Name: 다중 웰 미세전극 어레이에서 Human In Vitro Neural Cultures의 집속 초음파 신경 조절 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: 학습하세요 집속 초음파 신경 조절 기법을 HiPSC 유래 신경 세포에 적용하여 최적 자극 파라미터를 결정하는 방법을. 다중 웰 미세전극 어레이를 활용한 이 비침습적 기술은 파킨슨병 등 신경계 질환 치료에 활용됩니다.

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아미르 만바치(Amir Manbachi)와 니티쉬 타코르(Nitish Thakor)는 국방고등연구계획국(DAR N660012024075 PA)의 자금 지원을 인정합니다. 또한 Amir Manbachi는 미국 국립보건원(NIH)의 NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)에서 관리하는 Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research(ICTR)의 Clinical Research Scholars Program(KL2)의 자금 지원을 인정합니다. Nitish Thakor는 미국 국립보건원(NIH)의 자금 지원을 인정합니다: R01 HL139158-01A1 및 R01 HL071568-15.

1. 재료 준비
<ol><li>배양 배지를 흡인하고 이를 사용하여 MEA가 내장된 24웰 뉴런 배양 플레이트의 단일 웰을 채웁니다(그림 2A). Taga et al.13에 의해 발표된 프로토콜에 따라 뉴런을 배양하고 유도합니다.</li>
	<li>파라필름 계면, 고무 밴드 및 FUS 콘을 70% 에탄올을 사용하여 고무 멤브레인으로 10분 동안 멸균하고 나중에 조립할 수 있도록 흄 후드에 넣습니다.</li>
	<li>탈이온수 300mL와 커플링 젤 50mL를 탈기합니다. 물과 겔을 160 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 커플링 매체 내에서 캐비테이션이 발생하지 않도록 합니다. 참고: HiPSC의 원래 공급원은 GM01582 및 CIPS 세포주에서 채취한 것입니다. 평균적으로, 웰 당 5 x 104 운동 뉴런 및 2.5 x 104 성상교세포의 밀도를 달성할 수 있다14.</li>
</ol>2. 주변 장치의 연결 및 설정
<ol><li>나사를 사용하여 FUS 콘을 변환기에 고정하고 통풍이 잘되는 멸균 후드에 유연한 고무 멤브레인으로 콘을 밀봉합니다. 1.3단계의 탈기 및 탈이온수(DG-DI)로 콘을 채우고 캐비테이션을 방지하기 위해 콘에 기포가 없는지 확인합니다.</li>
	<li>맞춤형 나사산 막대를 사용하여 3D 프린팅 홀더를 프레임에 고정합니다(그림 2B). FUS 변환기의 헤드가 자극될 웰 위에 오도록 프레임을 배치합니다.</li>
	<li>고무 밴드를 사용하여 배지와 HiPSC가 들어 있는 24웰 MEA 플레이트의 웰 위에 파라필름을 고정합니다.</li>
	<li>초음파 변환기의 백엔드 드라이버 전자 장치(이 경우 변환기 전원 출력(TPO; 그림 3A), 100-240V 전원 콘센트(그림 3B, 연결 6)에 연결하고 일치하는 네트워크를 TPO 및 FUS 변환기에 연결합니다(각각 그림 3B, 연결 1 및 연결 2). 매칭 네트워크는 트랜스듀서와 TPO 간의 효율적인 전기 결합을 보장합니다.</li>
	<li>MEA 시스템을 전원 콘센트(100-240V)에 연결합니다(그림 3B, 연결 5). MEA 시스템 동기화 포트를 TPO에 연결합니다(그림 3B, 연결 3). 이 연결은 MEA 시스템에 의한 데이터 수집을 FUS 자극과 동기화합니다.</li>
	<li>24웰 MEA 플레이트를 MEA 시스템에 놓고 뚜껑을 제거하여 변환기와 웰이 직접 접촉할 수 있도록 합니다. 3.2단계(그림 3A 및 그림 2B)에 설명된 대로 탈기된 커플링 겔을 위한 공간을 확보하기 위해 변환기를 웰 플레이트 위에 5-10mm 놓습니다.</li>
</ol>3. 자극 및 신경 신호 수집
<ol><li>TPO 제어판에서 FUS 매개변수를 설정합니다(표 1).</li>
	<li>파라필름 위에 커플링 젤을 바르고 FUS 변환기를 커플링 젤 안으로 내려 최소한의 기포로 겔과 접촉하도록 합니다(그림 2A).</li>
	<li>사용자 인터페이스에서 시작 버튼을 클릭하여 MEA 시스템 기록을 시작합니다.</li>
