Name: 바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 기관지 상피 세포 분리 및 공기-액체 계면 배양법을 통해 호흡기 건강 연구를 수행하는 방법입니다. 이 기술은 인간 폐 조직에서 PBEC를 분리하여 장기 보관 및 분화가 가능하며 질병 메커니즘과 치료 반응을 탐구하는 데 활용됩니다.

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이 기여에 설명된 모델을 사용한 연구는 Lung Foundation Netherlands, 네덜란드 보건 연구 개발 기구(ZonMw, COVID-19 MKMD 보조금), 네덜란드 동물 실험 대체 협회(Stichting Proefdiervrij, 보조금 #114025007), Boehringer Ingelheim 및 Galapagos와 같은 회사의 연구 보조금을 포함한 다양한 자금 지원 기관의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 작성되었습니다.

저자는 관련 이해 상충이 없다고 선언합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 절제된 폐 조직에서 인간 기관지 상피 세포의 분리, 분화 잠재력의 손실 없이 세포의 최적 확장을 위한 방법, 냉동 보존 절차 및 잘 분화된 ALI-PBEC 배양을 생성하는 절차를 설명합니다. 또한 품질 관리에 대한 설명과 차별화된 ALI-PBEC의 모니터링 및 평가 지침이 제공됩니다.
설명된 프로토콜은 폐암 진단과 관련된 수술을 받는 환자의 폐엽에서 절제된 거시적으로 정상적이고 종양이 없는 기관지 링으로 시작합니다. 따라서 이러한 고리는 엄격하게 건강한 조직으로 간주될 수 없으므로 세포 배양 특성에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 기관지 상피 세포를 얻기 위한 대안적인 공급원은 기관지 생검, 기관지 칫솔질, 또는 이식 기증자 또는 수용자 폐로부터의 조직을 사용하는 것을 포함한다. 출처에 관계없이 폐 조직을 사용할 때 미생물 오염 위험을 고려해야하므로 세포 배양의 미생물 오염 위험을 줄이기 위해 다른 배양 배지에서 항생제를 사용합니다. 특히, 마이코플라스마는 세포 배양에 미치는 다양한 영향, 세포 배양에 일반적으로 사용되는 항생제에 대한 내성, 마이코플라스마 오염은 마이코플라스마 검출 분석에 의해서만 확인할 수 있기 때문에 세포 배양에서 높고 흔한 위험입니다. 따라서 폐 조직에서 세포를 분리 한 후 세포 배양의 초기 단계에서 광범위한 항균 제제 인 Primocin을 사용하고 배양 과정에서 무작위로 선택된 샘플을 마이코 플라스마의 존재 여부를 테스트합니다.
기관지 고리로 시작하는 분리 절차는 분화 능력을 손상시키지 않으면서 ALI에서 배양을 시작하는 데 필요한 이러한 일차 세포의 확장 정도를 허용하기에 충분한 출발 물질을 제공합니다. 그러나, 제한된 수의 세포로 분리된 상피 세포의 확장을 시작하면 ALI 배양을 위해 시딩될 수 있는 충분한 수의 세포와 함께 충분한 수의 삽입물을 얻는 데 문제가 발생할 수 있습니다. 일차 세포의 연장된 배양 및 반복적인 계대배양은 복제 노화를 초래할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 해결책이 제안되었습니다. Horani 등은 Rho 키나제 억제제(ROCK) Y-27632가 기저 세포의 증식을 증가시킨다는 것을 보여주었고30, Mou 등은 분화된 상피 세포층(31)의 특성을 유지하면서 기저 줄기 세포를 확장하기 위해 이중 Smad 억제를 사용했으며, Sachs 등은 기도 상피 세포를 확장하고 여러 계대 동안 분화 가능성을 유지하는 데 사용할 수 있는 기도 오가노이드 시스템을 개발했습니다32. 후자의 방법은 또한 여기에 설명된 바와 같이 ALI 배양으로 옮기기 전에 조산아(임신 28주령)의 기관 흡인물&lt;(TA) 및 기관지폐포 세척액(BAL)과 같이 세포 수가 매우 낮은 공급원에서 세포를 확장하는 데 사용되었습니다(33). 기관지 폐 화합물 및 TA로부터 분리된 세포는 기관지 조직에서 생성된 세포와 유사한 분화 능력을 보였지만, Notch 신호 전달 억제 또는 Th2 사이토카인 IL-13을 사용하여 분화가 더 섬모 또는 더 많은 잔 함유 배양으로 편향되었을 때 차이가 관찰되었다33. 따라서 유사한 접근법을 사용하여 상피 세포 수가 낮은 출발 물질에서 ALI-PBEC를 배양하는 경우 프로토콜의 섹션 6에서 논의된 대로 항상 기본 품질 기준에 대한 배양을 확인하는 것이 좋습니다. 중요하게도, 영양 세포의 사용은 또한 더 큰 세포 수를 얻는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 시간과 세포 수가 필수적인 이식 가능한 스캐폴드 엔지니어링 환경에서 필수적입니다. 이것은 기관 질환 환자로부터 유래한 생검에서 자가 상피 세포를 배양하고 쥐 배아 영양층(유사분열적으로 비활성화된 3T3-J2 섬유아세포)과 위에서 언급한 Rho/ROCK 경로의 억제제(Y-27632)34. 생성된 세포 배양은 기관 스캐폴드의 재증식에 유용한 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이것은 이식 모델에 적합한 프로토콜로 볼 수 있습니다.
이 기여에 설명된 프로토콜을 사용할 때뿐만 아니라 다른 배양 프로토콜을 사용할 때도 필연적으로 선택 편향이 도입됩니다. 배양을 개시하는 데 사용되는 세포의 기원, 배지 조성 및 기타 프로토콜 세부사항과 같은 프로토콜 세부사항의 차이는 배양의 세포 구성의 변화로 이어질 수 있으며, 이에 따라 ALI 배양의 반응이 변화할 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다33,35. 또한, 기도 세포를 분화시키기 위한 상이한 배지를 비교할 때 세포 특성의 차이가 또한 관찰되었다10,11. PneumaCult와 cBD 배지를 비교했을 때, 배상 세포와 클럽 세포 mRNA 마커, TEER 값 및 세포층 두께에서 차이가 관찰되었습니다. 이러한 관찰을 바탕으로 통계적 토대가 부족함에도 불구하고 사용된 기증자 수가 적고 배지 구성이 고객에게 알려지지 않았으며 PneumaCult 배지의 비용이 높기 때문에 우리 실험실에서 cBD 배지를 사용하기로 결정했습니다.
앞서 살펴본 바와 같이, 세포는 오가노이드 배양을 사용하여 초기에 확장될 수 있으며, 이후 2D ALI 삽입 시스템으로 옮겨질 수 있습니다. 기도 상피 오가노이드는 공기 중 물질에 노출되기에 적합하지 않은 반면, ALI 2D 시스템을 사용하면 담배 연기23,36과 같은 공기 중 물질이 배양된 기도 상피 세포에 미치는 영향을 평가할 수 있기 때문에 이는 중요합니다. ALI 기도 상피 세포 배양을 확립하기 위한 다른 접근 방식은 인간 만능 줄기 세포(hiPSC)의 분화에 의해 기도 상피 세포를 생성하는 것입니다37. 이러한 프로토콜에서, 근위 기도 전구체로 분화한 후 분화 프로토콜의 최종 단계에서, 세포는 여기에 기술된 것과 유사한 절차를 사용하여 ALI로의 배양에 의해 분화될 수 있다.
현재 프로토콜에서 cBD 배지는 ALI에서 배양에 사용됩니다. cBD 배지는 Fulcher et al.38 및 기타 연구에서 영감을 받은 다양한 보충제를 혼합하여 제조한 무혈청 배지입니다. 보충 용액에는 52μg/mL 소 뇌하수체 추출물(BPE), 0.5μg/mL 하이드로코르티손, 0.5ng/mL 인간 EGF, 0.5μg/mL 에피네프린, 10μg/mL 트랜스페린, 5μg/mL 인슐린, 6.5ng/mL 트리요오드티로닌 및 0.1ng/mL RA39가 포함되어 있습니다. BPE는 조직 추출물이고 배치별 변형을 거치기 때문에 배지는 완전히 정의된 배지로 간주될 수 없으며 동물이 없는 것도 아닙니다. 완전히 규정되어 있는 세포 배양 배지는 배치 간 차이를 최소화하는 것이 바람직하다. 동물성 없는 연구로의 전환을 고려할 때, 동물성 제품을 포함하지 않고 과학계에 적합한 정의된 배지를 생산하기 위한 노력이 중요합니다.
