Name: 광제어 생물학적 활성 화합물의 시험관 내 및 생체 내 평가 - 암 광약리학을 위한 잠재적 약물 후보 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: 배우세요 광전환 항암 펩타이드의 시험관 내 및 생체 내 효능 평가 방법을. 2D와 3D 세포 배양에서의 세포독성 분석, 광이성화 효율 측정, 그리고 동물 모델에서의 종양 억제 효과를 확인하는 실험 절차를 익혀보세요.

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저자는 PELICO (#690973) 및 ALISE (#101007256) 프로젝트를 통한 H2020-MSCA-RISE 프로그램의 EU 자금 지원을 인정합니다. 이 작업은 DFG-GRK 2039 (SA, TS 및 ASU), Helmholtz Society의 NACIP 프로그램 (SA 및 ASU) 및 BMBF의 VIP + (OB 및 ASU)의 지원을 받았습니다. 우리는 화합물 LMB002를 합성하고 정제하고 연구를 위해 화합물을 친절하게 제공한 Karlsruhe Institute of Technology의 Serhii Koniev 박사에게 감사드립니다. 저자는 또한 우크라이나에서 비디오를 촬영하고 편집한 Chupryna Maksym과 이 출판물을 실험적인 작업, 집필 및 촬영할 수 있게 해준 우크라이나의 모든 용감한 수비수들에게 감사드립니다.

<ol><li>Fuchter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+promise+of+photopharmacology+using+photoswitches%3A+a+medicinal+chemist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).</li>
<li>Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+photoswitches+in+aqueous+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular photoswitches in aqueous environments.</a> Chemical Society Reviews. 50, 12377-12449 (2021).</li>
<li>Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+neuronal+ion+channels+and+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical control of neuronal ion channels and receptors.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).</li>
<li>Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Photopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">In Vivo Photopharmacology.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photopharmacology+with+a+caged+mu+opioid+receptor+agonist+drives+rapid+changes+in+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior.</a> Nature Methods. 20, 682-685 (2023).</li>
<li>Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomodulation+Approaches+to+Overcome+Antimicrobial+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance.</a> Pharmaceuticals. 16 (5), 682(2023).</li>
<li>Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKolarski%2C+D+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).</li>
<li>Babii, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+drugs+for+photopharmacology%3A+how+much+of+a+safety+advantage+can+be+gained+by+photocontrol%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol.</a> Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28(2020).</li>
<li>Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+of+successful+lead+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Components of successful lead generation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (4), 421-439 (2005).</li>
<li>Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+of+utilizing+in+vitro+and+in+vivo+adme+tools+for+lead+optimization+and+drug+candidate+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).</li>
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<li>Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+model+revolution%3A+unveiling+tumor-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions.</a> Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).</li>
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<li>Babii, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photocontrol+of+peptidomimetics%3A+an+alternative+to+oxygen-dependent+photodynamic+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).</li>
<li>De Ridder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+lung+tumor+spheroids+for+oncoimmunological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+NanoBiomed+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays.</a> Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124(2022).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncologic+photodynamic+therapy%3A+basic+principles%2C+current+clinical+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions.</a> Cancers. 9 (2), 19(2017).</li>
<li>Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+strategies+for+hypoxic-tumor+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).</li>
<li>Hull, K., Morstein, J., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo photopharmacology.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).</li>
<li>Babii, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationships+of+photoswitchable+diarylethene-based+%CE%B2-hairpin+peptides+as+membranolytic+antimicrobial+and+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).</li>
<li>Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+treatment+light+monitoring+for+interstitial+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).</li>
</ol>

IVK, OB, SA 및 ASU는 발행된 특허군에 대한 발명자입니다: "광제어 생물학적 활성을 보유하는 펩티도모방체" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) Lumobiotics GmbH에 라이선스를 부여했습니다. IVK, OB, TS 및 SA는 Lumobiotics GmbH의 설립자이자 주주입니다. IVK는 과학 고문이며 HK, TM, IP 및 PB는 Enamine LLC의 직원입니다. 저자는 공개된 것 외에 출판물에서 논의된 주제 또는 자료에 재정적 이해관계가 있거나 재정적 갈등이 있는 조직 또는 단체와 다른 관련 제휴 또는 재정적 관여가 없습니다.

