (2), 450(2007).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infection+syndromes%3A+occurrence%2C+recurrence%2C+bacteriology%2C+risk+factors%2C+and+disease+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1(2014).</li>
<li>Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+cystitis+is+bladder+pain+syndrome+with+Hunner%27s+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion.</a> International Journal of Urology. 21, 79(2014).</li>
<li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+bladder%2C+cystitis+and+nerve%2Furothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+%26+Clinical%22%5BJournal%5D)">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89(2014).</li>
<li>Rosen, J. M., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pain+from+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Urology.+21+Suppl%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pain from urinary tract infection.</a> International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26(2014).</li>
<li>Birder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+the+lower+urinary+tract%3A+peripheral+and+spinal+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms.</a> Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128(2010).</li>
<li>Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+rank+in+house+mice%3A+differentiation+revealed+by+ultraviolet+visualization+of+urinary+marking+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns.</a> Science. 182 (4115), 939(1973).</li>
<li>Sugino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voided+stain+on+paper+method+for+analysis+of+mouse+urination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+Urodynamics%22%5BJournal%5D)">Voided stain on paper method for analysis of mouse urination.</a> Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548(2008).</li>
<li>Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+spot+assay%3A+recommendations+on+the+use+of+a+simple+micturition+assay+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).</li>
<li>Rajandram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+urothelial+barrier+function+in+a+mouse+model+of+ketamine-induced+voiding+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).</li>
<li>Ruetten, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uropathogenic+E.+coli+UTI89+model+of+prostatic+inflammation+and+collagen+accumulation+for+use+in+studying+aberrant+collagen+production+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31(2021).</li>
<li>Wegner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void+spot+assay+procedural+optimization+and+software+for+rapid+and+objective+quantification+of+rodent+voiding+function%2C+including+overlapping+urine+spots%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).</li>
<li>Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+noninvasive+measurement+of+cyclophosphamide-induced+changes+in+murine+voiding+frequency+and+volume%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume.</a> The Journal of Urology. 165 (2), 653(2001).</li>
<li>Dmochowski, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+outlet+obstruction%3A+etiology+and+evaluation.+Reviews+in+Urology%5BTitle%5D)+AND+%227+%28Suppl+6%29%2C+S3%E2%80%93S13%22%5BJournal%5D)">Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology.</a> 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).</li>
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<li>Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micturition+video+thermography+in+awake%2C+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Micturition video thermography in awake, behaving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449(2020).</li>
<li>Keller, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voluntary+urination+control+by+brainstem+neurons+that+relax+the+urethral+sphincter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter.</a> Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).</li>
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<li>Negoro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+urinary+bladder+Connexin43+and+the+circadian+clock+in+coordination+of+diurnal+micturition+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm.</a> Nature Communication. 3, (2012).</li>
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<li>Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+voiding+spot+assay+in+mice%3A+a+simple+method+with+complex+environmental+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+distribution+of+PIEZO1+in+the+mouse+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303(2019).</li>
<li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+modelling+of+interstitial+cystitis%2Fbladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome.</a> International Neurourology Journal. 22, (2018).</li>
<li>Okinami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+detrusor+gap+junction+communications+induce+storage+symptoms+in+bladder+inflammation%3A+a+mouse+cyclophosphamide-induced+model+of+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis.</a> PLoS One. 9 (8), (2014).</li>
<li>Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Behavior+Tracker%3A+An+economical+method+for+tracking+behavior+in+home+cages%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages.</a> Biotechniques. 63 (5), (2017).</li>
<li>Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronobiology+of+micturition%3A+putative+role+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock.</a> The Journal of Urology. 190 (3), (2013).</li>
</ol>

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비디오 모니터링의 통합은 기존 VSA에 비해 몇 가지 이점을 제공하는 비용 효율적인 수정입니다. 일반적으로 종말점 분석으로 사용되는 기존 VSA에서는 겹치는 공극 지점을 구별하기가 어렵습니다. 마우스는 일반적으로 케이지 모서리에서 몇 시간 동안 분석이 연장될 때 같은 영역에서 여러 번 소변을 보는 경향이 있기 때문에 이것은 사소한 문제가 아닙니다. 따라서, RT-VSA의 첫 번째 이점은 조사자가 부분적으로 또는 전체적으로 서로의 위에 퇴적된 개별 스팟을 쉽게 식별할 수 있다는 것이다. 이는 도 12에 도시된 실험에 잘 예시되어 있다. 이 경우 비디오 녹화는 마우스가 동일한 모서리에서 세 번 배뇨되어 겹치는 공극 반점을 퇴적하는 것을 확인합니다. VSA의 일반적인 방식으로 실험이 끝날 때만 여과지를 분석하면 한 지점만 구별할 수 있습니다. 따라서 고전적인 엔드포인트 VSA는 보이드 동작의 큰 차이를 식별하는 데 유용할 수 있지만 더 미묘한 표현형을 구별하지 못할 수 있습니다. ...