연구 질문에 따라 ALI 모델을 기반으로 다양한 실험 설정을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 분화 과정에 영향을 미칠 수 있는 화합물의 영향을 조사하기 위해 수중 배양의 여러 단계, 분화 중 또는 잘 분화된 단계에서 배양에 화합물을 추가하여 이 문제를 해결할 수 있습니다. ALI-PBEC 배양의 세포 조성은 특정 화합물을 첨가함으로써 영향을 받을 수 있습니다. 예를 들어, IL-13의 존재 하에서 ALI-PBEC를 분화하면 더 많은 배상 세포와 더 적은 섬모 세포로 배양되는 반면, 분화 동안 γ-세크레타제 억제제 DAPT(Notch 신호 전달을 차단하는 데 사용됨)로 처리하면 배 세포를 희생시키면서 더 많은 섬모 세포로 배양됩니다(23,40,41,42).
또한, 세포를 자극하거나 특정 과정을 차단하는 제제는 기저 구획에 또는 (매우 작은 부피로) 배양의 정점 구획에 적용될 수 있습니다. 세포는 또한 정점 쪽에서 공기 중 물질에 노출될 수 있습니다. 이러한 노출 설계는 PBEC 23,43,44에 대한 디젤 배기 가스 또는 전체 담배 연기의 영향을 연구하는 데 사용되었습니다. 배지는 기저부에서 분비된 단백질을 모니터링하기 위해 배지가 변경될 때마다 수확할 수 있습니다. 기저 배지를 상쾌하게 하는 동안 PBS로 세척되는 세포의 정점 측면에도 동일하게 적용됩니다. 소위 정점 세척을 수확하고 선택적 디티오에리트리톨(DTE)을 첨가하여 배 세포에서 생성되는 점액을 보다 효율적으로 해리합니다. 세포 용해물은 총 단백질, RNA, 염색체 및 미토콘드리아 DNA의 분리를 위해 얻을 수 있습니다. 플라스틱 삽입물로부터 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막을 절단하고 다중 면역형광 염색을 위해 이 막을 더 작은 조각으로 추가로 절단함으로써 특정 마커에 대한 항체를 사용하여 세포를 추가로 연구할 수 있다45. 또한, 유세포 분석 또는 FACS는 삽입물에서 세포의 트립신 처리 후에 사용될 수도 있습니다. ALI 단계에서 전기 저항을 측정하고 이후에 TEER을 계산하여 세포 장벽의 발달을 모니터링할 수 있으며, 여기서 전기 저항은 멤브레인 삽입물의 표면적에 반비례합니다. 계산은 다음 공식을 사용하는 옴의 법칙을 기반으로 합니다: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65102/65102eq01.jpg" style="margin: auto;">여기서 Rm은 측정된 전기 저항이고, Rb는 코팅 및 셀이 없는 삽입물의 기준선 전기 저항이고, SA는 삽입물의 멤브레인의 표면적입니다. EVOM2 및 STX/젓가락 전극을 사용하여 전기 저항을 측정하는 것은 간단하지만 웰에 도입할 때 취급 절차에 크게 의존합니다. 또한, 전극의 형상은 상대적으로 넓은 표면적(17)의 배리어 기능의 측정에 영향을 미치는 것으로 제안되었다.
정확한 조직 표현을 증가시키는 것을 목표로 하는 ALI 세포 배양 시스템의 추가 개선에는 백혈구, 섬유아세포 또는 내피 세포와 같은 추가 세포 유형의 공동 배양이 포함됩니다46,47,48. ALI-PBEC와 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 M-CSF 분화 대식세포의 공동 배양이 선천성 상피 반응 및 복구에 현저한 영향을 미치는 것으로 관찰되었습니다48. 이러한 공동 배양 모델에서는 배지 호환성이 문제가 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 기도 상피 세포 배양에 사용되는 배지는 PBEC용으로 특별히 개발되었으며 다른 세포 유형에는 최적으로 적합하지 않을 수 있으므로 최적화가 필요합니다. 분리된 PBEC가 사용될 수 있는 기도 생물학 분야에서 볼 수 있는 또 다른 유형의 발전은 OoC(Organs-on-Chips) 기술49,50의 사용이다. 이 기술을 사용하여 스트레칭, 공기 및 중간 흐름과 같은 호흡 및 혈류의 기계적 힘의 영향을 연구 할 수 있습니다 29.
다양한 기증자의 PBEC를 사용할 때 기증자 간 가변성은 중요할 수 있으므로 상피 세포 배양 연구에서 이러한 가변성을 설명하기 위해 여러 기증자의 세포를 사용하는 것을 고려하는 것이 중요합니다. ALI-PBEC의 배양은 시간이 많이 걸리고 상당한 비용이 들기 때문에 하나의 세포 배양 삽입물에서 서로 다른 기증자의 세포를 혼합하여 ALI-PBEC 배양을 확립하는 옵션을 검토합니다. 이러한 방식으로 파일럿 실험은 다양한 개별 기증자로부터 파생된 배양물의 반응을 분석하기 전에 일차 세포를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 또한 탐색적 연구를 위해 다양한 특성(예: 연령 범주 또는 성별)을 가진 기증자를 그룹화할 수 있습니다. 기증자 혼합물을 사용할 때 더 높은 증식률로 인해 한 기증자가 결과를 지배할 가능성을 방지하기 위해 서로 다른 기증자의 동일한 세포 수가 존재하는지 확인하는 것이 중요합니다. 따라서 개별 공여자의 세포는 개별적으로 확장되고 개별 기증자의 파종 세포에 비해 삽입물에서 더 높은 밀도로 시딩되어 ALI로 전환되기 전에 삽입물에서 증식을 최소화합니다. SARS-CoV-2의 감염 동역학을 연구하여 기증자 믹스와 해당 개별 기증자의 반응을 비교했습니다. RT-qPCR 및 면역형광 염색을 사용하여, 생성된 유사한 수의 바이러스 입자와 유사한 수의 감염된 세포를 보여줌으로써 공여체 혼합물이 다양한 개별 기증자를 잘 나타내는 것으로 관찰되었다28.
동물 모델에 대한 수용 가능한 대안이 되려면 배양된 기관지 상피 세포의 유전자 편집이 가능해야 합니다51. 그러나 ALI-PBEC에서 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용하는 RNA 간섭 기술이 검토되지만, 배양의 잠수 단계에서 세포가 siRNA로 형질감염되어야 하기 때문에 배양 중에 siRNA 형질감염이 자주 반복되지 않는 한 배양 기간이 길기 때문에 ALI 배양 중에 녹다운이 충분히 유지되지 않습니다52. 그럼에도 불구하고, siRNA는 물에 잠긴 기저 세포에서 유전자 발현을 변형시키는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 다른 연구자들은 CRISPR/Cas9 기술을 성공적으로 사용하여 리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP) 전달을 통한 1차 ALI 기도 상피 세포 배양에서 유전자 편집을 달성했다 53. 이러한 기술을 사용할 때 세포가 완전한 분화 능력을 유지하는 것이 필수적입니다. 1차 기도 세포 배양은 무한정 계대배양할 수 없기 때문에 유전자 편집 세포의 클론 확장이 쉽지 않고 형질주입된 세포를 선택하기 위한 배지 추가가 번거롭다. 따라서, 모든 배양된 세포에서 바람직한 녹다운을 달성하는 것은 어렵다. 녹아웃 클론을 생성하는 대안은hiPSCs(54 )에서 녹아웃 전략을 사용하고 이들 세포를 사용하여 기도 상피 세포를 생성하는 것이다. 차선책이기는 하지만 또 다른 대안은 유전자 편집 세포를 클론적으로 확장하기 위해 불멸화된 PBEC 라인을 구축하는것입니다(55).
여기에 제시된 프로토콜은 잘 차별화된 pseudostratified ALI-PBEC를 생성하는 한 가지 방법이지만, 제시된 프로토콜에 비해 점점 더 큰 차이로 이러한 문화를 확립하는 다른 프로토콜도 발견되었습니다. 실험실 전반에 걸쳐 배양 방법에 대한 검증과 엄격한 품질 관리가 ALI-PBEC 시스템 및 기도 상피 세포의 유사한 배양 시스템이 동물 실험의 유효한 대안이 되기 위해서는 필수적입니다.