	<li>TPO의 오른쪽 하단 버튼 (그림 3A, 라벨 7)을 눌러 FUS 초음파 처리를 시작하고 각 초음파 처리 라운드 사이에 최소 5 분을 기다려 뉴런이 기준선 상태로 돌아갈 수 있도록합니다.</li>
	<li>FUS 시스템에서 생성된 트리거 펄스를 사용하여 FUS 자극 시퀀스를 MEA 기록에 맞춥니다(그림 3B, 연결 3).</li>
</ol>4. 데이터 처리 및 분석
<ol><li>USB 연결을 사용하여 MEA 시스템에서 컴퓨터로 데이터를 전송합니다(그림 3B, 연결 4). 실험 설정 패널을 클릭하여 시작합니다. 그런 다음 기록할 데이터 유형을 선택합니다. 이 경우 원시 스파이크를 사용하는 것이 좋습니다. 마지막으로 파일 이름을 지정하고 디스크 드라이브 내에서 원하는 위치를 선택하여 전송을 완료합니다. 참고: 릴리스된 Python 스크립트를 https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod 에서 실행하여 다음 단계를 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>16개의 전극 각각에서 데이터를 읽습니다.</li>
	<li>버터워스 차수가 8이고 대역폭이 5Hz에서 3kHz인 버터워스 대역통과 필터를 적용합니다. 참고: 이러한 값을 최적화하려면 특정 셀의 발사 속도와 관련된 셀 수를 고려하는 것이 중요합니다. 이 2가지 값을 곱하면 실험에서 세포 집단의 전체 발화율을 추정할 수 있습니다.</li>
	<li>σ = 3인 가우스 필터를 적용하여 신호를 평활화합니다. 참고: 과도한 스무딩은 수집 후 데이터 왜곡을 초래할 수 있고 스무딩이 너무 적으면 원치 않는 노이즈가 발생할 수 있으므로 매개변수는 MEA 시스템의 권장 값을 기반으로 최적화할 수 있습니다.</li>
	<li>잠재적 스파이크를 감지하기 위한 임계값을 가우스 평활화 신호의 표준편차의 5배로 설정합니다.</li>
	<li>16개 채널 모두에서 50ms 창에 등록된 스파이크 수를 창 길이(즉, 50ms)로 나누어 발화 속도를 계산합니다. 신호를 따라 창을 다음 프레임으로 이동하고 발사 속도 계산을 반복합니다(보충 그림 1).</li>
	<li>FUS와 관련된 발사 속도의 변화를 기반으로 전송 된 데이터에서 FUS 초음파 처리 시간을 읽어 신호를 분석합니다.</li>
</ol>5. 멀티웰 MEA 플레이트 세척 및 재사용
<ol><li>실험이 완료되면 피펫을 사용하여 전극 표면이 닿지 않도록 주의하면서 멀티웰 플레이트의 웰에서 매체를 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>웰당 2mL의 DG-DI 물을 추가합니다. 흡인하고 한 번 반복하십시오.</li>
	<li>세포와 파편을 제거하려면 효소 세제 Terg-A-Zyme 1g과 멸균 DG-DI 물 10mL(웰당 0.3mL)의 혼합물을 플레이트에 추가합니다. 실온(RT)에서 하룻밤 동안 배양하도록 두십시오.</li>
	<li>다음 날 웰에서 용액을 제거하고 멸균 DG-DI 물 1mL로 헹굽니다.</li>
	<li>멀티웰 플레이트를 5-7분 동안 배양하고 흡인합니다. 이 단계를 5회 반복합니다.</li>
	<li>웰당 0.5mL의 멸균수 DG-DI를 추가합니다. 세척된 멀티웰 플레이트의 기준선을 기록하여 MEA 플레이트가 깨끗한지 확인합니다. 청소된 플레이트는 낮은 강도 값을 가진 가우스 노이즈 패턴을 나타내야 합니다.</li>
	<li>세척된 멀티 웰 플레이트는 다시 사용할 준비가 될 때까지 4°C에서 보관하십시오. MEA가 저장된 물을 한 달에 한 번 이상 교체하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다. 아미르 만바치(Amir Manbachi)는 BK Medical(GE Healthcare) 및 Neurosonics Medical에서 강의와 컨설팅을 담당하고 있으며, 특허 출원 중인 다수의 FUS 기술을 발명한 사람입니다. 베티 타일러(Betty Tyler)는 미국 국립보건원(NIH)으로부터 연구 자금을 지원받고 있으며, 액셀러레이팅 조합 요법(Accelerating Combination Therapies)의 공동 소유주입니다(지분 또는 옵션 포함). Ashvattha Therapeutics Inc.는 그녀의 특허 중 하나에 라이선스를 부여했으며 그녀는 Peabody Pharmaceuticals의 주주입니다.