소변 저장과 배뇨는 골반 및 하복부 신경을 통해 방광 충전 상태에 대한 정보를 수신하는 중추 회로(중추 신경계)에 의해 조정됩니다. 신장 골반에서 근위 요도까지 요로를 둘러싸고 있는 상피인 요로상피는 소변에 존재하는 대사 노폐물과 병원체에 대한 단단한 장벽을 형성합니다. 이것은 방광의 충전 상태를 감지하고 기저 조직과 구심성 신경에 전달하는 감각 웹의 필수 구성 요소입니다 1,2. 요로상피막의 파괴 또는 요로상피기계 전달 경로의 변화는 빈뇨, 절박뇨, 야뇨증, 요실금과 같은 하부 요로 증상과 함께 배뇨 기능 장애를 유발할 수 있다 3,4,5,6,7. 마찬가지로, 노화, 당뇨병, 하부 요로 감염, 간질성 방광염, 및 방광 또는 그 기능을 조절하는 관련 회로에 영향을 미치는 다른 질병 과정은 방광 기능 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. 정상 및 비정상 배뇨 행동에 대한 더 나은 이해는 다양한 배뇨 패턴을 안정적으로 구별할 수 있는 방법의 개발에 달려 있습니다.
전통적으로, 마우스의 자발적인 배뇨 거동은 데자르뎅(Desjardins)과 동료들에 의해 개발된 공극 반점 분석(void spot assay, VSA)을 사용하여 연구되어 왔으며20, 그 단순성, 저비용, 비침습적 접근법으로 인해 널리 채택되었다 8,21,22,23,24. 이 분석은 일반적으로 종말점 분석으로 수행되며, 마우스는 여과지가 늘어선 케이지에서 정의된 시간을 보내고, 이후 여과지를 자외선(UV) 광선(이러한 조건에서 소변 반점이 형광을 발함) 아래에 놓았을 때 소변 반점의 수를 세고 크기를 평가하여 분석합니다.20. 이러한 많은 장점에도 불구하고 기존 VSA에는 몇 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 생쥐는 종종 같은 부위에서 소변을 보기 때문에 연구자는 분석 기간을 비교적 짧은 시간(≤4시간)으로 제한해야 합니다25. VSA가 더 짧은 기간에 걸쳐 수행되더라도 큰 공극 반점 위로 떨어지는 작은 공극 반점(SVS)을 해결하거나 꼬리나 발에 부착된 소변의 이월과 SVS를 구별하는 것은 거의 불가능합니다. 또한 SVS가 빈번하지만 개별적인 배뇨 사건(방광염에 대한 반응으로 종종 관찰되는 표현형)의 결과인지 아니면 배뇨 후 드리블(방광출구 폐쇄와 관련된 표현형)의 결과인지 구별하는 것도 매우 어렵습니다27). 또한, 근무 시간 동안 분석을 완료하려는 욕구와 조명이 꺼졌을 때 주거 시설에 접근하는 데 어려움이 있기 때문에 이러한 분석은 종종 24시간 일주기 주기의 조명 기간으로 제한됩니다. 따라서 이러한 시간 제약은 활성 야간 단계에서 마우스 배뇨 행동의 평가를 방해하여 일주기 리듬에 의해 제어되는 특정 유전자 또는 치료법을 분석하는 능력을 감소시킵니다.
이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해 연구자들은 실시간으로 배뇨 거동을 평가하는 대체 방법을 개발했습니다 26,28,29,30,31,32. 이러한 접근법 중 일부는 대사 케이지(26, 28, 29)와 같은 고가의 장비의 사용 또는 열화상 카메라(30)의 사용을 포함한다; 그러나 이것들 역시 한계가 있습니다. 예를 들어, 대사 케이지에서 소변은 메쉬 바닥의 와이어와 깔때기 벽에 달라붙는 경향이 있어 수집 및 측정되는 소변의 양을 줄입니다. 따라서 작은 공극에 대한 데이터를 정확하게 수집하기 어려울 수 있습니다. 또한, 대사 케이지는 배뇨 사건의 공간적 분포(즉, 모서리 대 챔버 중앙의 배뇨)에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 열화상 카메라에서 사용하는 장파장 적외선이 고체를 투과하지 않는다는 점을 감안할 때, 비디오 열화상 촬영으로 평가한 공극 활동은 개방형 시스템에서 수행해야 하며, 이는 활성 마우스가 공중에서 몇 인치를 점프할 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 또 다른 시스템은 aVSOP(Automated voided stain on paper) 접근법(33)이며, 이는 마우스 케이지의 철망 바닥 아래에서 일정한 속도로 감겨 있는 압연 여과지로 구성된다. 이 접근법은 종이 손상과 고전적인 VSA에서 발생하는 소변 반점의 겹침을 방지하며, 이를 구현하여 조사자가 며칠 동안 실험을 수행할 수 있도록 합니다. 그러나 조사관에게 배뇨 사건의 정확한 시기를 제공하지 않으며 행동 및 그것이 스포팅과 어떤 관련이 있는지 조사할 수 있는 능력이 없습니다. 