다양한 급성 및 만성 폐 질환에서 기도 상피의 역할은 다양한 문헌고찰 1,2,3,4,5,6,7에 기재되어 있다. 기도 상피 세포의 잘 분화된 배양은 기도 상피의 역할을 밝히는 중요한 도구입니다. 공기-액체 계면(ALI) 기도 상피 세포 배양은 기도 기저 상피 세포의 분화를 촉진하고 이를 통해 시험관 내에서 기도 상피를 안정적으로 연구하기 위해 광범위하게 적용됩니다 8,9. 지난 몇 년 동안 COVID-19 대유행과 관련된 새로운 연구 이니셔티브와 전 세계적으로 동물 없는 연구로의 전환의 결과로 이러한 모델의 사용이 더욱 증가했습니다. 따라서 이 모델 세포주의 사용 증가는 강력한 결과를 얻기 위해 절차와 경험을 공유해야 할 필요성을 강조합니다. 이것은 또한 연구 그룹 간의 결과 비교를 가능하게 할 것입니다. 절차의 견고성은 핵심 특성이므로 품질 관리를 받아야 합니다. 여러 실험실에서 ALI에서 일차기도 상피 세포를 배양하기 위한 프로토콜 개발에 투자했습니다. 이러한 절차를 자세히 공유하면 시간, 노력 및 필요한 예산을 줄일 수 있습니다. 이러한 세부사항은, 예를 들어, 다양한 제조업자에 의해 제공된 세포 배양 플라스틱 및 배지의 선택을 포함하는데, 이는 이것이 얻어진 배양물의 특성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌기 때문이다10,11,12. 이는 배양 절차의 경험과 세부 사항을 공유하는 것의 중요성을 강조하는데, 그러한 통찰력이 없으면 결과에 영향을 미치거나 다양한 실험실에서 검증 노력이 방해를 받을 수 있기 때문입니다.
인간 폐 상피는 기저 세포, 섬모 세포, 배 세포 및 클럽 세포와 같은 주요 유형을 포함하여 다양한 세포 유형을 포함합니다. 시험관 내 기도에서 상피 세포층을 신뢰성 있게 모방하기 위해서는 이러한 세포 유형이 배양 모델에서 표현되어야 하며 이들의 분극과 기능이 유지되어야 합니다13,14,15,16. 기증자 특성(질병 상태 포함)과 세포의 해부학적 기원(즉, 비강, 기관, 대기도 및 소기도)이 세포 배양의 세포 구성 및 기능적 반응에 영향을 미칠 수 있다는 인식은 똑같이 중요합니다. 관련 전문 지식과 실습은 일차성 기도 상피 세포를 성공적으로 배양하고 직관적으로(배양 중 육안 검사에 의해) 배양 품질을 정량적으로 평가하기 위한 전제 조건입니다. 이 기여의 목적은 기관 및 소기도 상피 세포의 배양에도 적용할 수 있는 일차 인간 기관지 상피 세포(PBEC)의 분리 및 배양을 위한 비용 및 시간 효율적인 방법을 제공하는 것입니다. 절제된 폐 조직에서 이러한 세포를 분리하는 방법을 설명하는 것 외에도 확장 및 바이오뱅킹 방법, 그리고 마지막으로 합리적인 비용과 기간 내에 잘 분화된 ALI 배양의 확립 및 특성화를 위한 방법을 제시하고 논의합니다.