이 원고는 FUS 신경 조절 중 HiPSC의 신경 활동을 기록하는 데 사용할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 FUS 변환기 및 MEA 시스템으로 일반화할 수 있습니다. 설명된 프로토콜로 관찰된 결과를 복제하기 위해 연구원은 변환기의 초점이 MEA 웰의 바닥 면적보다 큰지 확인해야 합니다. 또한 서로 다른 신경 세포주를 사용하는 경우 필터 파라미터를 웰 내 세포에 대한 예상 주파수 응답에 맞게 조정해야 합니다. 대표적인 결과를 얻을 수 없는 경우 앞서 언급한 매개변수(예: 버스트 길이, 강도, 듀티 사이클 등)를 수정하는 것을 고려해야 합니다.
이 연구는 FUS 자극 후 발화율의 증가를 보여주었지만 결론을 내리기 전에 이 발견의 반복성을 입증하기 위해 더 많은 데이터를 수집해야 합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 직접 미세 전극 전류 신호 기록에서 비롯된 약점이 있는 MEA 시스템의 한계를 계승합니다. 뉴런과의 직접 접촉은 더 나은 감도를 제공하지만 세포를 변화시키고 측정 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, 우물의 크기가 작기 때문에, 우리 몸에는 신경 조절에 중요한 역할을 할 수 있는 말초 조직이 포함되어 있지 않다17. 이는 이 설정으로부터 도출된 결론의 적용 가능성을 생체 내 환경에 제한할 수 있다. 보다 복잡한 네트워크 응답을 연구하기 위해서는, 더 높은 채널 밀도의 MEA 시스템이 그 감도를 향상시키도록 설계되어야 한다18. 이 제안된 시스템에 대한 몇 가지 미래 방향이 확인되었는데, 여기에는 3D 갠트리를 사용하여 트랜스듀서를 고정하고 정확한 배치(19)를 보장하는 것이 포함된다. 개별 뉴런을 분류하기 위해 스파이킹 정렬 알고리즘(20 )을 이용하는 것을 포함하여, 후처리 알고리즘에 관한 추가적인 개선이 이루어질 수 있다. 이 과정은 FUS의 메커니즘에 대한 향후 연구에서 다중 단위 뉴런의 반응을 푸는 데 도움이 될 것입니다. 가장 중요한 것은 근본적인 메커니즘을 설명하기 위해 화학적, 전기적, 광학적 자극과 같은 추가 자극 방식을 통합하는 것이 필수적이라는 것입니다. 이러한 방법들은 특이적인 이온 채널(15 )을 억제하거나 막 특성(21)을 변형시킴으로써 뉴런의 특성 및 거동을 변화시킬 수 있다. 가설화된 신호 전달 경로 내에서 주요 인자를 조절함으로써 연구자들은 통제된 환경에서 각 인자의 기여도를 식별하고 궁극적으로 복잡한 상호 작용에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다.
전기 자극22 은 신경 조절을 위한 가장 확립된 기술 중 하나이며, 임상 및 연구 환경에서 성공적인 응용의 오랜 역사를 가지고 있습니다. 대조적으로, FUS와 광유전학(optogenetics)23 은 최근 몇 년 동안 주목을 받고 있는 비교적 새로운 양식이다. FUS의 주요 장점은 전기 자극 및 광유전학을 포함한 다른 기술로는 도달하기 어려울 수 있는 깊이에서 뉴런을 자극하는 비침습성과 능력입니다. 그러나 광유전학24와 마찬가지로 FUS는 파동 전파 및 관련 신경 반응 모델링과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 생체 내에서 조직의 이질적인 음향 특성의 복잡성을 포착하는 것은 어려울 수 있으며, 이는 압력장과 결과적으로 신경 반응의 불확실성으로 이어질 수 있습니다. 이러한 특성을 정확하게 모델링하는 데 어려움이 있기 때문에 특정 실제 응용 분야에 맞게 기술을 최적화할 때 어려움이 있습니다. 내재된 복잡성은 제어된 음향 강도 조건에서 반응을 직접 연구할 수 있도록 하기 때문에 이 연구에서 본 연구와 같은 체외 시스템의 중요성을 강조합니다.
결론적으로, 이 시스템은 인간 뉴런에 대한 FUS의 신경 조절 효과를 연구하기 위한 고처리량 체외 플랫폼을 제공합니다. 이 시스템을 사용하면 통제된 환경에서 다양한 수준과 유형의 자극에 노출될 때 인간 뉴런의 전기 반응을 측정하여 FUS의 작용 메커니즘을 탐색할 수 있습니다. 따라서 현장에서 일반적으로 사용되는 인간 및 동물 모델에 귀중한 보조 도구를 제공합니다.