이 정보를 얻기 위해, 연구자들은 마우스 활동과 배뇨 사건을 동시에 평가할 수 있는 접근법인 배뇨 분석에 비디오 모니터링을 통합했다31,32. 한 가지 접근법은 청색 발광 다이오드(LED) 및 녹색 형광 단백질 필터 세트를 갖는 비디오-카메라를 실험 케이지 아래에 배치하여 보이드 이벤트를 시각화하고, 적외선 LED 및 비디오-카메라를 케이지 위에 배치하여 마우스 위치(32)를 캡처하는 것으로 구성된다. 이 설정은 섬유 측광을 수행하는 동안 보이드 거동을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 그러나 이 시스템의 밝은 조명 환경에서는 조사관이 배뇨를 자극하기 위해 이뇨제로 마우스를 치료해야 했습니다. 또 다른 실험 설계에서는 광각 카메라를 실험 케이지 위와 아래에 배치하여 마우스 운동 활동과 배뇨 이벤트를 각각 시각화했습니다. 이 경우, 케이지 바닥을 라이닝하는 여과지 상에 침착된 소변 반점은 케이지(31) 아래에 배치된 UV 광으로 여과지를 조명함으로써 드러났다. 이 설정은 자발적인 배뇨 행동31에 관여하는 뇌간 뉴런을 연구하기 위해 하루 중 가벼운 단계 동안 4분 동안 짧은 분석에 사용되었습니다. 암흑기 동안 또는 >4분 동안 사용하기 위한 이 시스템의 적합성은 보고되지 않았습니다.
이 기사에서는 마우스 보이드 동작에 대한 장기 비디오 모니터링을 허용하여 기존 VSA를 향상시키는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 비용 효율적인 접근법은 마우스 행동(3,4,34)과 관련된 세부사항과 함께, 하루의 밝은 단계와 어두운 단계 동안 연장된 기간 동안 이벤트 무효화에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보를 제공한다. 보이드 챔버의 구성, 실시간 VSA(RT-VSA)의 구현 및 데이터 분석에 대한 자세한 정보가 제공됩니다. RT-VSA는 비뇨기계의 기능을 제어하는 생리학적 메커니즘을 이해하고, 배뇨를 조절하기 위한 약리학적 접근법을 개발하고, 하부 요로에 영향을 미치는 질병 과정의 분자적 기초를 정의하려는 연구자에게 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>1.00인치 X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 &ndash; &nbsp; 10 인치</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>금액 : 20</td></tr><tr><td>1.00 "로 절단 X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 &ndash; &nbsp; 12인치로 절단</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>금액: 6</td></tr><tr><td>1.00" X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 &ndash; &nbsp; 40인치로 절단</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>금액: 4</td></tr><tr><td>1.00" X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 &ndash; 14.75 인치</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>금액 : 12</td></tr><tr><td>1.00 "로 절단 X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 &ndash; 32인치로 절단</td><td>80/20</td><td>1010</td><td>금액: 5</td></tr><tr><td>1/4-20 더블 슬라이드인 이코노미 T-너트</td><td>80/20</td><td>3280</td><td>금액: 16</td></tr><tr><td>1/4-20 트리플 슬라이드인 이코노미 T-너트</td><td>80/20</td><td>3287</td><td>금액: 18</td></tr><tr><td>10 & 25 시리즈 2 홀 - 18mm 슬롯 내부 코너 브래킷 듀얼 서포트 80</td><td>/20</td><td>14061</td><td>금액: 6</td></tr><tr><td>10 시리즈 3홀 - 스트레이트 플랫 플레이트</td><td>80/20</td><td>4118</td><td>금액: 8</td></tr><tr><td>10 시리즈 5 홀 - "L" 플랫 플레이트</td><td>80/20</td><td>4081</td><td>수량: 