광제어 화합물은 약물 개발에서 전례가 없습니다. 그러나 전임상 및 임상 평가를 위한 방법은 확립되지 않았습니다. 가장 가까운 단일 요법 유사체 인 광 역학 요법 (PDT)은 암에 대해 많은 국가에서 채택한 임상 사용을위한 치료 방식이며 다른 적응증에 대해 개발 중입니다19,20. 광약리학과 유사하게, PDT는 또한 빛을 사용하여 생리 활성 물질(일중항 산소)을 활성화하는 것을 기반으로 합니다. 따라서 PDT의 전임상 및 임상 연구에 사용되는 일부 실험 방법을 광약리학에 채택할 수 있습니다. 예를 들어, 광원, 광 전달 접근법 및 의료 기기는 PDT에 대해 잘 개발되고 승인되었습니다. 그들은 광제어 약물의 평가에 직접 사용할 수 있습니다. 그러나 PDT와 광약리학은 서로 많은 차이점을 가지고 있다4, 이는 후자에 대한 구체적인 방법을 확립할 필요성을 정당화한다.
첫째, PDT(산소)의 비활성 물질은 항상 무독성 농도로 생체 조직에 존재합니다. 대조적으로, 활성화되지 않은 광제어 생물학적 활성 화합물은 잔류 활성 및 원치 않는 독성을 가질 수 있습니다. 따라서 이상적인 광약리학 약물은 투여된 형태에서 생물학적 활성을 최소화해야 하고 광생성 형태에서 매우 활성이어야 하며, "광치료 창"(21 )은 가능한 한 커야 합니다. 적중을 찾고 적중-리드 최적화를 수행하려면 이미 약물 개발의 초기 단계에 있는 적합한 화합물을 식별하고 비교적 큰 라이브러리를 스크리닝해야 합니다. 여기에서 우리는 효율적인 광전환 화합물을 식별하기 위해 자동화된 고처리량 공초점 형광 현미경을 제안했습니다.
선택된 세포 독성 평가 방법을 사용하면 PSS의 유지 또는 가시 광선에 민감한 광 이성질체의 안정성과 같은 가장 중요한 요구 사항을 쉽게 구현할 수 있습니다. 이는 구현 시 빛 노출이 최소화되기 때문입니다. 따라서 대체 방법을 선택하는 경우 자동화된 방법을 선호해야 합니다. 이 접근 방식은 신뢰할 수 있고 유익합니다. 이 단계에서 3D 세포 배양(스페로이드)을 사용하면 보다 현실적인 조직과 같은 미세 환경에서 치료에 대한 세포의 반응에 대한 전체적인 이해를 얻을 수 있습니다. 또한, 화합물의 작용 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력은 직접적인 방법으로 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 적절한 염색 프로토콜을 사용하는 컨포칼 형광 현미경을 사용하면 세포와 스페로이드의 형태를 시각적으로 평가할 수 있습니다. 세포 사멸 및 세포 내부의 변화에 대한 중요한 세부 사항도 감지할 수 있습니다.
둘째, 가벼운 적용은 가벼운 복용량의 신중한 선택이 필요합니다. PDT에서 가벼운 과다 복용은 조직에 매우 해롭다22. 광약리학적 요법은 과도한 광 조사 하에서 유리할 수 있다. 활성 물질의 상한은 비 활성화 물질의 투여 량 및 약물 동력학에 의해 정의된다. 그러나 가벼운 복용량은 여전히 광약리학에서 문제입니다. 조사 전력 밀도와 노출 시간이 치료 요구 사항보다 적지 않도록 주의해야 합니다. 원칙적으로, 활성화 물질의 생성은 생체 내에서 모니터링 될 수있다. 그러나, 생명윤리상의 이유로, 본 발명자들은 비활성 화합물15와 혼합된 모델 조직(신선한 다진 고기)을 사용한 실험을 제안하였다. 이 실험은 간단하며 다른 광원을 사용하도록 수정할 수 있습니다. 또한 광량에 대한 광물리학적 추정과 열 영향 측정에도 적용할 수 있습니다. 여기서, 모델 조직을 사용함으로써, 광 노출을 최소화할 수 있고, 예를 들어, 생체내 조건에서 보다 정확한 광전환 효율 결정과 비교하여, 항상 흥미롭게 고려할 수 있는 대안이다.
마지막으로, 시험관 내 독성 스크리닝에서 우수한 특성을 나타내고 모델 조직에서 최소 1-1.5cm 깊이에서 효율적으로 광전환되는 화합물은 비용이 많이 들고 힘들며 긴 생체 내 연구를 위해 선택될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 본 발명자들은 동종이식 암 모델을 생성하기 위해 시험관내 평가에서와 동일한 세포주 (LLC)를 사용하였다. 종양 성장 역학, 사망률 및 전이 횟수는 항암 효능을 평가하는 데 가장 적합한 매개변수입니다. 기존의 화학 요법과 비교하여 광 약리학 적 치료에는 빛이라는 추가 요소가 적용됩니다. 그러므로, 두 개의 대조 동물 그룹이 필요하다: 하나는 비히클만 수용하고 다른 하나는 비히클과 방사선 조사를 받는 것이다. 이 설정을 통해 측정된 매개변수에 대한 빛의 영향을 평가할 수 있습니다. 본 실험에서는 두 실험군의 동물에게 비활성 화합물을 투여하고, 한 실험군의 생쥐의 종양을 조사하였다. 조사 체계는 대조군과 치료군에서 동일했습니다. 실험의 주요 목적이 빛과 화합물 적용의 결합 효과를 입증하는 것이기 때문에 이 단계에서는 벤치마크 화학 요법과의 비교가 필요하지 않습니다. 그런 다음 이 효과를 나타내는 최고 성능의 화합물을 선택하여 생체 내 독성에 대한 추가 연구와 개발에 대한 중요한 결정을 내리기 위한 벤치마크와 비교할 수 있습니다. 기술적으로, 우리가 설명하는 생체 내 실험은 약동학 또는 약력학 연구, 예를 들어 이미 약물 리드로 선택된 화합물에 쉽게 적용될 수 있습니다.