집속 초음파(FUS)는 밀리미터 미만의 분해능 1,2,3으로 센티미터 수준의 깊이에서 비침습적 자극을 가능하게 하는 유망한 신경 조절 방식입니다. 이러한 장점에도 불구하고 FUS의 임상적 영향은 제한적인데, 이는 부분적으로 작용 메커니즘에 대한 지식이 부족하기 때문입니다. 탄탄한 이론적 토대가 없으면 연구자와 임상의는 다양한 조건에서 개별 환자의 특정 요구를 충족시키기 위해 치료법을 조정하는 데 어려움을 겪습니다. Yoo et al.[4]이 제안한 저명한 이론은 기계감응성 이온 채널이 뉴런 활성화를 담당한다는 것을 시사합니다. 그러나 이 이론은 이러한 채널이 없는 인간 뇌 뉴런의 FUS 활성화를 설명하지 못한다5. 이러한 모호성은 치료 결과를 최적화하기 위한 FUS 매개변수의 조정을 배제하기 때문에 클리닉에서 FUS의 활용을 제한합니다.
이전의 관련 연구에서는 FUS를 뒷받침하는 생리학적 메커니즘을 조사하고 최적의 자극 매개변수를 결정하기 위해 다양한 접근 방식을 사용했습니다. 이 과정에서 중요한 단계는 피드백으로서의 뉴런 반응을 모니터링하는 것인데, 이는 칼슘이온 영상4, 광학 영상1 및 생체 외 전기생리학적 기록(예: 근전도6 또는 피부-신경 전기생리학7)과 같은 이온게이트 모니터링과 관련된 방법을 통해 달성할 수 있다. 그러나 이러한 연구의 대부분은 인간이 아닌 뉴런 또는 생체 내 접근 방식을 사용하며, 이는 차선의 제어로 인해 추가 분산을 유발할 수 있습니다. 대조적으로, 전극을 사용하여 체외 인간 유도 만능 줄기 세포(HiPSC) 뉴런에서 신경 신호를 측정하면 더 민감한 측정과 실험 환경에 대한 더 큰 제어가 가능합니다. 이 연구에서는 그림 1과 같이 FUS 자극 후 HiPSC 뉴런의 전기적 반응을 측정하기 위해 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 체외 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 지역 사회의 연구자들이 초음파 매개변수(예: 주파수, 파열 길이, 강도)를 변경할 때 신경 반응을 모니터링할 수 있도록 합니다. 또한 이 시스템은 물리적 자극(예: 온도, 압력 및 캐비테이션)8,9에 대한 신경 민감도를 높은 수준으로 제어할 수 있으며, 이는 뉴런의 이온 채널 기능을 유전적 및 약학적으로 조작할 수 있기 때문입니다(예: 가돌리늄을 사용하여 이온 채널을 억제함)10,11,12. 이 분자 수준 제어는 FUS의 신경 조절 효과 뒤에 있는 메커니즘을 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MEA 시스템</td><td>Axion Biosystem Inc.</td><td>Maestro 에지</td><td>샘플링 속도: 11500Hz</td></tr><tr><td>MEA 플레이트</td><td>Axion Biosystem Inc.</td><td>CytoView MEA</td><td>전극 및 웰: 24웰에 있는 16개의 전극웰</td></tr><tr><td>플레이트 인터페이스</td><td>Amcor Inc.</td><td>파라필름 PM996; P7793</td><td>두께: 127 & 마이크로; m</td></tr><tr><td>CO2 배양용 탱크 및 레귤레이터</td><td>AirGas Inc./ Harris Inc.</td><td>9296NC</td><td>농도: 5%</td></tr> <tr><td>배양 배지</td><td>ThermoFisher Inc.</td><td>라미닌; 23017-015</td><td>농도 : 1 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>HiPSC 뉴런</td><td>Peprotech</td><td>CIPS 및 GM01582 파생; 450-10</td><td>농도: 10ng/mL(Taga et al [2021]13)</td></tr><tr><td>Transducer</td><td>Sonic Concepts Inc.</td> 참조<td>CTX250; 008</td><td>중심 주파수: 250kHz</td></tr><tr><td>정합 네트워크</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>CTX250; NFS102v2</td><td>임피던스: 50 & 오메가;</td></tr><tr><td>트랜스듀서 전력 출력 (TPO)</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>버전 4.1; 020</td><td>주파수: 250kHz에서 2.5MHz까지</td></tr><tr><td>멤브레인</td><td>McMaster Inc.</td><td>실리콘 고무; 5542N115</td><td>두께: 0.0127cm</td></tr><tr><td>커플 링 젤</td><td>Parker Laboratory Inc.</td><td>아쿠아소닉 100; B08DDWG GXB</td><td>점도: 130,000&ndash; 185,000 경찰</td></tr><tr><td>프로브 홀더</td><td>McMaster Inc.</td>에 연결<td>스틸 스레드 로드; 90322A661</td><td>길이: 1&ndash; 1/2" 긴</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>ThermoFisher Inc.</td><td>Sorvall Legend X1R; 75004261</td><td>최대 가속: 10&ndash; 25,830 x g</td></tr><tr><td>수중청음기</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>Y-104; 009</td><td>범위: 50 kHz&ndash; 1.9MHz</td></tr><tr><td>물 탱크</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>WT</td><td>크기 : 30cm x 30cm x 30cm</td></tr><tr><td>물 조절 장치</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>WCU; SN006</td><td>유속: 최대 50mL/s</td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>로데슈바르즈</td><td>RTC1002</td><td>샘플링 속도: 최대 50MHz</td></tr><tr><td>Stage</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>MicroStage; 2</td><td>정확도: 1 &마이크로; m</td></tr><tr><td>열 변색 시트</td><td>TIPTEMP Inc.</td><td>액정 시트; TLCSEN337</td><td>범위: 22&ndash; 24 &도; C</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Microsoft Surface</td><td>Surface Pro</td><td>CPU i5 1035G4: 3.7GHz</td></tr><tr><td>데이터 전송 소프트웨어</td><td>Mathworks Inc.</td><td>MATLAB</td><td>버전 2021b</td></tr>, <tr><td>처리 소프트웨어</td><td>, Python Software Foundation</td>, <td>Python</td><td>버전 3.7.10</td></tr></tbody></table>

