마우스에서 연속 국소 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 주입을 위한 두개내 캐뉼라 이식
February 24th, 2023
중추신경계(CNS) 종양은 소아 암 관련 사망의 주요 원인이며, 임상 시험에서 환자를 대상으로 하는 국소 면역 기반 요법이 점점 더 많이 테스트되고 있습니다. 이 프로토콜은 CNS 종양을 표적으로 하는 면역요법 주입의 전임상 평가를 위해 마우스에서 국소 캐뉼라 이식 방법을 설명합니다.
이 프로토콜은 중추신경계 종양에 대한 CAR T 세포 요법의 국소 전달을 테스트하기 위해 진행 중인 임상 시험에 사용되는 심실내 카테터 시스템을 복제합니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 침습적 수술 절차를 수행하지 않고도 국소 국소 CAR T 세포 요법을 여러 번 반복 투여할 수 있다는 것입니다. 이 시스템은 서로 다른 전달 부위에서 서로 다른 치료법을 조사하는 데 사용될 수 있으므로 신경 과학의 수많은 연구 영역에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
시작하려면 머리를 깎은 마취 마우스를 수술대에 놓고 주걱을 사용하여 정위 팔의 바닥을 부드럽게 엽니다. 집게로 캐뉼라를 삽입하고 흰색 플라스틱 부분의 절반에서 2/3까지 캐뉼라의 5mm가 개구부 바닥에서 돌출 될 때까지 암의 나사를 조여 고정하십시오. 마우스의 윗니를 정위 장치의 바이트 바에 삽입하고 고정합니다.
노즈 콘을 앞으로 당기고 조여 마우스가 이소플루란을 흡입하도록 합니다. 그런 다음 과도한 압력을 피하면서 이어 커프 또는 이어 바를 사용하여 따뜻하게 한 입체 장치에 마우스를 장착하십시오. 수술 부위를 소독하고 원고에 설명 된대로 두개골과 평행하게 절개하십시오.
면봉을 사용하여 근막을 밀어냅니다. 두개골 판이 만나는 전방 및 후방 표시에 해당하는 두개골의 랜드 마크, bregma 및 lambda를 식별하십시오. 아크릴을 부착 할 표면을 만들려면 메스를 사용하여 두개골을 가로 질러 여러 개의 슬릿을 부드럽게 만듭니다.
정위 팔을 사용하여 캐뉼라를 관심있는 랜드 마크로 현지화하십시오. 캐뉼라 팁을 두개골 표면에서 1-2 밀리미터 위로 올리고 원하는 좌표로 이동하십시오. 18게이지 바늘이나 수술용 드릴을 사용하여 캐뉼라가 들어가는 곳에서 노출된 두개골에 두 개의 나사 구멍을 만들어 캐뉼라를 위한 충분한 공간을 확보합니다.
드릴이 두개골에 부착될 때까지 나사 구멍을 통해 드릴을 비틀십시오. 일자 드라이버를 사용하여 두 개의 나사를 구멍에 삽입하고 조입니다. 그런 다음 나사를 부드럽게 위로 당겨 고정되었는지 확인합니다.
캐뉼라를 삽입하려면 18 게이지 바늘이나 수술 용 드릴을 사용하여 식별 된 좌표로 두개골에 구멍을 뚫습니다. 정위 암을 사용하여 캐뉼라를 원하는 DV 좌표로 내립니다. 도자기 12 웰 플레이트에 약 0.3 그램의 아크릴 수지 분말과 10-15 방울의 액체에서 준비된 점성 백색 물질을 1 밀리리터 주사기에 넣는다.
두개골을 코팅하고 캐뉼라와 나사 주변의 공간을 채웁니다. 시멘트가 유연할 때 정위 암의 나사를 풉니다. 주걱을 부드럽게 사용하여 하단 개구부의 홀더에서 캐뉼라를 풀고 정위 팔을 마우스에서 빼냅니다.
시멘트가 건조되면 더미 캐뉼라를 가이드 캐뉼라에 삽입하고 시계 방향으로 돌려 단단히 고정합니다. 절차가 완료되면 회복을 위해 마우스를 따뜻하게 한 홈 케이지로 되돌립니다. 치료 캐뉼라를 준비하려면 상단을 PKG 튜브에 삽입하십시오.
그런 다음 치료 주사기에 CAR T 세포 현탁액을 채우고 PKG 튜브의 다른 쪽 끝을 통해 삽입하여 치료 캐뉼라의 상단을 덮습니다. 마우스를 마취 한 후 집게를 사용하여 가이드 캐뉼라를 바닥에 고정하십시오. 더미 캐뉼라의 나사를 풀고 제거하여 가이드 캐뉼라에 접근할 수 있도록 합니다.