광조절된 생물학적 활성 화합물은 최근 수십 년 동안 인간 질병에 대한 안전한 화학 요법의 유망한 구성 요소로 등장했으며 특히 악성 고형 종양을 박멸합니다1. 이 화합물은 가역적으로 광이성질체화 가능한 단편(분자 광스위치)을 포함하며 다른 파장의 빛을 조사할 때 비활성 광이성질체와 활성 광이성질체 사이를 전환할 수 있습니다.
광제어 불가능한 유사체와 비교할 때, 광제어 약물은 덜 활동적이고 본질적으로 독성이 없는 형태로 환자의 신체에 전신적으로 도입될 수 있고 종양, 궤양 및 상처와 같이 필요한 경우에만 빛에 의해 활성화될 수 있기 때문에 더 안전할 수 있습니다. 이러한 분자 약물 프로토타입에 대한 여러 흥미로운 시연이 최근 학술 논문 2,3,4,5,6,7에서 찾을 수 있지만 승인된 약물/의료 기기/질병 조합의 응용인 임상 광약리학 분야는 존재하지 않습니다. 광약리학은 아직 신약 개발 단계에 있으며 체계적인 전임상 연구는 알려져 있지 않습니다.
우리는 매우 최근에야 일부 광제어 항암 펩티드, 즉 항생제 그라미시딘 S8의 유사체에 대한 생체 내 안전성 이점을 입증했습니다. 이러한 광제어 유도체는 디아릴에텐(DAE) 광스위치를 함유하고 있으며, 이는 소위 적색광으로 생성된 "개환형"과 UV로 생성된 "개폐형" 광형태 사이에서 가역적인 광유도 변환을 겪습니다(유도체 중 하나인 화합물 LMB002에 대해 그림 1에 설명됨).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig01.jpg"> 그림 1: 광제어 세포독성 펩타이드 LMB002 및 광이성질체화. 디아릴에텐 단편은 빨간색으로 표시됩니다. 약어: DAE = 디아릴에텐. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
히트를 찾고 히트-투-리드 최적화를 수행하는 것은 종종 적절한 화합물 라이브러리 9,10의 시험관내 및 생체내 스크리닝을 필요로 한다. 여기에서 우리는 광제어 화합물의 세포독성에 대한 체계적인 고처리량 스크리닝에 적합한 방법론을 보여줍니다. 우리는 또한 광이성질화 효율을 결정하고, 모델 조직에서 광량을 추정하고, 가장 성능이 좋은 후보의 생체 내 효능을 평가합니다. 이 접근 방식은 생명 윤리 및 동물 관리 고려 사항을 준수합니다.
이 작업에서는 테스트 된 화합물의 제어되지 않은 광 이성질화를 피하기 위해 전통적인 전임상 방법을 수정합니다. 여기에 이러한 변형된 방법을 적용하는 전반적인 목표는 간단하고 빠르며 통계적으로 유의미한 데이터를 생성하여 시험관 내 활성을 안정적으로 비교하고 리드 식별 및 추가 개발을 위한 광전환 가능한 화합물의 생체 내 효능 테스트를 합리화하는 일반적인 전략을 개발하는 것입니다.
전략은 세 가지 연속 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계는 2차원(2D, 단층) 및 3차원(3D, 스페로이드) 세포 배양 및 컨포칼 고처리량 자동 형광 현미경을 사용하여 선택된 광제어 생물학적 활성 화합물의 활성 및 비활성 광형에 대한 연속 희석액에서IC50 (겉보기 50% 세포 생존율)을 측정하는 것입니다. 광선치료 윈도우를 두 포토폼 간의IC50 차이와 비교하여 가장 성능이 좋은 후보를 선택합니다. 자동화된 현미경 및 기타 세포독성 스크리닝 플랫폼(분석)에 의한 독성 평가에는 특별한 이점이 없습니다11; 보다 복잡한 세포-기반 종양 모델(12 )은 이 단계에서 용이하게 구현될 수 있다.
단계 1에서 선택된 화합물의 경우, 두 번째 단계는 조사된 시료 추출물의 UV 검출 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 조직 대리모에서 덜 활성인 광형체의 광전환 효율을 정량화함으로써 조사된 조직 표면으로부터 깊이의 함수로서 조직 내부의 광전환 효율을 현실적으로 추정하는 것입니다. 생체 내에서 광 전환 효율을 연구 할 수 있지만 간단한 조직 대리모 인 다진 돼지 고기를 사용할 것을 제안합니다. 우리는 이 접근 방식의 타당성을 테스트했습니다. 우리는 생쥐 암 모델에서 생체 내에서 광전환 가능한 화합물의 전환을 측정하고 생쥐를 대상으로 한 이전 실험에서 측정된 깊이에서 거의 동일한 광전환을 관찰했습니다8. 임의의 적합한 대안적 인공 조직(13), 3D 바이오프린팅된 조직/기관(14), 생검 물질, 또는 다른 면제 동물 물질이 사용될 수 있다. 그러나 이 설정은 경제적이고 빠르며 윤리적이기 때문에 좋은 절충안입니다.
세 번째 단계는 쥐암 모델에서 생체 내 항암 효능을 결정하는 것입니다. 시험 관내 실험에서 우수한 특성을 나타내고 모델 조직에서 적어도 1-1.5 cm의 깊이에서 효율적으로 광전환시키는 화합물이 본 실험을 위해 선택된다.
이 프로토콜은 광형(또는 광정지 상태, PSS)이 합리적인 시간(며칠 이상) 동안 안정적인 경우 다양한 유형의 광스위치를 소유하는 화합물에 적용할 수 있습니다. 예시를 위해, 앞서 기술한 DAE 유래 LMB002가 사용된다(15). LMB002 포토폼은 열적으로 안정적이며 -20°C에서 최소 1년 동안 상당한 성능 저하 없이 보관할 수 있습니다. 루이스 폐암(LLC) 세포는 시험관내 및 생체내 시연을 위해 선택되지만, 세포 유형에 대한 제한은 없습니다. LLC 세포는 부착성이고, 3D로 용이하게 배양가능하고, 종양을 생성하는데 사용된다 (참고문헌16에 기재된 바와 같이). 생체 내 LLC 세포는 전이 과정을 모델링하는 데 사용되며 피하 주사 후 면역 적격 마우스에서 고형 종양을 쉽게 생성할 수 있습니다. 이러한 생체 내 방법론은 다른 암 모델에도 보편적으로 적용될 수 있다17,18. 이 전략의 자세한 구현은 아래에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Agilent 1100 시리즈 모세관 LC 시스템</td><td>ALSI-Chrom (Agilent distributor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line</td><td>ECACC</td><td>90020104</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NCrl 마우스, 암컷, 근친 Charles</td><td>River</td><td>스트레인 코드: 027</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture, CO2 인큐베이터</td><td>Esco Micro</td><td>CCL-170B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement membrane matrix</td>, <td>Merck</td><td>CLS354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning, 384웰 스페로이드 마이크로플레이트</td>, <td>Merck</td><td>CLS3830</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Merck</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, DPBS,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600044</td><td></td></tr><tr><td>Gramicidin S</td><td>Lumobiotics</td><td></td>, <td>맞춤형 합성</td></tr><tr><td>HyClone, DMEM/고혈당</td><td>Cytiva</td><td>SH30003.04</td><td></td></tr><tr><td>IN 세포 분석기 6500HS, 이미징 시스템</td><td>Cytiva</td><td>29240358</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 마취기</td><td>ASA</td><td>S/N ASA 1305</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민, 200mM 용액</td><td>Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LIKA 외과 의사, 다이오드 수술 레이저</td><td>Fotonika</td><td></td> plus-LMB002 <td></td></tr><tr><td></td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>맞춤형 합성</td></tr><tr><td>페니실린&ndash; 스트렙토마이신, 용액 안정화</td><td>Merck</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate, 96웰 플레이트</td><td>PerkinElmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>광도계 PCE-LED 20</td><td>PCE 기기</td><td>PCE-LED 20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Propidium iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66764-MC</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% 용액</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&ndash; EDTA, 10 x 용액</td><td>Merck</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz 통풍 캡이 있는 세포 배양 플라스크, 75 cm2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200263</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz, 병 상단 필터, PES, 0.22 &mu; m</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360882</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP, C18 HPLC 컬럼 (4.6 mm &times; 250 mm, 5 &micro; m)</td> <td>Altmann Analytik (Avantor 유통 업체)</td><td>GR5103827</td><td></td></tr></tbody></table>