다중 웰 미세전극 어레이에서 human in vitro neural cultures의 집속 초음파 신경 조절

Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

집속 초음파(FUS)의 신경 조절 효과는 동물 모델에서 입증되었으며 FUS는 인간의 운동 및 정신 장애를 치료하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 그러나 FUS의 성공에도 불구하고 뉴런에 미치는 영향의 기저에 있는 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않아 FUS 매개변수를 조정하여 치료 최적화를 어렵게 만듭니다. 이러한 지식의 격차를 해소하기 위해 인간 유도 만능 줄기세포(HiPSC)에서 배양한 뉴런을 사용하여 체외에서 인간 뉴런을 연구했습니다. HiPSC를 사용하면 생리학적 및 병리학적 상태 모두에서 인간 특이적 신경 행동을 연구할 수 있습니다. 이 보고서는 HiPSC 뉴런에 대한 FUS의 신경 조절 효과를 모니터링하고 정량화할 수 있는 고처리량 시스템을 사용하기 위한 프로토콜을 제시합니다. FUS 매개변수를 변화시키고 제약 및 유전자 변형을 통해 HiPSC 뉴런을 조작함으로써 연구자들은 신경 반응을 평가하고 HiPSC 뉴런에 대한 FUS의 신경 조절 효과를 설명할 수 있습니다. 이 연구는 다양한 신경 및 정신 질환에 대한 안전하고 효과적인 FUS 기반 치료법 개발에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다.