<table><tbody><tr><td>1,000 옴 테스트 저항기</td><td>World Precision Instruments</td><td>N / A</td><td>EVOM2 상피 전압 저항계를 교정하는 데 사용</td></tr><tr><td>4- [2- (5,6,7,8-테트라 하이드로 -5,5,8,8-테트라 메틸 -2- 나프탈레닐) 에티닐) - 벤조산 (EC 23)</td> <td>Tocris</td><td>4011</td><td>cBD 매체</td></tr><tr><td>6-웰 투명 TC 처리 다중 웰 플레이트</td>에 사용 <td>Corning</td><td>3506</td><td>첫 번째 단계에서 기관지에서 분리 된 세포를 성장시키는 데 사용됩니다. 반지&nbsp;</td></tr><tr><td>기도 상피 세포 성장 매체 키트</td><td>PromoCell</td><td>C-21160</td><td>cBD 매체와 비교하는 데 사용</td></tr><tr><td>Bead Bath 20 Liter</td><td>Lab Armor</td><td>74220-720</td><td>세포 배양 용액을 예열하는 데 사용</td></tr><tr><td>BEGM 기관지 상피 세포 성장 매체 BulletKit</td><td>LONZA</td><td>CC-3170</td><td>cBD 매체</td></tr><tr><td>소 알부민 분획 V (BSA)</td>와 비교하는 데 사용됨<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260037</td><td>코팅 용액에 사용</td></tr><tr><td>소 뇌하수체 추출물 (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 37000-015</td><td>c-KSFM</td></tr><tr><td>기관지 상피 세포 성장 보충제 (BEpiCGS)</td>에 사용<td>ScienCell Research Laboratories</td><td>3262</td><td>cBD 매체에 사용</td></tr> 기관<tr><td>지 상피 세포 매체 기저 세포 (BEpiCM-b)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC3211-b</td><td>cBD 배지</td></tr><tr><td>에 사용세포 배양 삽입물; 12mm 트랜스웰(0.4 및 마이크로); m 숨구멍 폴리 에스테르 멤브레인 인서트</td><td>Corning</td><td>3460</td><td>프로토콜 세포 배양 인서트에 사용되는 세포 배</td></tr><tr><td>양 인서트; 12 웰 인서트, 0.4 &마이크로; m</td><td>SABEU에서 만든 PET 투명 CellQART</td><td></td><td>9310412 코닝 세포 배양 삽입물과 비교하는 데 사용되는 세포 배양 삽입</td></tr>물 <tr><td>세포 배양 삽입물; 12-well ThinCert Tissue Culture Inserts</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-032</td><td>세포 배양 삽입물은 Corning 세포 배양 삽입물과 비교하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td>셀 수를 확장하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>CFX Maestro 1.0</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>CFX384 시스템으로 생성된 qPCR 데이터 분석을 위한 소프트웨어 프로그램</td></tr><tr><td>CFX384 Touch Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855484</td><td>qPCR 검출 시스템</td></tr><tr><td>젓가락 전극 세트</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX2</td> ALI-PBEC CO2-Incubator PHCbi<td>에서 전기 저항을 측정하는 데 사용됨</td></tr><tr><td></td><td></td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td>마이프플라스마 프리 세포 배양에 사용되는 세포 배양 인큐베이터</td></tr><tr><td>CO2-Incubator</td><td>Hereaus</td><td>Heracell 150</td><td>마이프플라즈마 감염 가능성이 있는 세포 배양에 사용되는 세포 배양 인큐베이터</td></tr><tr><td>Coolcell Container</td><td>Corning</td><td>432006</td><td>-80°C에서 세포를 동결 보존하는 데 사용됩니다. C 액체로 옮기기 전 N2</td></tr><tr><td>Countess 3 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>세포 계수 및 세포 농도 측정에 사용</td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Nalgene</td><td>479-3224</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Avantor VWR BDH CHEMICALS</td><td>101174Y</td><td>에서 세포 동결 보존에 사용 소프트 트립신</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Avantor에 사용 VWR</td><td>0231</td><td>세포 동결 매체</td></tr><tr><td>dNTP (10 mM)</td><td>에 사용 Promega</td><td>U1515</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>Dulbecco의 DMEM (Modified Eagle's Medium) + 4500 mg/l D-Glucose</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36250</td><td>cBD 매체</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l 포도당과 l-글루타민</td><td>LONZA</td><td>LOBE12-604F</td><td>다른 제조업체의 DMEM과 비교하기 위해 cBD 매체에 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagle's Medium (DMEM), 고포도당, 피루브산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966029</td><td>다른 제조업체의 DMEM과 비교하기 위해 cBD 매체에 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>표피 성장 인자 (EGF)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>c-KSFM</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Avantor VWR BDH chemicals</td><td>443885J</td><td>소프트 트립신</td></tr><tr><td>EVOM2 상피 전압계</td>에 사용 <td>World Precision Instruments</td><td>91799</td> ALI-PBEC 피브로넥틴 용액<td>에서 전기 저항을 측정하기 위해 젓가락 전극 세트와 함께 사용</td></tr><tr><td>, 인간&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-43060</td><td>코팅 용액에 사용</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>cBD 매체</td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt 용액 (HBSS)</td>에 사용 <td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0313</td><td>프로테아제 XIV를 용해하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>IQ SYBR Green Super mix</td><td>Bio-Rad</td><td>170887</td><td>qPCR 시약</td></tr><tr><td>Isoproterenol hydrochloride, (-)-</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6504</td><td>c-KSFM</td></tr><tr><td>Keratinocyte-SFM (KSFM)</td><td>에 사용 Thermo Fisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>c-KSFM</td></tr><tr><td>Maxwell RSC Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td>자동 RNA 분리 시스템</td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td>Maxwell RSC Instrument</td></tr><tr><td>M-MLV 역전사 효소</td>로 총 RNA를 분리하는 데 사용 <td>Promega</td><td>M5301</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>M-MLV 역전사 효소 합성에 사용 5X 반응 완충액</td><td>Promega</td><td>M531A</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>MycoStrip</td><td>InvivoGen</td><td>rep-mys-10</td> 합성에 사용 <td>세포 배양 샘플에서 마이코플라스마의 존재를 검출하는 데 사용</td></tr><tr><td>N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 설폰산(HEPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td>cBD 배지</td></tr><tr><td>올리고(dT)15</td><td>Qiagen</td><td>79237</td><td>합성에 사용</td></tr><tr><td>cDNA 페니실린/스트렙토마이신 용액(Pen/Strep)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>SCC0513</td><td>c-KSFM 및 cBD 배지</td></tr><tr><td>인산염 완충에서 항생제로 사용 식염수(PBS)</td><td>LUMC pharmacy</td><td>N/A</td> 프로토콜 <td></td></tr><tr><td>Pneumacult-ALI Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05002</td>의 여러 단계에서 사용 <td>cBD 배지</td></tr><tr><td>Pneumacult-Ex Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05040</td>과 비교하기 위해 분화 단계에서 세포를 성장시키는 데 사용 cBD 배지 프라이머, ATP5B, 전방 통합 DNA<td>와 비교하기 위해 침수 단계에서 세포를 성장시키는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td> 기술</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: TCACCCAGGCTGGTTCAGA</td></tr><tr><td>Primer, ATP5B, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: GGAGGGGACGTAAATCCCTA</td></tr><tr><td>Primer, FOXJ1, 역</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC</td></tr><tr><td>프라이머, MUC5AC, 순방향</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 서열: CCTTCGACGGACAGAGCTAC</td></tr><tr><td>프라이머, MUC5AC, 역방향</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 서열: TCTCGGTGACAACACGAAAG</td></tr><tr><td>프라이머, MUC5B, 순방향</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 서열: GGGCTTTGACAAGAGAGT</td></tr><tr><td>프라이머, MUC5B, 역</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 서열: AGGATGGTCGTGTTGATGCG</td></tr><tr><td>프라이머, RPL13A, 전방</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG</td></tr><tr><td>프라이머, RPL13A, 역</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC</td></tr><tr><td>프라이머, SCGB1A1, 전방</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC</td></tr><tr><td>Primer, SCGB1A1, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA</td></tr><tr><td>Primer, TP63, forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: CCACCTGGACGTATTCCACTG</td></tr><tr><td>Primer, TP63, reverse</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>뉴클레오티드 염기서열: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>c-KSFM 배지에서 박테리아, 마이코플라스마 및 곰팡이에 대한 항균제로 사용</td></tr><tr><td>Protease XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>기관지</td></tr><tr><td>고리 RNAsin 재조합 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Promega</td><td>N2515</td>의 효소 처리에 사용 <td>cDNA</td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제( SBTI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td>소프트 트립신</td></tr><tr><td>T100 열 순환기</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>cDNA Tissue의 합성에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. SAFE 플러스</td><td>MILESTONE MEDICAL</td><td>N/A</td><td>생물학적 표본용 진공 전송 시스템</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>살아있는 세포와 죽은 세포를 세는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin 1:250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250-018</td><td>소프트 트립신</td></tr><tr><td>I형 콜라겐 용액(PureCol)</td>에 사용됨Advanced <td>BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>코팅 용액에 사용됨</td></tr><tr><td>범용 용기, PP, PE 나사 캡 포함</td><td>Avantor VWR</td><td>216-2053</td><td>기관지 고리의 Protease XIV 치료를 위한 프로토콜에 사용됨</td></tr></tbody></table>