광제어 생물학적 활성 화합물의 시험관 내 및 생체 내 평가 - 암 광약리학을 위한 잠재적 약물 후보

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

광제어 생물학적 활성 화합물은 "스마트" 약물 후보의 새로운 부류입니다. 그들은 양성이고 이온화할 수 없는 빛을 환자의 신체 내 특정 위치로 향하게 함으로써 정확한 시공간 활성화로 인해 전신 화학 요법에서 추가적인 안전성을 제공합니다. 이 논문은 약물 개발 초기 단계에서 생체 내 효능뿐만 아니라 광제어 생물학적 활성 화합물의 광활성화에 대한 시험관 내 효능 및 생체 외 효율성을 평가하는 일련의 방법을 제시합니다. 상기 방법론은 항암 세포독성 펩타이드, 즉 디아릴에텐 함유 유사체로 공지된 항생제인 그라미시딘 S에 적용된다. 실험은 면역 적격 마우스에서 암 세포주(Lewis lung carcinoma, LLC), 살아있는 조직 대리모(돼지고기 다진 고기) 및 동종이식 암 모델(피하 LLC)의 2D(부착 세포) 및 3D(스페로이드) 세포 배양을 사용하여 수행됩니다. 가장 효과적인 화합물의 선택과 사실적인 광치료 창의 추정은 자동 형광 현미경을 통해 수행됩니다. 다양한 조명 요법에서의 광활성화 효율은 모델 조직의 상이한 깊이에서 결정되고, 최적의 광량은 최종 치료적 생체 내 실험에 적용된다.