요약하면, HiPSC에서 배양된 뉴런을 사용하여 체외 FUS 신경조절 모니터링을 가능하게 하는 프로토콜을 제시합니다. HiPSC 유도 뉴런을 자극하고 분석을 위해 해당 전기적 반응을 기록하는 전체 시스템 플랫폼은 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 연구는 그림 2와 같이 뉴런의 FUS 자극과 MEA 시스템의 전기 반응 기록에 중점을 둡니다. FUS 및 MEA 시스템의 주변 장치 구성 요소와 해당 연결은 그림 3에 나와 있습니다.
초점의 특성 분석은 우물 바닥이 FUS 초점으로 완전히 덮이도록 신경 실험 전에 수행됩니다. 그림 4와 같이 열변색 시트의 초점 시각화는 FUS 시스템을 평가하기 위해 수행되어야 합니다. 초점 특성화 후 필터링, 임계값 설정 및 발화 속도 계산을 포함한 후처리 단계를 수행해야 하며, 이는 그림 5 및 그림 6에 요약되어 있습니다. 이러한 단계는 환경에서 노이즈를 필터링하여 유용한 신호를 검색하고, FUS로 인한 신경 활동 변화에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다. 그림 6A-B의 래스터 플롯은 각 채널에서 감지된 스파이크를 보여줍니다. 웰의 전체 바닥이 FUS 변환기의 초점 내에 있기 때문에 FUS가 모든 전극에서 발사 속도를 변경해야 할 것으로 예상됩니다. 이러한 발화 속도의 변화는 그림 6C에 표시된 발화 속도 플롯에서 시각화되며, 이는 선택된 자극 매개변수가 뉴런 발화 속도의 증가를 초래했음을 보여줍니다. 구체적으로, FUS 전(즉, 기준선) 발화율은 140Hz ± 116.7Hz인 반면, FUS 후 발화율은 연속파 FUS± 786Hz 419.4Hz였습니다. 또한 그림 6C는 FUS 파라미터를 변경하면(예: 연속파 대신 펄스파 FUS 사용) 발화 속도의 변화 크기를 변경할 수 있을 뿐만 아니라 뉴런이 기준 상태로 돌아가기 전의 시간을 변경할 수 있는 방법을 보여줍니다. 저강도 집속 초음파(LIFU)는 특히 열 병변을 달성하려는 고강도 집속 초음파와 비교할 때 배양물의 심각한 온난화를 일으키지 않습니다. 임상적으로 영향을 미치는 온도 변화의 부족은 이론적 계산과 시뮬레이션에 의해 뒷받침됩니다(보충 그림 2). 표 1에 나열된 실험 FUS 파라미터의 극단적인 경우에도 약 0.04°C의 최소 온도 증가만 관찰할 수 있습니다.
발화 속도 플롯을 사용하면 FUS의 신경 조절 효과를 정량화할 수 있으며 흥분성 반응과 억제성 반응을 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 멀티웰 MEA 플레이트의 중요한 장점은 다양한 신경 상태 및 자극 매개변수를 고처리량 방식으로 연구하기 위해 여러 번 재사용할 수 있다는 것입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig01.jpg"> 그림 1: 우물 내 뉴런의 집속 초음파(FUS) 신경 조절을 위한 체외 플랫폼 개요와 미세 전극 어레이를 사용한 뉴런 활동 측정. 각 전극(빨간색, 녹색 및 파란색 선)은 단일 웰 내의 뉴런 집단에서 기록합니다. 처리 파이프라인은 원시 신경 전기 기록을 신경 세포 발사 패턴 감지로 변환하기 위해 구현됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig02.jpg"> 그림 2: 다중 웰 미세 전극 어레이(MEA)를 사용한 FUS 신경 조절 . (A) 다중 웰 MEA를 사용한 FUS 신경 조절 설정 개략도. FUS 변환기에 의해 생성된 음파는 탈기된 물로 채워진 FUS 원뿔을 통해 전파되고 초음파 젤을 사용하여 결합됩니다. 파라필름은 오염을 방지하기 위해 고무 밴드를 사용하여 우물에 고정됩니다. MEA 플레이트는 뉴런에서 MEA 시스템으로 전기 기록을 보냅니다. (B) MEA 시스템에 포함된 멀티웰 플레이트의 FUS 변환기 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig03.jpg"> 그림 3: In vitro 플랫폼 설정. (A) in vitro 플랫폼 설정의 전면. 변환기 전원 출력(TPO, 왼쪽)은 FUS 매개변수를 프로그래밍하는 데 사용됩니다. MEA 시스템(오른쪽)은 FUS 변환기에 의해 신경 조절되는 웰 플레이트의 뉴런에서 발생하는 전기 활동을 기록합니다. (B) 매칭 네트워크 (1)에서 TPO로, (2) 변환기로 연결된 시험관 내 플랫폼 설정의 뒷면. (3) MEA 시스템에서 TPO로의 연결은 데이터 수집을 동기화합니다. (4) 데이터 전송을 위해 MEA 시스템에서 컴퓨터로 연결합니다. (5) MEA 시스템에 대한 전원 연결. (6) FUS 시스템에 대한 전원 연결. (7) 초음파 처리 버튼. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig04v2.jpg"> 그림 4: FUS 변환기의 특성화. (A) 진폭 시스템15에 의해 측정된 표 1에 상세히 기술된 FUS 파라미터를 사용하는 초점의 압력 맵. (B) 그림 3에 표시된 실험 설정을 사용하여 우물 바닥에 배치 된 열 변색 시트의 사전 및 사후 초음파 처리. 