CAR T 세포를 1분 동안 주입하고 치료 캐뉼라를 추가로 1분 동안 제자리에 유지합니다. 치료 캐뉼라를 제거한 후 더미 캐뉼라를 단단히 조입니다. 그런 다음 통증 조절을 위해 멜록시캄을 피하 투여합니다.
GPC2 지시 CAR T 세포 요법은 수모세포종에서 유의미한 종양 퇴행을 유도하고 시상 미만성 정중선 신경아교종 모델에서 생존을 유의하게 연장했습니다. 가이드 캐뉼라를 종양 내 위치에 삽입할 때 더미 및 치료 캐뉼라 돌출 길이를 설명하기 위해 등-복부 좌표가 종양 주사보다 더 표면적일 수 있음을 이해하는 것이 중요합니다.
개요
이 프로토콜은 마우스에서 중추 신경계 종양을 표적으로 하는 면역 치료 융합의 전임상 평가를 용이하게 하는 국소 관류 주입을 위한 방법을 설명합니다. 이 기술은 여러 번의 침습적 수술 없이 CAR T-세포 치료의 반복 투여를 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 신경과학
- 종양학
- 면역 치료
배경
- 중추 신경계 종양은 소아에서 암 관련 사망의 주요 원인입니다.
- 국소 면역 기반 치료가 임상 시험에서 시험되고 있습니다.
- CAR T-세포 치료가 중추 신경계 종양을 표적으로 하는 데 유망합니다.
- 이 프로토콜은 진행 중인 임상 시험에서 사용된 제3뇌실 카테터 시스템을 복제합니다.
연구 목적
- 전임상 모델에서 CAR T-세포 치료의 효과를 평가합니다.
- 치료제의 국소 지역 전달 방법을 제공합니다.
- 동물 모델에서 반복 치료의 침습성을 최소화합니다.
사용된 방법
- 정위 장치를 사용한 관류 주입.
- 주입된 관류를 통한 CAR T-세포 치료의 투여.
- 동물 복지를 보장하기 위한 마취 및 수술 기술의 사용.
- 치료 후 종양 반응 및 생존 결과 모니터링.
주요 결과
- GPC2 지향 CAR T-세포 치료가 중요한 종양 축소를 유도했습니다.
- 시상 분산 중간선 교종 모델에서 생존 기간이 현저히 연장되었습니다.
- 이 방법은 표적 영역으로의 정확한 치료 전달을 가능하게 합니다.
- 얻은 통찰은 신경과학 및 종양학의 미래 연구에 정보를 제공할 수 있습니다.
결론
- 이 프로토콜은 중추 신경계 종양을 연구하기 위한 귀중한 도구를 제공합니다.
- CAR T-세포 치료의 효과에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 이 접근 방법은 중추 신경계 종양에 대한 개선된 치료 전략으로 이어질 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Serial intracranial cannula implantation enables repeated locoregional CAR T cell delivery in preclinical CNS tumor models, directly addressing the challenge of evaluating immunotherapies in anatomically relevant, disease-relevant systems. This approach increases predictive confidence for translational advancement by mirroring clinical catheter-based delivery and supporting robust, quantitative assessment of therapeutic regimens. The platform is strategically positioned to inform target validation and dosing strategies for pediatric and adult CNS oncology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of CAR T cell efficacy against validated CNS tumor antigens in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by isolating locoregional effects and minimizing systemic confounders.
- Facilitates iterative hypothesis testing for target engagement and tumor response.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for serial dosing and response measurement.
- Enables quantitative assessment of tumor regression and survival following repeated CAR T cell infusions.
- Supports assay development for evaluating delivery site-specific therapeutic effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical delivery methods with clinical catheter-based protocols for translational continuity.
- Allows for risk-adjusted advancement decisions based on robust, serial in vivo data.
- Supports biomarker and pharmacodynamic studies in orthotopic CNS tumor models.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling serial, site-specific immunotherapy delivery in orthotopic CNS tumor models, supporting lead identification and translational assessment.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven testing of CAR T cell constructs and tumor antigen targets in vivo.
- Screening: Standardizes repeated dosing and quantitative tumor response measurement for candidate prioritization.
- Analytics: Provides survival and tumor regression data for comparative analysis across regimens and delivery sites.
- Translational Research: Mirrors clinical catheter-based delivery, supporting preclinical-to-clinical workflow alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable for testing diverse cell therapies and novel agents in CNS disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS immunotherapy studies.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable serial dosing in preclinical models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency for CNS oncology programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and small animal CNS procedures.
- Demands access to stereotactic apparatus, surgical tools, and analytical infrastructure for tumor monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of dosing, infusion protocols, and response criteria.
- Adaptable to various CNS tumor models and delivery coordinates with protocol optimization.
- Dependent on precise anatomical targeting and post-surgical animal care for reproducibility.