이 작업에서, 상이한 배양 시간에서 LMB002의 "고리-폐쇄" 및 "고리-개방" 형태(도 1 참조)에 대한IC50을 결정하기 위해 2D 및 3D 세포 실험을 수행하였다. 이 값은 프로토타입 펩타이드인 그라미시딘 S(양성 대조군으로 사용됨)에 대해 얻은 값과 비교되었습니다. 염색 후 2D-성장 LLC 배양물에서 배양한 전형적인 이미지 세트가 그림 5에 나와 있습니다. Hoechst 33342(파란색) 및 프로피듐 요오드화물(빨간색)과의 동시 염색은 "고리 폐쇄"와 비교하여 "고리 개방" 형태로 처리한 경우 세포의 더 큰 부분에서 다른 보라색 음영을 초래하여 쉽게 정량화할 수 있는 두 형태 간의 세포 독성에서 눈에 띄는 차이를 나타냅니다. 성공적인 실험의 입증된 예는 그림 2와 같이 다양한 농도의 펩타이드 변이체가 추가된 96웰 플레이트 형식을 사용하여 수집된 데이터를 기반으로 합니다. 384웰 및 고밀도 플레이트에서도 유사한 데이터를 얻을 수 있습니다. 그러나, 웰당 부피가 감소하기 때문에, 기술적 및 체계적 에러가 발생하고, 그 결과, 웰 밀도가 증가함에 따라IC50 측정의 정확도가 감소할 것이다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig05.jpg"> 그림 5: 단층 성장 LLC의 세포독성 분석의 대표 이미지. 세포를 Hoechst 33342 (청색) 및 요오드화 프로피듐 (적색)으로 염색하였다. 표시된 시간: 10분, 60분, 24시간 및 72시간은 화합물을 사용한 배양 시간입니다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
모델 조직에서의 레이저 광 조사에 의한 LMB002의 광변환-신선한 돼지고기 다진 고기-를 PBS에 용해된 LMB002 "고리-닫힘"(비활성) 형태와 혼합된 다진 고기로 구성된 샘플을 사용하여 결정하고, 방사선 전파 방향에서 LMB002 "고리-개방"(활성화된) 형태로의 이러한 비활성 형태의 전환을 측정하였다. 샘플을 주사기에 넣고 그림 3과 같이 ~10분(일반적으로 생체 내 실험에 사용됨)의 노출 시간 동안 평평한 레이저 방사선 빔으로 한쪽에서 조사했습니다. 노출 후, 샘플 실린더는 주사기 피스톤을 누르고 메스로 동일한 높이의 슬라이스를 절단하여 부분으로 나누었습니다. 절편으로부터의 추출물 중의 LMB002 "개환"의 농도를 RP HPLC를 사용하여 측정하였다.
도 6은 데이터 분석으로부터 얻어진 용량-효과 곡선 도 6A-D를 도시한다. Hoechst 33342 및 PI 염료의 핵 동시 염색으로 죽은 세포의 비율을 식별하기 위해 선택한 측정 매개변수에서 수치 임계값을 설정하여 모든 세포 수를 여러 범주로 분할하는 내장 분류기 도구를 사용했습니다. 예를 들어, 대조군의 적색 채널(프로피듐 요오드화물) 신호가 임계값(약 110-130 단위)에 있을 때 세포는 죽은 것으로 간주되는 PI 양성 또는 화합물의 영향을 받지 않는 것으로 간주되는 PI 음성으로 분류될 수 있습니다. LMB002의 경우, 화합물 농도에 대한 프로피듐 요오드화물 양성 세포의 백분율의 S상 결장성 의존성을 볼 수 있습니다. 이들 데이터로부터,IC50 값이 결정될 수 있다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig06.jpg"> 그림 6: 2D 배양에서 세포독성 분석. 화합물과의 인큐베이션을 위해 취한 (A) 10분, (B) 60분, (C) 24시간 및 (D) 72시간 간격 동안 LLC 배양에서 얻은 시그모이드 적합. 피팅을 통해IC50 값(도시되지 않음)을 정확하게 측정할 수 있습니다. 오차 막대는 SEM입니다. 약어: LLC = 루이스 폐암; PI = 요오드화 프로피듐. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
얻어진 IC50 값을 고려할 때, 우리는 세 가지 화합물 모두의 독성이 배양 시간에 따라 증가한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 우리의 실험은 LMB002의 "환-개방" 형태가 프로토타입 펩티드인 그라미시딘 S보다 약 1 희석 단계 덜 독성인 반면, "환-폐쇄" 형태는 배양 시간에 따라 증가하는 3 내지 4개의 희석 단계 더 낮은 독성을 입증하는 것으로 밝혀졌다. 두 희석 단계 사이의 차이는 배양 시간의 증가에 의해 영향을 받지 않으며, 잠재적인 라이브러리 스크리닝에서 다른 화합물과 비교하기 위해 실험적으로 결정된 광치료 윈도우(6 )로서 수치적으로 사용될 수 있다. 그라미시딘 S에 대한IC50 값은 생물학적 복제물에서 실험 오류 또는 차등 출력을 수정하기 위한 기준점으로 설정되었습니다.
3D 세포 실험은 동일한 유형의 원시 데이터, 즉 단일 세포 분해 웰당 하나의 스페로이드 이미지를 생성했습니다. 세 번째 염색 염료로 칼세인을 포함하면 대사 활성 세포의 분획을 정량화할 수 있습니다(녹색 채널에서 관찰됨). 384웰 플레이트를 사용하고, 기술 복제 횟수를 늘리고, 중복 공동 배양 시점을 제외하고, 희석 폴드를 변경함으로써 그림 7의 플레이트 맵에 표시된 대로 단일 테스트 실행(단일 플레이트 사용)에서 여러 화합물을 직접 비교할 수 있었습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig07.jpg"> 그림 7: 두 가지 화합물을 사용한 3D 배양 실험을 위한 플레이트 맵. 화합물 및 대조군에 대한 색상 코드가 표시됩니다. 웰의 숫자는 μM 단위의 농도입니다. 10분, 24시간 및 72시간은 배양 시간입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 8은 염색 후 캡처된 테스트 화합물 및 대조군 스페로이드의 존재 하에서 1 스페로이드/웰의 밀도로 성장한 LLC 스페로이드의 선택된 기술 복제 이미지를 표시합니다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig08.jpg"> 그림 8: 3D 배양 세포독성 분석의 대표 이미지. 이미지는 LMB002 광형과 그라미시딘 S와 함께 10분, 24시간 및 72시간 동시 배양 후 Hoechst 33342(파란색), 칼세인 AM(녹색) 및 요오드화 프로피듐(빨간색)으로 염색된 48시간 된 LLC 스페로이드를 보여줍니다. 스케일 바 = 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
기기 소프트웨어를 사용하여 2D 실험에서와 같은 선량-효과 곡선을 z-스택 이미지 더미에서 얻었습니다(그림 9A). 또한, 3D 배양에서 조밀하고 변형되지 않은 스페로이드는 전체 스페로이드 직경으로 특성화할 수 있습니다(그림 9B). 또한 전체 스페로이드 직경은 화합물 농도에 따라 달라진다는 점에 주목했습니다.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig09.jpg"> 그림 9: 3D 배양을 통한 세포 독성 평가. (A) 농도 의존적 세포독성 피팅 곡선 및 (B) 10분, 24시간 및 72시간 동안 그라미시딘 S와 공동 배양하고 염색 전에 캡처한 LLC의 3D 배양에서 얻은 농도 의존적 스페로이드의 직경 플롯. 오차 막대는 SEM입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2단계에 대한 실험에서는 UV 검출 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 두 광형에서 LMB002 농도를 측정할 수 있습니다. 모델 조직에서 광변환의 효율은 이 설정을 사용하여 쉽게 평가하고 정량화했습니다(그림 3). 데이터는 샘플 추출물의 크로마토그램의 정량 분석으로부터 얻어졌다. 이 테스트 실험에서 LMB002 크로마토그램은 270nm 및 570nm에서 분광법으로 검출되었습니다. 270 nm에서, 많은 추가 신호가 관찰되었고, 모델 조직으로부터 공동 추출된 화합물에 기인하였다 (화합물 없이 대조군 추출물로부터 확인됨). 두 광형은 머무름 시간과 흡광도에서 충분히 달랐습니다. 그러나, LMB002 "링-오픈(ring-open)" 신호는 이들 배경 신호로부터 기준선-분리되었다( 도 10A의 대표적인 크로마토그램 참조). 따라서 이 신호는 문제 없이 통합될 수 있습니다. 570nm에서 크로마토그램에는 LMB002 "고리 폐쇄" 형태 신호만 포함되었습니다(그림 10B). 여기서, RP HPLC를 이용하여 농도 측정을 수행하였다. 그럼에도 불구하고 LC/MS를 분석 방법으로 사용하여 더 높은 정확도와 더 낮은 검출 한계를 달성할 수 있었습니다.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig10.jpg"> 그림 10: 모델 조직에서 추출한 LMB002의 대표적인 크로마토그램. (a) 조사된 표면으로부터 2 mm에서의 샘플, 270 nm에서 기록됨 (LMB002 "개환" 형태가 집적됨); (b) 조사된 표면으로부터 38 mm에서의 샘플, 570 nm에서 기록됨 (LMB002의 피크 "고리-폐쇄"가 집적됨). 머무름 시간 값(표시됨)은 화합물의 정체를 추가로 확인했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
수집된 모든 샘플의 해당 신호를 통합한 후 얻은 데이터는 그림 11과 같이 농도-깊이 그래프를 작성하는 데 사용되었습니다. 이러한 그래프를 기반으로 모델 조직의 다른 깊이에서 광변환 효율을 쉽게 평가할 수 있습니다. 그것은 우리의 적색 광원이 조직 대리모, 다진 고기(약 103mW/cm 2에서)에서 최대 1c 깊이에서 "고리 닫힘"LMB002 광변환을 유도한다는 것을 확인합니다.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig11.jpg"> 그림 11: 광변환 효율 평가. 모델 조직(L, mm)의 조사된 표면에서 서로 다른 거리에 있는 LMB002 "고리 닫힘"(비활성화, 파란색 점) 및 "고리 개방" 형태(활성화됨, 주황색 점)의 농도(A, mg/kg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
생체 내 실험의 결과(그림 4에 제시된 일정에 따라 수행된 방법론의 3단계)는 시간의 함수로서 종양 성장을 보여주는 그래프(그림 12)와 Kaplan-Meier 생존 곡선(그림 13)으로 표시되었습니다.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig12.jpg"> 그림 12: 동물의 종양 성장 역학. 비히클-처리된 동물과 비교하여 LMB002로 처리된 동물 (C57BL/6NCrl 마우스의 피하 LLC 동종이식 모델, 화합물 용량 7 mg/kg, IV, 2시간 40분 인큐베이션, 그 후 650 nm, 100 mW/cm2, 20 분에서 방사선 조사). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig12large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig13.jpg"> 그림 13: 동물의 사망률 곡선. 비히클-처리된 동물과 비교하여 LMB002로 처리된 동물 (C57BL/6NCrl 마우스의 피하 LLC 동종이식 모델, 화합물 용량 7 mg/kg, IV, 2시간 40분 인큐베이션, 그 후 650 nm, 100 mW/cm2, 20 분에서 방사선 조사). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig13large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 이러한 화합물의 전임상 스크리닝에 사용할 수 있는 광전환 가능한 항암 펩타이드의 평가를 위해 채택된 일련의 실험을 제시합니다. 여기에는 2D 및 3D 세포 배양에서의 세포 독성 평가, 생체 외 (모델 조직) 광이성질화 효율 평가 및 생체 내 효능이 포함됩니다.