열 변색 시트는 온도 변화에 따라 색상이 변하여 뉴런 위치에서 성공적인 자극을 시각적으로 검증할 수 있습니다. 30 W / cm2 의 최대 공간 피크 펄스 평균 강도 (ISPPA)와 3 분의 연속 초음파 처리를 조정하여 이러한 초점을 더 잘 시각화하기 위해 국부 온도를 크게 변경했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig04largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig05.jpg"> 그림 5: 처리 파이프라인. 1단계: 원시 전기 기록은 N = 16개 채널에서 캡처됩니다. 이후 단계에서는 채널 16(빨간색 윤곽선)을 사용하는 프로세스를 보여 줍니다. 2단계: 각 채널에 대해 버터워스 대역통과 필터(5Hz-3kHz 대역통과)가 적용된 후 가우스 필터(σ = 3)가 적용됩니다. 임계 값은 초음파 처리 시작을 중심으로하는 2 초 창 내에서 신호의 표준 편차의 5 배로 설정됩니다. 3단계: 임계값보다 높거나 낮은 신호는 스파이크로 특성화됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig06.jpg"> 그림 6: 래스터 및 발사 속도 플롯. (A) 초음파 처리 시간의 함수로 각 채널에서 감지 된 스파이크의 래스터 플롯. FUS 자극 시간은 빨간색 선을 사용하여 주석이 추가됩니다. (B) 비교를 위해 연속 FUS가 있는 다양한 FUS 설정에서 뉴런의 래스터 플롯. (C) 발화 속도는 50ms 슬라이딩 윈도우를 사용하여 계산되었습니다. FUS 신경조절 전후의 평균 발화율은 각각 140Hz와 786Hz였다. 펄스 FUS의 경우 평균 발사 속도는 230Hz 및 540Hz였습니다. 더 짧은 활성화 및 더 적은 비율 변화는 변화 FUS 자극의 이 세트에 의해 유도되는 것으로 관찰되었다. 발사 속도를 계산하는 프로세스는 보충 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>매개 변수</td>
			<td>값</td>
		</tr><tr><td>최대 전력/채널</td>
			<td>1.200 승</td>
		</tr><tr><td>P실제</td>
			<td>0.749W/채널.</td>
		</tr><tr><td>나는SPPA</td>
			<td>10.79 W/센티미터 2</td>
		</tr><tr><td>나는SPTA</td>
			<td>0.05 W/센티미터2</td>
		</tr><tr><td>버스트 길이</td>
			<td>0.100밀리초</td>
		</tr><tr><td>빈도</td>
			<td>250.00 킬로헤르츠</td>
		</tr><tr><td>초점</td>
			<td>39.800의 mm</td>
		</tr><tr><td>마침표</td>
			<td>20.000밀리초</td>
		</tr><tr><td>타이머</td>
			<td>60.000 초</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 그림 4에 제시된 연구를 위해 TPO에 설정된 집속 초음파(FUS) 매개변수.
보충 그림 1: 래스터 플롯에서 발사 속도까지의 처리. 1단계: 모든 채널 중 스파이크를 계산하여 주어진 슬라이딩 창 내에서 카운트 번호를 얻습니다. 참고: 여기서는 더 나은 설명을 위해 더 큰 슬라이딩 창(0.1초로 설정)이 선택되었습니다. 2단계: 윈도우 길이당 스파이크를 초당 스파이크로 변환합니다(예: 여기서 개수에 10을 곱하여 헤르츠[Hz]로 변환한 다음 1,000으로 나누어 킬로헤르츠[kHz] 단위의 값을 구함). 3단계: 그 결과로 획득한 발사 속도 곡선. 샘플 데이터와 함께 오픈 소스 도구 키트는 GitHub(https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod)에서 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: LIFU16의 K-wave 시뮬레이션 결과 온도 프로파일. 그림 4에 표시된 음향 강도 맵을 기반으로 K-wave 시뮬레이션 결과는 표 1에 나열된 실험 FUS 매개변수의 극단적인 경우를 사용하여 초점 영역(반경: 2mm)의 중심 영역 내에서 0.04°C의 최대 온도 상승을 시사합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig2.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 인간 유도 만능 줄기 세포(HiPSC) 뉴런에 대한 집속 초음파의 신경 조절 효과를 모니터링하고 정량화할 수 있는 고처리량 시스템을 사용하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