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

기도 상피 세포층은 폐 조직과 외부 환경 사이의 첫 번째 장벽을 형성하여 감염원 및 대기 오염 물질을 포함한 흡입 물질에 지속적으로 노출됩니다. 기도 상피층은 매우 다양한 급성 및 만성 폐 질환에서 중심적인 역할을 하며, 이 상피를 표적으로 하는 다양한 치료법이 흡입에 의해 투여됩니다. 병인에서 상피의 역할과 상피가 치료를 위해 표적이 될 수 있는 방법을 이해하려면 강력하고 대표적인 모델이 필요합니다. 체외 상피 배양 모델이 점점 더 많이 사용되고 있으며 통제된 환경에서 실험을 수행하여 세포를 다양한 종류의 자극, 독성 물질 또는 감염원에 노출시키는 이점을 제공합니다. 불멸화 또는 종양 세포주 대신에 일차 세포를 사용하는 것은 이들 세포가 세포주에 비해 상피의 더 나은 표현을 갖는 가성층화된 분극 상피 세포층으로 배양에서 분화된다는 이점을 갖는다.
여기에 제시된 것은 폐 조직에서 기도 상피 세포의 분리 및 배양을 위해 지난 수십 년 동안 최적화된 강력한 프로토콜입니다. 이 절차는 공기-액체 계면(ALI)에서 배양하여 원발성 기관지 상피 세포(PBEC)의 성공적인 분리, 확장, 배양 및 점막섬모 분화를 가능하게 하며 바이오뱅킹을 위한 프로토콜을 포함합니다. 또한, 세포 특이적 마커 유전자를 사용한 이러한 배양물의 특성화가 설명됩니다. 이러한 ALI-PBEC 배양은 전체 담배 연기 또는 염증 매개체에 대한 노출, 바이러스 또는 박테리아와의 공동 배양/감염을 포함한 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 
절차를 단계별로 설명하는 이 원고에 제공된 프로토콜은 실험실에서 이러한 배양 시스템을 구현하거나 적용하는 데 관심이 있는 사람들에게 기초 및/또는 참고 자료를 제공할 것으로 기대됩니다.