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

광조절된 생물학적 활성 화합물은 분자에 가역적으로 광이성질체화 가능한 단편, 광스위치를 포함합니다. 화합물은 가역적 광 유도 전기 순환 변환을 겪는 diarylethene 단편에 의해 변형된 고리형 펩타이드입니다. 그들은 광 전환, 즉 UV에서 생성되고 생물학적으로 비활성 형태와 적색광에서 생성되고 생물학적으로 활성 형태 사이를 전환할 수 있습니다.광전환이 가능한 약물은 광전환이 불가능한 약물보다 안전하다고 믿어집니다. 이는 인체에 독성이 없고 비활성화된 형태를 투여하고 필요한 곳(예: 종양, 오거 또는 상처)에만 빛으로 국소적으로 활성화할 수 있기 때문입니다. 이러한 광약리학 약물의 전임상 또는 임상 개발을 위한 표준 방법이나 프로토콜이 없으므로 여기에서는 이 초기 전임상 연구에 사용할 수 있는 실험을 보여드리고자 합니다.카테리나 호르바톡(Kateryna Horbatok)과 테티아나 마흐니(Tetiana Makhnii)가 절차를 시연할 것입니다. 동물 관리 및 실험 절차는 Bienta Company의 생명 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 먼저 표준 절차를 사용하여 버퍼를 준비합니다.또는 상업적으로 이용 가능한 솔루션을 사용하십시오. 화합물의 원액을 준비하십시오. 각 컴파운드에 대해 링 폐쇄 포토폼에 있는 5.12mg의 컴파운드 배치 2개를 1.5밀리리터 Eppendorf 튜브 2개(하나는 투명 튜브, 다른 하나는 투명 벽이 있는 튜브)로 계량합니다.양성 대조군으로, 여분의 튜브에 2.28 밀리그램의 부모 (photocontroled)가 아닌 펩타이드의 무게를 잰다. 각 샘플에 100 마이크로리터의 순수 DMSO를 첨가하고, 30초 동안 와동시킨다. 650나노미터 레이저, 광출력 밀도 6와트/센티미터 제곱, 혼합을 보장하기 위해 볼텍싱으로 용액을 조사하여 투명 벽 튜브의 저장 용액을 광이성질화합니다.색상이 짙은 자주색에서 밝은 갈색으로 바뀔 때까지 계속하십시오. 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하십시오. 웰 당 5, 000 내지 10, 000 세포를 시드한다.우리는 투명한 바닥과 검은 색의 불투명 벽을 가진 96 웰 멸균 플레이트의 중앙 60 웰에서 200 마이크로 리터의 DMEM에서 약 8, 000 개의 루이스 폐암 세포를 사용했습니다. 나머지 36개의 웰을 순수 DMEM으로 채웁니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 5% CO2 대기에서 배양합니다.다음날, 화합물의 연속 희석액과 폴리프로필렌 오토클레이브 투명 플레이트에서 양성 대조군을 준비합니다. DMSO에 있는 주식으로 시작하고, DMEM로 묽게 하되, 마지막 가장 높은 농도에 있는 1% 부피 DMSO를 초과하지 마십시오. 연구된 화합물의 제어되지 않은 광이성질화를 방지하려면 멸균 캐비닛의 조명을 끄십시오.100 마이크로리터의 희석액을 100 마이크로리터의 미리 첨가된 DMEM과 함께 56 웰로 옮겨 웰 내의 화합물의 필요한 최종 농도(일반적으로 5 내지 150 마이크로몰 범위 내)에 도달합니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 DMEM을 음성 대조군 역할을 하는 4개의 웰에 추가합니다. 제어되지 않은 광 전환을 방지하기 위해 알루미늄 호일 또는 플라스틱 불투명 덮개로 플레이트를 덮으십시오.선택한 배양 시간 동안 섭씨 37도의 세포 배양 배양기에 플레이트를 놓습니다. 배양 후, 웰 당 50 마이크로 리터의 염색 용액을 플레이트에 첨가한다. 이 실험의 최종 염색 용액으로 5마이크로몰 Hoechst 33342 및 1마이크로몰 프로피듐 요오드화물을 사용합니다.섭씨 37도에서 20분 동안 다시 배양합니다. 20X 배율 대물 렌즈를 사용하여 자동 형광 이미징을 수행합니다. 이 부분에 대한 실험실 작업은 2D 실험에 대해 설명된 것과 동일합니다: 세포 배양 준비, 테스트된 화합물로 배양 및 이미징.그러나 이 경우 셀은 검은색 불투명 벽이 있는 384웰, 초저접착, U자형 바닥 플레이트에서 콤팩트하고 성숙한 스페로이드로 준비됩니다. 이 크기의 플레이트를 사용하면 한 번의 실험에서 두 화합물을 비교할 수 있습니다. 본 실험에서는 다색 염색 용액의 제3성분으로 칼세인 AM을 추가로 사용하였다.2D 및 3D 실험에서 얻은 이미지는 기기의 자동 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. Hoechst 및 프로피듐 요오드화물 염료로 염색 된 세포는 괴사 적으로 죽은 것으로 간주되며, 농도의 함수로서의 분획은 IC50 값을 계산하는 데 사용됩니다. 샘플 조사를 위한 광학 트레인을 조립합니다.레이저 광원의 광 케이블, 가변 초점 거리의 렌즈, 불투명 커버가 있는 주사기 및 평평한 절단 끝으로 구성됩니다. 모든 후속 작업은 작업장 조명이 최소화된 어두운 방에서 수행해야 합니다. 비활성 광형성 화합물이 로딩된 모델 조직 샘플을 준비합니다.전형적인 실행에서, 5 그램의 신선한 다진 돼지 고기를 킬로그램 당 50 밀리그램의 최종 농도에 도달하기 위해 화합물의 PBS 용액과 기계적으로 혼합된다. 