다중 웰 미세전극 어레이에서 Human In Vitro Neural Cultures의 집속 초음파 신경 조절

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and ...

집속 초음파 신경 조절. 이 떠오르는 흥미로운 분야는 집속 초음파 분야에서 진행 중인 연구의 주제이며, 특정 응용 분야에 대한 최적의 자극 매개변수는 종종 알려져 있지 않습니다. 이 연구는 뉴런에 대한 경험적 in vitro 테스트를 통해 이러한 매개변수를 체계적으로 결정하는 것을 목표로 합니다.이 방법은 연구자가 유전자 및 약학적으로 변형된 뉴런의 반응을 분석할 수 있도록 하여 소리 신경 조절의 초점의 근간이 되는 신경 메커니즘을 탐구할 수 있습니다. 배양 배지를 흡인하여 24웰 뉴런 배양 플레이트에서 단일 웰을 채우고, 마이크로 전극 어레이 또는 MEA를 내장합니다. 300ml의 탈기 및 탈이온수를 준비한 후 집속 초음파 또는 FUS 변환기 콘에 조심스럽게 채웁니다.맞춤형 나사산 막대를 사용하여 3D 프린팅 홀더를 프레임에 고정합니다. FUS 변환기의 헤드가 자극될 웰 위에 오도록 프레임을 배치합니다. 고무 밴드를 사용하여 배지 및 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 HIPSC가 포함된 24웰 MEA 플레이트의 웰 위에 파라폼을 고정합니다.변환기 전원 출력 또는 TPO 제어판에서 FUS 매개변수를 설정합니다. 다양한 매개변수의 값이 화면에 언급됩니다. 다음으로, 웰 위의 파라폼 위에 커플링 젤을 바르고 FUS 변환기를 커플링 젤 안으로 내려 최소한의 기포로 겔과 접촉하도록 합니다.TPO의 오른쪽 하단 버튼을 눌러 FUS 초음파 처리를 시작하고 각 초음파 처리 사이에 최소 5 분을 기다려 뉴런이 기준 상태로 돌아갈 수 있도록합니다. 연결이 적절하면 FUS 시스템에서 생성된 트리거 펄스가 FUS 자극 시퀀스를 MEA 기록과 자동으로 정렬합니다. FUS와 관련된 발사 속도의 변화를 기반으로 전송 데이터로 FUS 초음파 처리 시간을 읽어 신호를 분석합니다.FUS 초점은 열 색채 시트와 물 수중 청음기 스캐닝을 통해 시각화하여 특성화되었습니다. 필터링, 임계값 설정 및 발화 속도 계산을 포함한 후처리 단계에서는 환경의 노이즈를 필터링하여 FUS로 인한 신경 활동 변화를 드러냈습니다. 래스터 플롯은 각 채널에서 감지된 스파이크를 보여주었습니다.발화율 플롯은 선택된 자극 매개변수가 뉴런 발화율을 증가시킨다는 것을 보여주었습니다. FUS 전 발화율은 140헤르츠인 반면, 연속파 FUS에서 사후 FUS 발화율은 786헤르츠였다. FUS 초음파 처리 모드를 변경하면 뉴런이 기준선 상태로 돌아 오기까지 걸리는 시간도 변경되었습니다.변환기를 파라폼 인터페이스에 배치할 때 기포 형성을 신중하게 최소화하는 것이 중요합니다. 또 다른 고려 사항은 변환기에 전달되는 전력입니다. 전력은 효과를 유도할 수 있을 만큼 충분히 높아야 하지만 변환기 또는 셀 손상을 유발하지 않을 만큼 충분히 낮아야 합니다.이 기술은 파킨슨병 및 기타 신경 장애를 치료하기 위한 최적의 자극 매개변수를 식별하여 돌이킬 수 없는 손상, 긴 회복 및 재활 시간을 포함하여 침습적 수술과 관련된 위험을 제거할 수 있습니다. 임상시험을 포함한 향후 연구에서 안전성을 보장하기 위해 메커니즘을 밝히고 전임상 최적화를 제어하기 위한 추가 노력이 필요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 설정을 돌보는에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공합니다.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

이 비디오는 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 뉴런의 전기생리학적 활성을 기록하는 방법을 보여줍니다. 뉴런-성상세포 공동 배양을 포함하는 멀티웰 MEA의 전기생리학적 활성을 기록하여 네트워크 내 여러 뉴런의 활동 전위를 감지하여 hiPSC가 뉴런으로 성공적으로 분화되는 것을 확인합니다.

마이크로 전극 어레이를 사용한 뉴런 네트워크의 전기생리학적 활성 측정

이 비디오는 MEA(Multielectrode Array)를 사용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리를 측정하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 3D 구 내에서 신경망 역학 및 시냅스 네트워크 버스트 활동을 이해할 수 있습니다.

Multielectrode Arrays를 활용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리학을 측정합니다.

이 비디오는 집속 초음파 변환기를 사용하여 다중 웰 미세 전극 어레이 또는 MEA 시스템에서 배양된 인간 iPSC 유래 뉴런에서 신경 활동의 조절을 유도하는 방법을 보여줍니다.

Microelectrode Array System을 이용한 초음파 유도 신경조절

이 연구에서는 3D 뉴런 배양이 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 모델을 presented. 3D 뉴런이 유리 마이크로비즈로 구성된 골격에 뉴런을 파종하여 네트워크를 구축하고, 그 위에서 뉴런이 자라나 상호 연결된 3D 구조를 형성합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.

Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스

여기서는 HD-MEA를 사용하여 대규모 신경 앙상블, 특히 해마, 후각 전구 회로 및 인간 신경 네트워크의 계산 역학을 탐구합니다. 계산 도구와 결합된 시공간 활동을 캡처하면 신경 앙상블 복잡성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 뇌 기능에 대한 이해를 높여 잠재적으로 신경 장애에 대한 바이오마커 및 치료법을 식별합니다.

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

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동시 집속 초음파 신경 조절 및 광섬유 광도 측정(Free-Moving Mouse)의 기록

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여기에서는 쥐와 생쥐의 고밀도 마이크로 전기 피질 검사(μEcoG) 기록을 위한 수술, 이식 및 기록 방법을 포함한 두 가지 프로토콜을 제시합니다. μECoG 기록은 쥐의 청각 피질에서 층류 다원(laminar polytrode) 기록 또는 쥐의 체성 감각 피질(somatosensory cortex)에서 신경 활동의 광유전학적 조작과 함께 수행됩니다.

설치류의 미세 전기 피질 조영술과 층류 폴리트로드 및 광유전학을 통합하여 피질 처리의 멀티스케일 조사

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다중 웰 미세전극 어레이에서 Human In Vitro Neural Cultures의 집속 초음파 신경 조절

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