수중 문화를 이용한 확장 여기에 제시된 방법을 사용하면 액체 질소에 장기간 보관하기 위해 하나의 6웰 플레이트에서 400,000개의 세포/극저온 세포를 가진 평균 8개의 극저온 난을 얻을 수 있습니다(그림 2A). 이를 달성하기 위해 분리된 PBEC는 미생물(특히 마이코플라스마) 오염을 배제하기 위해 Primocin이 있는 상태에서 최소 7일에서 최대 14일 동안 6웰 플레이트에서 배양됩니다(그림 2B). 그림 2A, B는 다양한 기증자로부터 분리된 다양한 세포 수 및 필요한 배양 시간에 대한 통찰력을 제공합니다. 액체 질소에 저장하기 위해 트립신 처리로 세포를 수확하기 전에 밀도가 80% 이상이어야 합니다. 이것이 14일 이내에 달성되지 않으면 세포를 냉동 보존해서는 안 됩니다. 중요한 것은 저장 및 계대배양을 위해 수확할 때 세포층의 밀도가 ~95%를 초과해서는 안 된다는 것입니다(그림 2C). 액체 질소에 보관한 후 ALI 배양을 위한 충분한 세포 수를 얻을 때까지 세포를 해동하고 팽창을 위해 배양할 수 있습니다. 이 단계에서 세포의 확장에 사용되는 배지는 c-KSFM이며, 기관지 고리로부터 수확 후 초기 배양 동안과 유사하다(18). 그러나 폐 조직에서 발생하는 추가 미생물 오염의 위험이 없기 때문에 이 단계에서는 Primocin이 필요하지 않으므로 Primocin을 페니실린/스트렙토마이신으로 변경할 수 있습니다. 이 배지는 섬유아세포보다 상피 세포를 선호하므로 더 빠른 증식 섬유아세포에 의한 배양물의 과증식 가능성을 방지한다 19,20,21. c-KSFM 배지를 사용하면 세포가 플라스크에 퍼지고 서로 연결되지 않는데, 이는 이 단계에서 cBD 배지에 담근 배양 세포의 형태와 현저히 다릅니다(그림 2D, E). T75 플라스크에서 해동된 세포를 5일 또는 6일 동안 배양한 후 세포층은 80%-95% 융합되어야 하며, 이는 총 약 3 x 106개 세포로 변환됩니다(그림 2F). 이를 통해 ALI 배양을 위해 약 75개의 인서트(12웰 플레이트 크기)를 생성할 수 있습니다.
이러한 기여에 기술된 분리 및 배양 방법은 또한 기관지 생검 또는 기관지 브러쉬를 출발 물질로 사용하기 위해 적응시킬 수 있다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig02.jpg"> 그림 2: 냉동보존 전후의 기저 세포 확장. 세포를 기재된 프로토콜에 따라 단리하고, c-KSFM을 사용하여 배양하였다. 공여자 당 생성된 세포의 수를 모니터링하였고, 살아있는 세포 계수는 6-웰 플레이트로부터 계대 0 (P0) 세포를 수확할 때 자동화된 세포 계수기 (A)를 사용하여 수행하였고 (프로토콜의 단계 2), n=123 공여자, 세포 계수는 웰 당 수확된 세포의 수로서 제시하였고; 각 점은 한 명의 기증자를 나타내고 중앙값은 가로 막대로 표시됩니다. (B) 품질 관리의 일환으로, P0 세포가 6-웰 플레이트에서 80% 내지 90% 컨플루언스에 도달하는 데 필요한 시간을 모니터링하고, c-KSFM (n=127명의 상이한 공여자)에서 침중 배양을 시작한 후 일수로 표시하였다. 각 개별 기증자는 점으로 표시되며 1일에 속하는 모든 점은 선으로 합쳐집니다. 선이 넓을수록 더 많은 기증자를 의미합니다. 세포가 배양되는 평균 일수는 더 얇은 가로 막대로 표시됩니다. (C) 장기 냉동보존을 위해 세포를 수확한 순간 c-KSFM에 잠겨 성장한 P0 세포의 대표적인 명시야 이미지. (D) cBD 배지에 잠겨 성장한 세포를 수확하여 이식한 후 c-KSFM에 잠겨 성장한 P1 세포의 대표적인 명시야 이미지 및 (E) P1 세포를 삽입하여 옮겼다. (f) T75 플라스크로부터 P1 세포를 수확할 때 자동 세포 계수기를 사용하여 공여체당 생성된 살아있는 세포의 수를 모니터링하였고(프로토콜의 섹션 4), n = 63명의 상이한 공여자; 세포 수는 T75 플라스크당 세포 수로 표시되고, 각 기증자는 점으로 표시되며, 중앙값 세포 수는 가로 막대로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
공기-액체 인터페이스(ALI) 배양 ALI 배양 시작 후 7 일에 세포층의 전기 저항이 측정되고 300 Ω 이상이어야합니다 (그림 3A). 이것이 달성되지 않으면, 문화는 단단한 접합 형성의 부족 가능성 때문에 실패한 것으로 간주됩니다. 예를 들어, 세척 및 흡인 중 세포층 손상으로 인한 개별 삽입물의 상피층 손상으로 인해 낮은 TEER 값을 얻을 가능성을 배제하는 것이 좋습니다. 이것은 배양 삽입물의 육안 현미경 검사로 확인할 수 있습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 전기 저항의 공여체 간 가변성은 중요할 수 있으며(그림 3B), 이는 문헌14에도 보고되어 있으며, 관찰된 바와 같이 사용된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)의 기원에 의해서도 현저한 영향을 받습니다(그림 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig03.jpg"> 그림 3: ALI-PBEC 배양의 품질 관리로서의 경상피 전기 저항. PBEC는 분리 및 확장되었으며 잘 분화된 ALI-PBEC 배양이 확립되었습니다. 배양 중 여러 시점에서 전기 저항을 측정한 후 TEER을 계산했습니다(Ω·cm2). (A) 전기 저항은 ALI 후 14일 동안 측정되었습니다. n = 4명의 다른 기증자. 데이터는 표준 편차(SD)± 평균값으로 표시됩니다. (B) ALI-PBEC 세포 배양 품질 관리의 일환으로, ALI 후 7일(n=50) 및 14일(n=25)에 전기 저항을 측정했습니다. 각 점은 하나의 기증자를 나타내고 중앙값 TEER(Ω·cm2)은 가로 막대로 표시됩니다. 데이터는 비모수 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 유의성을 테스트했으며 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다. (C) TEER 형성에 미치는 영향을 평가하기 위해 3개의 다른 DMEM 공급업체의 매체를 테스트했습니다. n = 4명의 다른 기증자; 평균값은 SD± 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
잘 분화된 ALI-PBEC 배양을 확립하면서 공기 노출 시작부터 RA의 농도가 증가합니다22. 이러한 방식으로 세포는 증식에서 점액섬모 분화로 전환되며, 이는 명시야 현미경을 사용하여 공기 노출 후 빠르면 9일(기증자 의존적)에 볼 수 있습니다. 첫 번째 섬모의 이동은 이 시점에서 볼 수 있으며, 분화된 내강 세포의 마커의 유전자 발현에 기초할 때 다소 더 일찍 볼 수 있다(도 23 )(도 4).