로드된 샘플로 주사기를 채웁니다. 필요한 노출 및 광량 시간 동안 광학 트레인에 있는 샘플을 조사합니다.노출 후 피스톤으로 주사기에서 덩어리를 밀어내고 메스로 절단하여 4mm 두께의 샘플 조각을 만듭니다. 1.5밀리리터 Eppendorf 튜브에서 아세토니트릴, 물, TFA 혼합물, 70% 아세토니트릴 및 01% 트리플루오로아세트산으로 화합물을 칭량하고 추출합니다. 20XG에서 30분 동안 2회 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상층액을 수집하였다.밀폐형 형태의 570나노미터 검출 및 링 개방 형태의 270나노미터 검출에서 UV 검출 크로마토그램을 기록합니다. 세포 실험에서 원액과 유사하게 제조된 조사되지 않은 대조군 샘플과 조사된 대조군 샘플을 사용하여 특정 머무름 시간을 결정하고 방법을 보정합니다. 실험을 3회 반복하고, 조사된 조직 표면으로부터의 거리 대비 백분율 대 각 광형의 정규화된 백분율을 플롯에 플로팅한다.제로일에, 각각 체중이 약 20 그램인 C57 검정 6 마우스 성인 암컷을 오른쪽 뒷다리에 약 100 마이크로리터의 DMEM 및 매트리겔 믹스에 약 500만 개의 루이스 폐 암종 세포의 현탁액으로 피하 주사한다. 이 절차는 5% 이소플루란 진정 작용 하에 수행됩니다. 동물들은 종양이 만져지는 5 일에서 8 일 사이에 치료할 준비가되었습니다.테스트와 관련된 모든 작업은 반암석 조건에서 수행해야 합니다. 이 상태는 2 일 동안 복합 용량을 투여받은 후 동물을 치료할 때도 유지됩니다. 8 마리의 동물로 구성된 4 개의 그룹을 무작위로 조립하고 종양 부위에서 털을 제거합니다.두 대조군은 비히클의 정맥 주사를 받습니다. 20-그램 동물 당 100 마이크로리터 식염수, 및 2개의 실험 그룹의 동물들은 1 밀리리터 식염수 당 1 밀리그램의 용액 중의 불활성 광형으로 시험된 화합물을 받았다. 화합물 볼루스를 킬로당 5밀리리터로 꼬리 정맥에 투여합니다.화합물이 주입 된 후 2 시간 45 분 후, 평방 센티미터 당 100 밀리 와트의 광 출력 밀도를 사용하여 650 나노 미터 레이저로 이소 플루란 마취하에 20 분 동안 종양 부위를 조사합니다. 다음 30분 동안 동물의 상태를 주의 깊게 관찰하십시오. 매일 동물을 관찰하고 체중과 종양의 크기를 측정하십시오.종양 부피를 측정하고 괴사의 진행을 기록하십시오. 표준 절차를 사용하여 생존율을 결정하십시오. 2D 세포 배양 실험의 경우 1단계에 대한 당사의 프로토콜 결과는 LMB002와 함께 상이한 농도 및 상이한 배양 기간 동안 배양된 루이스 폐암 세포에 대한 대표 이미지에 예시된 바와 같이 이미지로 제시될 수 있다.Hoechst 및 프로피듐 요오드화물과 함께 염색하면 청색 채널에서 세포핵을 시각화하여 총 세포 수를 얻을 수 있습니다. 원형질막의 손상된 완전성을 갖는 세포가 적색 채널에서 관찰되었다. 후자가 괴사적으로 죽었다고 가정하면, 연구 중인 화합물의 명백한 세포독성은 프로피듐 요오드화물 양성 세포의 백분율로 정량화될 수 있습니다.자동화된 이미지 분석을 통해 얻은 데이터 정량화 결과가 여기에 표시됩니다. LMB002의 경우, 화합물 농도에서 프로피듐 요오드화물 양성 세포의 백분율의 S자 모이드 의존성을 볼 수 있습니다. 이 데이터에서 IC50 값을 결정할 수 있습니다.우리의 실험은 LMB002의 개방 형태가 프로토 타입 펩타이드 인 Gramicidin S보다 약 1 희석 단계 덜 독성이 있는 반면, 폐쇄 형태는 배양 시간에 따라 증가하는 3-4 희석 단계 낮은 독성을 보여줍니다. 3D 세포 실험은 동일한 유형의 원시 데이터, 단일 세포 분해 벽당 하나의 스페로이드 이미지를 생성했습니다. 세 번째 염색 염료로 칼세인을 포함하면 녹색 채널에서 관찰되는 대사 활성 세포의 분획을 정량화할 수 있습니다.2D 실험에서와 같은 선량 효과 곡선은 Z-스택 이미지 더미에서 얻었습니다. 패널 A는 이러한 곡선을 보여 주며 2D 결과를 확증합니다. 패널 B에서 볼 수 있듯이 전체 스페로이드 직경은 화합물 농도에 따라 달라집니다.2단계 실험에서는 UV 검출 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 두 광형에서 LMB002 농도를 측정할 수 있습니다. 두 광형은 머무름 시간과 흡광도에서 충분히 상이했으며, 그림의 패널 A와 B에 통합되어 표시되었습니다. 얻어진 데이터는 그림에 요약되어 있으며, 우리의 적색 광원이 조직 대리모에서 최대 1센티미터의 깊이에서 고리 폐쇄 LMB002 광변환을 유도한다는 것을 확인하며, 다진 고기는 제곱센티미터당 약 103밀리와트입니다.우리 방법론의 3단계인 생체 내 실험의 결과는 Kaplan-Meier 생존 곡선에서 시간의 함수로서 종양 성장을 보여주는 그래프로 표현되었습니다. 광전환 가능한 약물 후보를 평가하기 위해 여기에 제시된 전략은 실용적이며 디아릴에텐 유형 광전환이 있는 화합물에 적합합니다. 단계 1, 세포독성 정량화는 광조절 화합물의 라이브러리의 초기 스크리닝에 사용될 수 있다.2단계, 광스위칭 효율 평가는 설정하기 쉽고 윤리적입니다. 살아있는 동물이 필요하지 않습니다. 단계 3, 생체내 광약리학 모델에서, 치료법은 작은 동물에 적용될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