8</td></tr><tr><td>10 시리즈 5 홀 - "T" 플랫 플레이트</td><td>80/20</td><td>4080</td><td>금액: 8</td></tr><tr><td>10 시리즈 5 홀 - 티 플랫 플레이트</td><td>80/20</td><td>4140</td><td>수량: 2</td></tr><tr><td>10 시리즈 표준 리프트오프 힌지 - 오른손 조립</td><td>80/20</td><td>2064</td><td>금액: 2</td></tr><tr><td>10에서 15 시리즈 2 홀 - Lite 전환 내부 코너 브라켓</td><td>80/20</td><td>4509</td><td>수량: 6</td></tr><tr><td>24"-long UV 튜브 라이트</td><td>ADJ Products LLC</td><td>T8-F20BLB24</td><td>수량: 2 20W 전구 &ndash; 24" 파장 : 365nm</td></tr><tr><td>아크릴 미러 시트</td><td>전문 플라스틱</td><td></td><td>금액 : 1 82.5 cm x 26.5 cm</td></tr><tr><td>아크릴 미러 시트</td><td>전문 플라스틱</td><td></td><td>금액 : 2 26.5 cm x 30.5 cm</td></tr><tr><td>아크릴 미러 시트</td><td>전문 플라스틱</td><td></td><td>금액 : 2 82.5 cm x 30.5 cm</td></tr><tr><td>AR 폴리 카보네이트 (자외선 저항)</td> <td>80/20</td><td>65-2641</td><td>금액 : 2 4.5mm 두께, 투명, 38.5 cm x 26.5 cm</td></tr><tr><td>AR 폴리 카보네이트 (자외선 저항)</td> <td>80/20</td><td>65-2641</td><td>금액 : 4 4.5mm 두께, 투명, 38.5 cm x 21.5 cm</td></tr><tr><td>AR 폴리 카보네이트 (자외선 저항)</td> <td>80/20</td><td>65-2641</td><td>금액 : 4 4.5mm 두께, 투명, 26.5 cm x 21.5 cm</td></tr><tr><td>AR 폴리 카보네이트 (UV 저항)</td> <td>80/20</td><td>65-2641</td><td>금액 : 4 4.5mm 두께, 투명 37.5 cm x 23.9 cm</td></tr><tr><td>AR 폴리카보네이트(UV 저항)</td><td>80/20</td><td>65-2641</td><td>양: 4 4.5mm 두께, 투명, 24.4 cm x 23.9 cm</td></tr><tr><td>크로마토그래피 종이(얇은 종이)</td><td>&nbsp; Thermo Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>코스모스 압지(두꺼운 종이)</td><td>Blick Art Materials</td><td>10422-1005</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td>버전 9.4.0</td><td>그래프 및 통계 소프트웨어</td></tr><tr><td>ImageJ FIJI</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td></td><td>투명 필름</td></tr><tr><td>퀵 타임 플레이어 10.5 소프트웨어&nbsp;</td><td>Apple</td><td></td><td>멀티미디어 플레이어</td></tr><tr><td>보안 스파이</td><td>Ben 소프트웨어</td><td></td><td>비디오 감시 소프트웨어 시스템</td></tr><tr><td>표준 엔드 패스너, 1/4-20</td><td>80/20</td><td>3381</td><td>수량: 80</td></tr><tr><td>UV 전송 아크릴</td><td>Spartech</td><td>Polycast Solacryl SUVT</td><td>수량: 2 38.5 cm x 26.5 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>물 젤: HydroGel</td><td>ClearH2O&nbsp;</td><td>&nbsp; 70-01-5022</td><td>(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)</td></tr><tr><td>웹캠</td><td>로지텍</td><td>C930e</td><td>금액: 4</td></tr></tbody></table>