프로토콜에 기재된 바와 같이, 점액 생성은 또한 배지 변화 동안 정점 표면을 헹굴 때 관찰될 수 있다. RA는 빛에 매우 민감하며, 이는 동일한 스톡 농도에서 매우 가변적인 활성을 유도합니다. 이러한 이유로, RA는 합성 RA 유사체 EC 23으로 대체되고 동일한 농도로 사용되며, 실험적으로 결정된 것과 유사한 결과를 갖는다. 이러한 이유로 그리고 절차의 변경을 피하기 위해, 선택된 EC 23 농도는 이전에 사용된 RA 농도24,25(즉, 50 nM)와 동일하게 유지되었다(도 5). 도 5A는 상이한 농도의 EC 23을 사용할 때 달성된 TEER 값을 도시하며, 시험된 이 농도 범위 내에서 50 nM에서의 최대 TEER을 나타낸다. 도 5B에 나타낸 결과는 50 nM EC23 또는 RA를 사용하였을 때 섬모 및 잔 세포에 대한 마커의 유전자 발현이 유사함을 확인하였다. EC 23은 수중 단계에서 배양하는 동안에도 필요한데(농도는 훨씬 낮지만), 이 수중 단계에서 생략하고 ALI 단계에서만 추가하면 배양이 완전한 합류도에 도달하지 못하기 때문입니다. 섬모 박동 활성과 점액 생성이 가시적인 잘 분화된 ALI-PBEC 배양을 생성하는 데 필요한 시간은 약 14일이므로 대부분의 실험은 14-21일 ALI 배양 사이에 시작됩니다(그림 4). 모든 주요 세포 유형(기저세포, 섬모세포, 잔세포, 곤봉세포)은 ALI 배양 14일 후에 관찰되지만 발현 수준은 기증자에 따라 크게 다릅니다. 이는 RT-qPCR에 의한 TP63, FOXJ1, MUC5AC 및 SCGB1A1의 유전자 발현을 평가하거나 면역 형광(IF) 염색에 의해 p63, α-튜불린, Muc5AC 및 CC-16에 대한 항체를 사용하여 기저, 섬모, 잔 및 클럽 세포에 대한 마커를 각각 검출함으로써 입증됩니다25,26. 그러나 대부분의 실험에서는 14-21일이 경험 법칙으로 간주될 수 있는 반면, 일부 실험의 경우 생체 이물 대사, SARS-CoV-2 감염 및 점액섬모 청소율평가 27,28,29.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig04.jpg"> 그림 4: 공기-액체 계면(ALI) 배양. PBEC는 분리 및 확장되었으며 잘 분화된 ALI-PBEC 배양이 확립되었습니다. ALI-PBEC 배양은 ALI 후 14일 동안 모니터링되었습니다. 세포 배양은 ALI 후 0일, 7일 및 14일에 RNA 분리를 위해 용해되었습니다. 두 명의 서로 다른 기증자의 데이터가 표시되며, 각 점은 시간이 지남에 따라 모니터링되는 한 명의 개별 기증자를 나타내며 중앙값은 가로 막대로 표시됩니다. 기저, 섬모, 잔 및 클럽 세포 마커 (각각 TP63, FOXJ1, MUC5B 및 SCGB1A1)의 유전자 발현을 qPCR에 의해 측정하고, RPL13A 및 ATP5B 유전자 발현에 대해 표준화하였다 (상세한 내용은 참고문헌 23 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig05.jpg"> 그림 5: 레티노산(RA)과 그 합성 유사체 EC 23의 비교. PBEC는 분리 및 확장되었으며 잘 분화된 ALI-PBEC 배양이 확립되었습니다. PBEC 배양물의 공기 노출 개시시, RA (50 nM)를 다양한 농도의 EC23으로 대체하였다. (A) ALI 후 14일째에 전기 저항을 측정하고 이어서 TEER을 계산했습니다(Ω·cm2), n=2 공여자, 막대는 평균값을 SD± 나타냅니다. (B) ALI 후 14일째에 qPCR을 사용하여 각각 섬모 세포 및 배 세포(FOXJ1, MUC5AC)에 대한 세포 마커의 RNA 분리 및 후속 유전자 발현 분석을 위해 세포 배양을 용해했습니다. RPL13A(n = 3명의 기증자)에 대해 정규화되었습니다. 50 nM RA로 배양된 ALI-PBEC에 대해 배수 증가가 나타나고 SD± 평균값으로 표시됩니다. (자세한 내용은 참고 문헌 23 참조) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
지난 몇 년 동안 배지 및 배양 플라스틱과 같은 배양 시스템에서 대체 제품의 성능이 조사되었습니다. 이러한 평가에는 제조업체의 매체 구성 변경, 도입된 새로운 미디어, COVID-19 대유행(2020-2022) 동안의 제품 부족 등 다양한 이유가 있었습니다. 최종 세포 조성은 상당히 다를 수 있지만(그림 6A) TEER의 차이는 덜 두드러지지만(그림 6B) 상피 세포 유형의 마커 평가를 기반으로 서로 다른 공급업체의 유사한 제품이 분화된 상피 세포 배양을 초래하는 것으로 관찰되었습니다. 반면에, 상이한 공급 업체의 배지는 세포 조성에 상당한 차이를 가져 왔습니다. 다른 브랜드의 인서트를 사용할 때 이러한 차이는 제한적이었습니다 (그림 6C). 특히, STEMCELL Technologies의 기도 상피 세포 배양 배지 PneumaCult를 사용할 때, 다른 형태와 가시적인 섬모 활성의 보다 빠른 형성이 관찰되었습니다. 이러한 관찰 외에도 cBD 배지와 비교하여 ALI-PBEC의 TEER 값 차이 및 세포 조성의 차이도 주목되었습니다(그림 6D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65102/65102fig06.jpg"> 그림 6: 상피 세포 배지와 세포 배양 삽입물의 다양한 공급업체 비교. PBEC는 분리, 확장되었으며 잘 분화된 ALI-PBEC 배양이 확립되었습니다. (A) ALI-PBECs를 14일 동안 배양한 후 RNA 분리를 위해 세포층을 용해시켰다. 기저, 섬모, 잔 및 클럽 세포 마커 (각각 TP63, FOXJ1, MUC5AC 및 SCGB1A1)의 유전자 발현을 qPCR에 의해 측정하고, RPL13A 및 ATP5B에 대해 표준화하였다. n = 2 명의 기증자; 막대는 평균값 ± SD를 나타냅니다. (B) ALI 후 9일 동안 전기 저항을 측정한 후 TEER을 계산했습니다(Ω·cm2). n = 3명의 다른 기증자; 평균값은 SD± 표시됩니다. (C) ALI-PBEC를 3개의 다른 공급업체로부터 구입한 세포 배양 삽입물을 사용하여 14일 동안 배양한 다음, RNA 분리를 위해 세포층을 용해했습니다. 섬모, 잔 및 클럽 세포 마커(각각 FOXJ1, MUC5AC 및 SCGB1A1)의 유전자 발현을 qPCR에 의해 측정하고 RPL13A에 대해 표준화했습니다. n = 18개의 상이한 기증자, 막대는 SD± 평균값을 나타낸다. 데이터는 일원 분산 분석 비모수 Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 유의성에 대해 테스트되었으며 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다. (D) ALI-PBEC를 ALI 후 14일 동안 cBD 배지 또는 PneumaCult 배지(STEMMCELL 기술)에서 배양한 다음 RNA 분리를 위해 세포층을 용해했습니다. 기저세포, 섬모세포, 잔세포, 클럽세포 마커(각각 TP63, FOXJ1, MUC5B, SCGB1A1)의 유전자 발현을 qPCR로 측정하고 RPL13A 에 대해 정규화하고(막대는 SD± 평균값을 나타냄), ALI 후 5일과 12일에 전기 저항을 측정하고 TEER(Ω·cm2)을 계산하는 데 사용했습니다. n = 2; 평균값은 SD± 표시됩니다(자세한 내용은 참조 23 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/65102fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 프로토콜에 사용된 솔루션 및 매체의 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65102/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