여기 우리는 그들의 성장과 전이 동안 전이성 유방암 세포에 표현 반딧불과 renilla 루시 페라 제 효소 모두의 발광 생물 반응을 구축 시각화 및 정량화 할 수있는 방법을...

생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

광역학 요법(PDT)은 폐암 치료를 위한 비침습적 비수술적 방법입니다. 광감작제는 종양 조직에 선택적으로 축적되어 산소와 적절한 파장의 빛이 있는 상태에서 종양 세포를 사멸시킵니다. 이 비디오는 종양이 있는 마우스에서 나노입자를 함유한 광감작제를 사용하여 광감작제의 광독성 가능성을 측정하기 위한 생체 내 항종양 효능 분석에 대해 설명합니다.

PDT의 생체 내 항종양 효능 분석: 종양 보유 마우스에서 광감작제의 광독성 가능성을 측정하는 기술

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

여기에보고 된 프로토콜은 수 광역 세포주의 치료 (PDT) 및 동물 모델에서 치료를 적용하기 전에 PDT 설정의 최적화의 효과의 평가.

골육종 세포의 광 역학 치료의 세포 독성 효능<em&gt; 체외</em

여기에서는 전이의 in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane(CAM) 모델과 결합된 종양 세포 대사의 실시간 모니터링을 사용하여 종양 세포를 DNA를 손상시키는 화학 요법에 감작하는 능력에 대해 새로운 항암 표적/제제를 평가하는 데 사용됩니다.

암 약물 과민 반응의 효과를 평가<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Photodynamic 치료 (PDT)는 것 적용된 photosensitizer (PS) 뒤에 보이는 빛 photoactivation apoptosis 유도 보육 관련 의료 절차입니다. 우리는 생체 외에서 PDT 프로토콜 PS 인큐베이션 및 가벼운 치료 매개 변수는 차이 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 태평양 표준시를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 제시.

Photodynamic 치료 체 외에서 접근

여기에서는 2차원 HeLa 세포 배양 및 베르테포르핀을 감광제로 사용하여 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 성공적으로 수행할 수 있는 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다.

2D 세포 배양 모델에서 Verteporfin 세포 독성을 향상시키기 위한 자체 제작 및 발광 다이오드 기반 광역학 치료 장치

여기에 제공된 프로토콜은 데이터 수집, 분석 및 해석에 중점을 두고 트리파노소마 크루지 감염의 생물 발광 모델에서 약물 효능 연구를 수행하기 위한 자세한 단계를 설명합니다. 기술적 문제를 최소화하기 위한 문제 해결 및 품질 관리 절차도 제공됩니다.

약물 효능 연구를 위한 샤가스병 마우스 모델의 In Vivo Bioluminescence 이미징 Demystifying In Vivo Bioluminescence Coaching

이 프로토콜은 LED 패널 광원과 결합된 96웰 플레이트 형식을 사용하여 항균 광역학 불활성화(aPDI)에서 잠재적인 광감작제의 효과를 평가하기 위한 간단하고 경제적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 다양한 농도, 화합물 및 박테리아 균주를 포함한 여러 실험 조건을 동시에 테스트할 수 있습니다.

박테리아 광역학 불활성화에서 광활성 분자를 평가하기 위한 LED 기반 체외 스크리닝

이 원고는 시험관 내에서 장미 벵골 매개 광역학 요법을 연구하기 위한 새롭고 혁신적인 3D 프린팅 조명 장치를 제시합니다.

장미벵골을 이용한 광역학 요법의 체외 응용을 위한 혁신적인 LED 기반 조명 장치 개발

배우세요 광전환 항암 펩타이드의 시험관 내 및 생체 내 효능 평가 방법을. 2D와 3D 세포 배양에서의 세포독성 분석, 광이성화 효율 측정, 그리고 동물 모델에서의 종양 억제 효과를 확인하는 실험 절차를 익혀보세요.

광제어 생물학적 활성 화합물의 시험관 내 및 생체 내 평가 - 암 광약리학을 위한 잠재적 약물 후보

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