실시간 보이드 스팟 어세이

Real-Time Void Spot Assay

정상적인 배뇨 행동은 신경계의 적절한 제어 하에 방광, 요도 및 요도 괄약근의 조정된 기능의 결과입니다. 마우스 모델에서 자발적인 배뇨 행동을 연구하기 위해 연구자들은 동물 케이지 바닥을 감싸는 여과지에 퇴적된 소변 반점의 수와 면적을 측정하는 방법인 공극 반점 분석(VSA)을 개발했습니다. 기술적으로 간단하고 저렴하지만 이 분석은 배뇨 사건의 시간적 분해능 부족과 겹치는 소변 반점을 정량화하는 데 어려움을 포함하여 종말점 분석으로 사용할 때 한계가 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 실시간 VSA(RT-VSA)라고 하는 비디오 모니터링 VSA를 개발했으며, 이를 통해 보이드 주파수를 결정하고, 보이드 볼륨 및 보이드 패턴을 평가하고, 낮의 어두운 단계와 밝은 단계 모두에서 6시간 동안 측정할 수 있습니다. 이 보고서에 설명된 방법은 건강 및 질병 상태에서 자발적인 배뇨의 생리학적 및 신경행동적 측면을 탐구하는 다양한 마우스 기반 연구에 적용할 수 있습니다.

요로상피 Piezo1/2 녹아웃 마우스의 배뇨 행동
배뇨 주기의 저장 단계에서 요로상피는 방광에 축적된 소변에 의해 가해지는 긴장을 감지하고 이 기계적 자극을 장막 ATP 방출 1,3과 같은 세포 반응으로 변환한다는 가설이 있습니다. 우리는 이전에 기계적으로 활성화 된 PIEZO1 및 PIEZO2 채널이 마우스 요로 상피 3,36에서 발현된다는 것을 보여주었습니다. 요로상피 PIEZO 채널이 정상적인 배뇨 거동에 중요한지 확인하기 위해 요로상피 조건부 Piezo1/2 이중 녹아웃 마우스(Pz1/2-KO) 마우스와 연령 및 성별 일치 대조군(Pz1/2-C; 그림 9</stro...

이 기사에서는 기존의 공극 스팟 분석에 비디오 모니터링을 통합하여 마우스 배뇨 거동을 연구하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 보이드 이벤트에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보와 낮의 밝고 어두운 단계 동안 마우스 동작의 세부 정보를 제공합니다.

Normal voiding behavior is the result of the coordinated function of the bladder, the urethra, and the urethral sphincters under the proper control of the ...