The airway epithelial cell layer forms the first barrier between lung tissue and the outside environment and is thereby constantly exposed to inhaled ...

이 프로토콜은 건강 및 질병에서 기도 상피 세포의 기능 및 역할과 관련된 다양한 연구 질문을 해결하는 데 사용할 수 있는 강력하고 비용 효율적인 방법을 위한 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 점액 생성 및 섬모 활동을 포함하여 인간 상피 세포층을 잘 나타내는 세포층을 생성한다는 것입니다. 이 기술은 다재다능하며 질병 관련 모욕이나 치료법을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.시작하려면 10cm 페트리 접시에 10 밀리리터의 멸균 PBS로 인간 폐 조직에서 분리 된 기관지 고리를 헹굽니다. 핀셋으로 링을 잡은 상태에서 작은 가위를 사용하여 과도한 결합 조직과 혈액 잔여물을 제거합니다. 고리를 두 개로 자르고, 밀폐 된 멸균 용기에 Primocin을 함유 한 HBSS에 미리 데운 Protease 14 용액 10 밀리리터에 2 개의 반쪽을 담근다.기관지 고리 조각을 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양합니다. 배양 후, 조각을 10 밀리리터의 따뜻한 PBS가 들어있는 페트리 접시에 옮기고, 구부러진 핀셋을 사용하여 고리 내부를 긁어 세포 용액을 얻는다. 반지를 버리십시오.세포 용액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고, 따뜻한 PBS를 첨가하여 50 밀리리터의 최종 부피를 얻는다. 세포 용액을 원심분리하고, 펠릿을 10 밀리리터의 따뜻한 PBS에 재현탁시키기 전에 상청액을 흡인한다. PBS로 부피를 50 밀리리터로 만들고 원심 분리를 반복하십시오.Primocin이 함유된 따뜻하고 완전한 KSFM에 펠릿을 다시 현탁합니다. 다음으로, 6-웰 플레이트로부터의 코팅 용액을 웰 당 2 밀리리터의 세포 현탁액으로 교체한다. 세포가 80 내지 90% 밀도에 도달할 때까지 성장하도록 하고, PBECs의 동결보존을 위해, 웰로부터 배지를 흡인하고, 웰 당 2밀리리터의 따뜻한 PBS로 세포를 한번 세척한다.웰 당 500 마이크로 리터의 부드러운 트립신을 첨가하여 세포를 트립신 화하고 섭씨 37도에서 5-10 분 동안 배양합니다. 트립신 용액을 소용돌이 치고 플레이트를 부드럽게 두드려 세포를 방출합니다. 분리된 세포를 대두 트립신 억제제가 들어 있는 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다.현탁액을 원심분리하고, 펠릿을 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 KSFM 10밀리리터에 재현탁하기 전에 상청액을 버린다. 자동화 된 세포 계수기에서 세포를 세고 동결 배지에서 밀리리터 당 400, 000 세포의 농도로 세포를 다시 현탁시키고,이 현탁액 1 밀리리터를 극저온 혼합물에 첨가한다. 바이알을 차가운 세포 용기에 옮기고 섭씨 영하 80도에 놓습니다.24시간 후 바이알을 섭씨 영하 196도의 액체 질소로 옮겨 장기간 보관합니다. T75 세포 배양 플라스크를 코팅하기 위해, PBS에 10 밀리리터의 코팅 용액을 첨가하고, 플라스크를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 인큐베이터에 넣기 전에 뚜껑을 단단히 닫는다. 다음날, 플라스크의 코팅 용액을 10 밀리리터의 완전한 KSFM으로 교체하십시오.인큐베이터에 공기가 들어오도록 뚜껑을 약간 연 상태에서 인큐베이터에서 배지를 섭씨 37도까지 데우십시오. 냉동보존된 PBEC를 섭씨 37도의 비드 수조에서 빠르게 해동합니다. 예열된 T75 플라스크에 극저온 내용물에 전체 내용물을 넣고 세포를 고르게 분배합니다.세포가 단단히 부착되었는지 확인한 후 배지를 신선하고 따뜻한 완전한 KSFM 10ml로 교체하고 80-90% 밀도에 도달할 때까지 성장시킵니다. 삽입물당 400마이크로리터의 코팅 용액을 첨가하여 세포 배양 삽입물을 코팅하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 2밀리리터의 부드러운 트립신을 첨가하여 플라스크에서 PBEC를 트립신화하고 5-10분 동안 배양합니다.플라스크를 소용돌이 치고 부드럽게 두드려 세포 분리를 촉진합니다. 다음으로, 4 밀리리터의 대두 트립신 억제제를 플라스크에 첨가하고, 세포 현탁액을 25 밀리리터 튜브로 옮긴다. 현탁액을 원심 분리하고 6 밀리리터의 완전한 BD 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.자동 세포 계수기에서 세포 수를 세십시오. 코팅 후 인서트에서 코팅 용액을 제거합니다. 1 나노몰 EC 23으로 보충 된 완전한 BD 배지로 세포 현탁액을 희석하고 삽입물의 멤브레인 상단에 500 마이크로 리터를 첨가한다.1.5밀리리터의 완전한 BD 매체를 삽입물 아래의 웰에 추가합니다. 세포가 공기-액체 계면(ALI)으로 옮길 준비가 되면 삽입물과 웰에서 배지를 제거하고 50나노몰 EC 23이 보충된 새로운 완전한 BD 배지를 웰에만 추가합니다. 일주일에 세 번 우물의 배지를 교체하십시오.과도한 점액과 세포 파편을 제거하려면 삽입물 내부 세포층의 정점 쪽에 따뜻한 PBS 200마이크로리터를 부드럽게 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후, 과잉 점액 및 세포 파편을 함유하는 PBS를 흡인한다. TEER은 ALI PBEC 배양의 품질을 평가하기 위해 측정되었습니다.7 일 후, 300 옴보다 높은 세포층의 전기 저항은 성공적인 배양으로 간주됩니다. 또한, 공여체 간 전기 저항의 가변성은 공기-액체 계면에서 배양 7일째와 14일째 사이에 시간에 따라 감소하고, 사용된 DMEM의 기원에 의해 현저하게 영향을 받는다. ALI 배양 14일째 기저세포, 섬모세포, 잔세포, 곤봉세포와 같은 모든 주요 세포 유형을 관찰했으며, 발현 수준은 기증자에 따라 다름없었다.시험된 EC 23의 상이한 농도 중에서, 최대 TEER는 50 나노몰에서 관찰되었다. 레티노산과 그 합성 유사체인 EC 23을 비교하면 섬모 세포와 배 세포에 대한 마커의 유전자 발현이 50나노몰 EC 23과 레티노산 사이에서 유사하다는 것이 확인되었습니다. 다른 공급자의 배지를 사용하면 세포 구성에 상당한 차이가 있는 반면 TEER의 차이는 덜 두드러졌습니다.반면에, 상이한 공급 업체로부터의 삽입물을 사용하는 것은 세포 분해에 실질적인 차이를 초래하지 않았다. 또한, 완전한 BD 배지와 비교하여 ALI PBEC와 PneumaCult 배지의 TEER 값 및 세포 구성의 차이도 관찰되었습니다. 세포가 ALI로 옮길 준비가되면 EC 23 농도를 높입니다.또한, 해동 후 세포를 원심분리하지 말고, SBTI를 첨가한 후 세포 배양 플라스틱으로부터 세포를 신속하게 제거한다. 이 프로토콜에 제공된 방식으로 기도 상피 세포의 배양을 사용하여 다양한 분석 방법을 사용하여 이를 추적하여 예를 들어 기도 상피 세포의 기능, 유전자 발현, 매개체 생산을 관찰할 수 있으며, 따라서 예를 들어 담배 연기에 대한 노출의 결과에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 세포 배양 프로토콜의 다음 단계는 면역 세포 또는 혈관 세포와 같은 추가 세포 유형의 통합이며, 이는 조직 표현을 증가시키는 데 도움이 될 것입니다.

isolating-bronchial-epithelial-cells-from-resected-lung-tissue-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리가 공기 - 액체 인터페이스에서 차별화된 성장을 포함한 인간 기관지기도 조직의 explants에서 기본 인간 기관지 상피 세포의 성장에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 이 방법은 인간의 폐 건강과 질병의기도 상피의 역할을 조사하는 주요 세포의 풍부한 소스를 제공합니다.

Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

이 비디오는 감염된 세기관지 조직에서 박테리아 생물막의 생체 외 돼지 폐 모델을 개발하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 생물막은 표면에 부착된 매트릭스에 내장된 박테리아 응집체입니다. 이 모델은 생물막 형성의 여러 단계에서 박테리아의 항생제 감수성을 연구하는 데 사용됩니다.

생물막의 생체 외 돼지 폐 모델: 돼지 기관지 조직의 박테리아 생물막을 연구하기 위한 폐 모델을 개발하는 기술

이 문서는 실험 조건에서 소 폐 기관지 내시경 기술, 즉 bronchoscopically 안내 접종, 기관지 세척액, 기관지 솔질하고, 기관지 폐 생검을 설명합니다.

생물 의학 연구에 소 폐 : 시각적으로 유도 기관지, Intrabronchial 접종 및<em&gt; 생체</em&gt; 샘플링 기법

여기, 우리는 생물 학적 및 생물 의학 연구에 모델 인간의 폐 질병에 3D 폐 조직 문화를 생성 하는 데 적합 한 절제 환자 조직에서 인간의 정밀 컷 폐 agarose 가득 조각의 준비에 대 한 프로토콜 제시.

질병 모델링에 대 한 인간의 3D 폐 조직 문화 (3D-Ltc)의 생성

설명된 세포 배양 및 생체 내 기관지 모델의 세포 배양 및 노출 방법은 독성 검사를 위한 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 것이다.

독성 테스트를 위해 공기 중 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 공기 액체 인터페이스 기관지 상피 모델

이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

생체 공학 기도 조직 생성을 위한 영상 유도 생물반응기

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

공기-액체 계면 배양은 일반적으로 폐기도의 정점 쪽을 모방하는 1차 정상 인간 기관지 상피 세포를 분화하여 가성층화 기도 상피를 개발하는 데 사용됩니다. 여기에서는 섬모 기능 및 막 무결성과 같은 생물물리학적 특성을 모니터링하여 품질을 결정하기 위한 쉬운 프로토콜에 대해 설명합니다.

Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway epithelium(가성층화된 폐 기도 상피의 섬모 기능 및 막 불투과성 측정)

이 논문에서는 공기-액체 계면 배양에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 폐 상피, 중간엽, 내피 세포 및 대식세포로 구성된 복잡한 다세포 기도 장벽 모델의 생성에 대해 설명합니다.

폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

배우세요 기관지 상피 세포 분리 및 공기-액체 계면 배양법을 통해 호흡기 건강 연구를 수행하는 방법입니다. 이 기술은 인간 폐 조직에서 PBEC를 분리하여 장기 보관 및 분화가 가능하며 질병 메커니즘과 치료 반응을 탐구하는 데 활용됩니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

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