이 보고서에 설명된 방법은 건강 및 질병 상태에서 자발적인 배뇨의 생리학적 및 신경 행동적 측면을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 하루의 밝은 단계와 어두운 단계에서 마우스 볼륨 동작을 모니터링할 수 있으며 보이드 이벤트에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보를 제공할 수 있습니다. 실시간 보이드 스폿 분석 또는 RT-VSA 기록 챔버를 준비하려면 RT-VSA 기록 케이지 바닥에 시간에 따라 얇거나 두꺼운 여과지를 놓습니다.여과지 위에 수면 공간을위한 플라스틱 이글루, 농축 용 멸균 1.5ml 미세 원심 분리기 튜브, 60mm x 15mm 플라스틱 접시에 마우스 건조 차우 2-3 개, 젤 팩 형태의 물 14-16g을 놓습니다. 녹음 챔버가 준비되면 마우스를 여과지 위에 부드럽게 놓습니다. 하우징 케이지에서 기록 케이지로 마우스를 옮길 때 최소한의 스트레스로 발생하는지 확인하십시오.마우스가 녹화 케이지 안에 들어가면 덮개를 놓고 덮개 상단을 흡수성 벤치 파란색 패드로 덮어 플렉시 유리 덮개 표면에 직접적인 주변광 반사를 최소화합니다. 하부 챔버의 자외선을 켭니다. 상단 및 하단 카메라에서 RT-VSA 비디오를 녹화하려면 여러 웹캠 또는 네트워크 카메라에서 동시에 녹화하도록 구성된 비디오 감시 녹화 소프트웨어를 사용하십시오.프로그램 창에서 Cmd R을 눌러 녹음을 시작합니다. 초당 한 프레임으로 비디오 녹화를 수행합니다. 녹음을 시작한 직후 방을 나와 문을 부드럽게 닫습니다.전체 실험 동안 방이 조용하게 유지되는지 확인하십시오. Cmd T를 눌러 녹음을 중지하고 자외선을 끕니다. 녹화를 중지한 후 소프트웨어는 각 카메라에 대해 m4v 형식의 동영상 파일을 자동으로 생성하고 이전에 선택한 대상 폴더에 카메라 이름으로 저장합니다.각 카메라의 폴더 내에서 실험이 날짜별로 폴더로 구성되어 있는지 확인합니다. 각 날짜 또는 실험 폴더에 하나의 m4v 파일과 각 동영상 프레임에 해당하는 모든 개별 jpeg 파일이 있는지 확인합니다. 실험 이름과 날짜가 적힌 폴더를 바탕 화면에 만들고 m4v 파일을 이 폴더로 전송합니다.외부 컴퓨터에서 분석하기 위해 동영상 폴더를 플래시 드라이브에 복사합니다. 분석을 위해 밝은 단계 동안 하단 카메라 또는 어두운 단계 동안 상단 카메라에서 수집한 동영상 파일을 엽니다. 동영상의 품질을 평가한 후 빨리 감기 명령 또는 시간 표시줄 슬라이더를 사용하여 올바른 시간 창으로 이동하여 실험을 분석합니다.밝은 단계 동안의 배뇨 활동은 오전 11:00에서 오후 5:00 사이, 어두운 단계에서는 자정에서 오전 6:00 사이에 기록됩니다. 빨리 감기 아이콘을 클릭하여 빨리 감기 모드에서 동영상을 재생하거나 수동으로 동영상을 스크롤하여 마우스가 무효화되고 있다는 증거를 찾습니다. 여과지에 갑자기 밝은 소변 반점이 나타나거나 케이지 모서리로의 움직임과 마우스가 배뇨 할 때 잠시 동안 활동하지 않는 것을 포함한 행동 변화를 찾으십시오. 각 보이드가 발생하는 시간을 등록합니다.관례로, 공극의 시간은 소변이 검출되는 첫 번째 징후에 기록됩니다. 공극을 측정하려면 먼저 스크롤 막대를 사용하여 시간을 앞뒤로 이동하여 소변 반점이 최대한 확산된 지점을 찾습니다. 이 시점에서 동영상을 일시 중지하고 컴퓨터 마우스 화살표를 분석 중인 지점에 배치하여 스크린샷에 관심 지점을 표시합니다.동영상의 출현 순서를 설명하기 위해 상관 번호를 사용하여 스크린샷 파일의 이름을 지정합니다. 모든 보이드 스폿이 분석되면 스크린샷을 캡처하고 여과지의 테두리를 그려 여과지의 전체 면적을 측정합니다. 각 소변 반점의 백분율 면적을 계산하십시오.백분율 영역의 값을 그래프 소프트웨어의 교정 곡선 및 보간 기능을 사용하여 각 공극 지점에 대한 소변의 양으로 변환합니다. 암컷 및 수컷 Piezo1, 2, 녹아웃 및 대조군 마우스의 배뇨 행동은 낮의 어둡고 밝은 단계에서 기록되었습니다. 비활성 광 단계 동안, 대조군과 비교하여 암컷 또는 수컷 녹아웃 마우스에 대해 분석된 임의의 매개변수에서 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다.그러나, 활동적인 암흑기에서, 암컷 및 수컷 녹아웃 마우스는 작은 공극 반점의 수 및 총 부피의 현저한 증가를 특징으로 하는 변화된 배뇨 표현형을 나타내었다. 대조군 마우스와 비교하여 암컷 또는 수컷 녹아웃 마우스에서 1차 공극 반점 또는 PVS 수, PVS당 평균 부피 또는 총 PVS 부피에 유의한 차이가 없었습니다. 암컷 마우스의 배뇨 거동은 기저 조건 하에서 그리고 시클로포스파미드 처리 후에 시험하였다.기저 조건에 비해 시클로포스파미드 치료 후 공극당 소변 방출량이 더 적고 배뇨 사건이 훨씬 더 빈번합니다. 분석 재현성의 한 가지 핵심 측면은 동물을 가능한 한 부드럽게 조작하고 전체 테스트 기간 동안 최소한의 스트레스 상태로 유지하는 것입니다. 이것은 비침습적 분석이기 때문에 방광 및 외부 요도 괄약근 기능을 각각 평가하기 위해 세포 분석 및 근전도 검사를 포함한 추가 절차를 나중에 수행할 수 있습니다.이 기술을 구현하면 연구자가 건강 및 질병 상태에서 행동을 무효화하는 특정 경로의 기여도를 정의할 수 있습니다.

Research

연구

JoVE Journal

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Cell-free Dot Blot은 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응을 검출하기 위한 실용적이고 적응 가능한 면역분석 플랫폼입니다.

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